7一（11） 唾液腺原基の組織培養
顎下腺原基は以前述べられた方法に変吏を加えて培養した（Morita and Nogawa 1999；Steinberg， Myers et al．2005）。概要を以下に示す。 C57BL／6マウスの胎児
（El 3）から顎下腺原基を摘出した。顎下腺原基をPBSで洗浄した後、1．67mg／m l Dispese（lnvitrogen Corp）を含んだDispersation bufferを用いて37。C、20分間
インキュベートした。PBS内にて唾液腺原基周囲の間葉組織を27ゲージ注射針を用 いて除去し、5個～10個のoleftを有する唾液腺上皮組織を分離した。分離した唾
液腺上皮組織をGrowth FaGtor reduced Matrigel（BD Bioscience Falcon，San Diego， CA）に埋没させ，370C、5％CO2下で5分間インキュベートした。
培養に用いるグリシン調整培地は以前述べられた方法に基づいて、いくつかの変
更を加えて作成された（Morita and Nogawa 1999；Larsen， Hoffman et al．2003；
Steinberg， Myers et al．2005）。具体的には、 DuIbeGGo Modified Eagles’medium
の組成を基本としたグリシン除去培地を作成した。この培地に、100U／ml
peniGiiSin，100μ9加l streptomycinを添加した。グリシン（0酬、0．4 mM、1．O mM、10 mM）は、単独もしくはEGF 20ng／m lと組み合わされて培地に添加された。分 離した唾液腺上皮組織はグリシン調整培地を加えて37。C、 5％CO2下で48時間培養さ れた。培養開始から0時間、18時間、24時間、48時間で分枝形成を観察した。分
枝形成を評価するために18時間、24時間、48時間の唾液腺原基のend budの数を カウントし、48時間のstalkの長さを測定した。それぞれの測定を最低3回行った（Fig． 4d）．
34
アミノ酸 アミノ酸培地［mM］ DMEM培地［mM］
Glycine 0．4 0．4
1－Alanino 0．4
トSerine 0．4 0．4
1－Threonine 0．8 0．8
トCys廿ne 2HCI 0．2 0．2
トMethionino 0．2 0．2
1－Glutamine 4 4
トAsparagine 0．4
1－Glutamate 0．4
トAsp8rate 0．4
トValine 0．8 0．8
トLeucino 0．8 0．8
Hsoleucine 0．8 0．8
1－Phenylalanhe 0．4 0．4
トTymsine 0．4 0．6
1－Tryptophan 0．08 0．1
トLyshe－HCl 0．8 0．8
1－Arginine－HcI 0．4 0．4
トHis廿dono Hcl－H20 0．2 0．2
1→⊃rolino 0．4
Table．8アミノ酸調整培地組成
a
Celts were ptated on type t coltagenin medium containing 50rsFBS．
Cetl Morphology Cell proliferation assay BrdU labeling， FACS
， 号
一M O 24 48 hr 0▲■
Change the amino acid
conditioned－media
申開＿
tO mM Gty， Na， Ser
b
Cel給we霞∋Pla電ed o所ype I oo屹gen in medium containing 5％FBS．Cetl Morphology
tmmunofiuorescent staining
（｝er胴∋a口aIysis
，
Fig．4実験プロトコール
Passage O 1 2 ’ s
Change the amino acid conditionetS－metSia
Amino acid－supplemented media （plus media： 10 mM Gty）
mSGP細胞を用いた唐鋤増殖・細胞分化案 験のプロトコールを示す。
c
Ce肥s》瞬∋「e Pla團on廿給Ushape plate in medium containing
5％FBS． ensulin ELISA
day O 1 2 ’ day7
Arnino acid－supplemented media （ptus media： 10 mM Gly）
［al細胞増殖実験。
96 welt type 1 coilagen coated dish
に80000ellsANellの緬胞濃度でmSGP 細胞を播種する。24時間後にアミノ酸 調整培地に交換し、24時間ごとに細胞 増殖アッセイ、BrdUラベリングを用いて 細胞増殖の評価を行った。
細胞周期は60mm type l oollagen coated dish2．0 x 1 05ce11Sidishの細胞 濃度で播種し、アミノ酸調整培地で一定 時間培養後、FACSを用いて評価した。
Change the amino acid condin’onedmedia
【b］細胞分化実験。60mm type 1 collagen coated dishに2．5x105cell創dishの細 胞濃度でmSGP細胞を播種する。5継代 後、免疫蛍光染色・RT・PCRを用いて分 化の評価を行った。
【cl立体培養による細胞増殖突験。96 well U shape plateに1 ．0 x 103 cellsldiShの
細胞濃度でmSGP細胞を播種する。アミ ノ酸調整培地で7日間堵養後、 ELtSA法 を用いてインスリン護度を測定した。
d
日3Ep醜hel吃l buds
of salivary glands
，
The IVkxphok）gy of Sativary glands， ， ，
回唾液諫原基の組織培養。E13のマウス胎 児から唾液陳原甚を採取し、 t2 weH typel collagen ooated plateでマトリゲル塘養し た。アミノ酸調整培地で48時間堵養し、形 態変化を評価した。
0▲ロ 18
24 48hr
Matrigel outture
36
8．実験結果
8一（1） マウス唾液腺由来前駆細胞の増殖に対する短期間グリシン添 加の影響
細胞増殖に対するグリシンの影響を調べるために、マウス唾液腺由来前駆細胞
（mSGP ce日s）を用いた。 SGP細胞は唾液腺導管上皮由来の組織前駆細胞である。
mSGP細胞はEGFの存在下で未分化能を維持することが可能である（H i satom i，
Okumura et a l． 2004）．
まず、我々はFBSに含まれるアミノ酸の影響を可能な限り除外する目的で、 mSGP
細胞の未分化能を維持しつつ、培養可能な最低限のFBS濃度を検討した。その結果、
未分化マーカーであるCD49f陽性／細胞内ラミニン陽性を維持しつつ培養可能であ る最低限のFBS濃度は5％であった。次に596FBSを含有したコントロール培地で培
養した場合のmSGP細胞の対数増殖期を調べるために、mSGP細胞をコントロール培
地で培養し、細胞数をカウントして、細胞数の変化を検討した
（Ohr－12hr－24hr－48hr一・・72hr－96hr－120hr）。その結果、 mSGP細胞の対数増殖期は72
～96時間であった（Fig．5d）。596FBS添加培地で培養した場合、 mSGP細胞では形態 変化，遺伝子発現の変化を認めなかった（Fig．5a， b， c）。したがって596FBSを添加し
た：コントロール培地を用いて培養したmSGP細胞の細胞数の変化を、対数増殖期で ある72時間で評価することにした。次に、各々のアミノ酸が細胞増殖に及ぼす影響を検討するために、20種類のアミ
ノ酸添加培地を用いてmSGP細胞を48時間培養した。この間のmSGP細胞の細胞形
態と細胞数の変化を目視とModified MT丁assayを用いて24時間ごとに検討した。その結果、グリシン、1一スレオニン、トアスパラギン、1・一フェニルアラニン、1一チ
ロシン、1一リジン、1一一プロリン添加培地を用いて培養した場合、細胞増殖が抑制さ
れた。1一アラニン、1一セリン、トメチオニン、Fグルタミン、1一グルタミン酸、
1一バリン、1一イソロイシン添加培地で培養した場合にはコントロールと比較して変 化を認めなかった。1一システイン、1一アスパラギン酸、1一ロイシン、1一トリプトフ ァン、1一アルギニン、1一一ヒスチジン添加培地で培養した場合、細胞増殖が促進され た（Fig．6）。この結果に基づいて、グリシン、1一アラニン、1一一セリンの3つのアミ
ノ酸について、mSGP細胞の細胞増殖に対する影響を調べた。これらのアミノ酸が細胞増殖に及ぼす影響を調べるために、各々の単一アミノ酸添加培地（＋Gly，＋Aia，
＋Ser）を用いてmSGP細胞を48時間培養し、細胞形態と細胞増殖の変化を調べた。
その結果、グリシン添加培地を用いて培養した場合mSGP細胞の細胞増殖が著しく
抑制された（24hr：＋Glyl．19倍、 control 2．23倍，48hr：÷Gly2．27倍． control 5．67
倍、＊p〈0．OOI，＊＊p＜0．05、 Fig．7a， b）。1一アラニン、1・一セリン添加培地を用いて培養した場合にはコントロールと比較して細胞形態の変化を認めず、細胞数の増加は抑
制されなかった（Fig．7a，b）。細胞増殖に対するグリシンの作用を確認するために、
BrdUアッセイおよびBrdUラベリングを行った。その結果、グリシン添加培地を用
いて培養した場合、24時間後のBrdU陽性細胞数は減少した（＋G l yl 1．9％， contro1
41．19％，＊＊Pく0．05、 Fig．7G，d）。
8一（2）唾液腺由来前駆細胞の増殖に対する短期間グリシン除去の影響
アミノ酸添加実験の結果から、グリシンを減量または除去することにより、細胞増殖が促進されるという可能性が示された。グリシン除去の影響を検討するために、
20種類のアミノ酸をそれぞれ1種類ずつ除去した単一アミノ酸除去培地（δ培地）
を作成した。5％FBSを含んだコントロール培地でmSGP細胞を24時間培養した後、
単一アミノ酸除去培地を用いて48時間培養した。この間のmSGP細胞の細胞形態と
細胞数の変化を目視とModified MTT assayを用いて24時間ごとに調べた。
その結果、グリシン除去培地（δGly）を用いて培養した場合、48時間時のmSGP
細胞の細胞数はコントロールに比較して増加した（48hr：δGly＝3． 89倍、 contro1
3．17倍、＊＊P〈O． 05、Fig．8a，b）。1一システイン（1－Cys）、1一一グルタミン（1－Gln）、1一一
38
グルタミン酸（1－Glu）、1一アスパラギン酸（1 ・一Asp）、1一アルギニン（1－Arg）、1一プロ
リンG－Pro）をそれぞれ除去した培地を用いて培養した場合、48時間時の細胞数の
増加が抑制された（48hr：δCys：0．73倍δGln＝0，87倍，δGlu＝2．29倍δAsp：
2． 33倍，δ Arg：0．97倍，δPro：1．84倍、＊p〈O． OOI、＊＊p〈0．05、 Fig．8b）。また1一
スレオニン（1－Thr）、1一メチオニン（1－Met）、 Fバリン（1－Va l）、1一ロイシン G－Leu），1一イソロイシン（Hle）、1一フェニルアラニン（i－Phe）」一トリプトファン
（1－Trp），1一一リジン（1 一一Lys）、1一ヒスチジン（1－His）をそれぞれ除去した培地を用いて
培養した場合、48時間時の細胞数の増加が抑制された（δ丁hr，＝1．09倍δ Met：1．39 倍，δVa l：2．11倍，δLeu：2．32倍，δIle：2．30倍，δPhe：1． 94倍，δ Trp＝2．27 倍，δLys：1．89倍，δHis：2．52倍＊p＜O． OOI、＊＊p〈0．05、 Fig．8b）。 i一アラニン
（1一一Ala）、1一セリン（1－Ser）、1一アスパラギン（1－Asn）、1一チロシン（1 ・一Tyr）をそれぞ
れ除去した培地を用いて培養した場合、細胞数の増加の程度は変化しなかった。結 果的に、単独除去により細胞数の増加を認めたのは、グリシンのみであった。すべ
ての培地において、この間の細胞形態の大きな変化は認めなかった（Fig．8a）。以
上の結果から、グリシンが細胞増殖に対して特別な作用をもつことが示された。す なわちグリシン除去により細胞増殖が元三し、反対にグリシン添加により細胞増殖が抑制されることが示された。
次に、私はグリシンによる細胞増殖の抑制効果が可逆的な作用であるかどうかを
調べるために、グリシン添加培地（2．5mMG I y，5mNl G l y，10mMG l y，20mMG I y，50mlVIG 1 y）を
用いてmSGP細胞を48時間培養した。グリシン添加から24時間の時点でグリシン
除去培地に培地を交換し、グリシン添加から除去の前後の細胞増殖の変化を検討した（Fig．9）。その結果、グリシン添加によって抑制されていたmSGP細胞の増殖は、
グリシンの除去によって回復した。いずれの培地においても、グリシンの添加除去
に伴う細胞形態に変化を認めなかった。
次に、グリシンによる細胞増殖の抑制とアミノ酸毒性との関連性について検討し た。グリシンによる細胞増殖の抑制がアミノ酸毒性によるものであるかどうかを調