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Figure　16マウス唾液腺由来前駆細胞に対する長期間グリシン添加の影響

Fig．16マウス唾液腺由来前駆細胞の分化に対する

　　　　　　　長期間グリシン添加の影響

グリシン添加培地（10mM）を用いてmSGPを5継代培養し、蛍光免疫染色法、　RT－PCR法を用いて 細胞の形態変化と分化マーカーの変化を調べた。

【a】コントロール培地を用いて培養したmSGP。未分化mSGPは径20μm前後のNIC比の大き 　な細胞で均一な細胞集団を形成し、タイプ1コラーゲン上では多角形の上皮様形態を呈した。

　Scale　bar　1　OO　”　m．

［bl　RT－PCR．：コントロール培地で培養したmSGPからmRNAを抽出し、　RT－PCRを行った。

　mSGPの未分化マーカーであるAFPは陽性であった。分化マーカーのアルブミン、　G6P、

　CK19は陰性であった。　Lane1＝mSGP細胞、　Lane2＝liver

Ic］グリシン添加培地を用いて長期間培養した場合のmSGPの細胞形態の変化。グリシン添加

　培地を用いて5継代培養した場合、細胞の集積、cluster形成（arrow　head）の増加、管腔 　構造の形成（arrow）が認められた。他のアミノ酸添加培地を用いて培養した場合clusterの 　増加、管腔構造の形成を認めなかった。Scale　bar　1　OO　”　m。

【dl　cluster数の変化。1mm2あたりのCluster数の変化を調べた。　mSGPはCtusterを形成し、

　分化することが示されている。グリシン添加培地を用いて培養した場合、：コントロールに比較 　して1mm2あたりのCluster数が増加した。（control　3．6±2．63　clusters／mm2，＋Gly 　14．7±4．17　clusterslmm2　；　’p〈O．OOI）　．

【el無血清培養（non・serum）、　EGF無添加培地（一EGF）および4種類の増殖シグナル阻害剤

　添加培地（UO1265μM、LY29411220μM、　Akt　inhibitor　E　20μM、　Rapamycin 　snM）で培養した場合のmSGPの形態変化。無血清培地、　EGF無添加培地、　UO126添加培 　地、LY294112添加培地を用いて培養した場合、細胞の狭小化を伴う腺管様構造の形成

　（arrow）が認められた。Rapamycin添加培地、Akt・inhibitor　E添加培地を用いて培養した 　場合、cluster形成の増加（arrow　head）を認めた。　Scale　bar　100μm。

田cluster数の変化。各培地における1mm2あたりのCluster数を調べた。いずれの培地を用

　いて培養した場合にもCluster数に有意差を認めなかった。

lgl　Gly添加による細胞内シグナリングへの影響。コントロール培地、グリシン添加培地、細胞シグ

　ナル阻害剤（UO126）添加培地を用いてmSGPを24時間培養した。細胞内増殖シグナルの変化 　を調べるために、培地交換から2時間、6時間、24時間後にWestern　Blottingを用いた

　p421p44　MAPKリン酸化の検出を行った。：コントロール培地で培養した場合、　p－p421p44

　MAPKの発現は培地交換から6時間後にピークとなり、24時間後も持続した。　Gly添加培地で

　培養した場合、p・・p421p44　MAPKの発現は培地交換から2時間、6時間で認められた。しかし 　24時間後には消失した。Controline　10mM（＋G書y），　UO126（＋U），　HeLa　cells（HeLa）as　a 　positive　control．

【hl免疫蛍光染色。Glycine添加培地を用いて長期培養した場合、コントロールに比較して未分 　化マーカーのAFP（green）、CD49f（green）、　laminin（green）の発現が減弱した。反対にコ 　ントロールに比較してEカドヘリン（red）、導管細胞のマーカーであるCK19（red）発現の増強 　が認められた。Scate　bar　100μ　m。

【il　EGF無添加培地および増殖シグナル阻害剤添加培地を用いて培養した場合、　laminin 　（green）の発現が減弱し、　CK19（red）の発現が増強した。　Scale　bar　100μ　m。

0】RT－PCR。未分化マーカーであるAFPの発現が消失した。分化マーカーであるCK19の発現が

　増強した。Lane1：mSGP細胞（control）、　Lane2：mSGP細胞（＋Gly）、　Lane3：liver。

Fig．　17 マウス唾液腺由来前駆細胞の分化に対する

　　　　　　長期間グリシン除去の影響

グリシン除去培地（δGly）を用いてmSGP細胞を5継代培養し、蛍光三訂染色法を用いて

細胞の形態変化と分化マーカーの変化を調べた。

【a－c】免疫蛍光染色像を示す。【a】コントロール【b】δGly【c1δAlaを用いて2週間培養した mSGP細胞。コントロールおよびδGlyでは未分化マーカーのAFP（green）が陽性である。

分化マーカー（albumin：red）の発現は認めなかった。δAlaではalbuminコントロールに 比較して（red）の発現の増強を認めた。

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ドキュメント内 授授授授　　教教 (ページ 62-65)