第 4 章 ドメインキメラ L -2,3-butanediol dehydrogenase の基質認識能向上
4.3 結果および考察
4.3.4 X 線回折像の撮影と構造解析
表 4.9: 回折データと精密化の統計値
cLBDH-V254L bound NAD+ and BME Data-collection statistics
Beamline
Dataset 1 Dataset 2
Wavelength (˚A) 1.0000 1.8000
Space group C2221 C2221
Cell parameters
a (˚A) 81.3 81.3
b(˚A) 135.0 135.1
c(˚A) 87.8 87.9
Resolution range (˚A) 50 - 1.58 (1.63 - 1.58) 50 - 2.50 (2.58 - 2.50)
Unique reflection 66232 32267
Completeness 99.9 (99.9) 99.7 (96.4)
Average redundancy 11.9 (6.3) 13.2 (9.2)
Rmerge 3.3 (17.9) 3.7 (12.2)
⟨I⟩/σ⟨I⟩ 48.0 (10.4) 70.0 (29.2)
Refinement statistics
Resolution range (˚A) 39.4 - 1.58 Rwork/Rfree 0.1755 / 0.2026 RMSD
bonds(˚A) 0.004
Angles(◦) 0.93
Modeled molecular
Protein 2
Ligand 2 NAD+, 1 BME
Solvent 202
Average B-factor
Protein 23.3
Ligand 25.2
Solvent 27.6
Ramachandran favored (%) 96.9 Ramachandran outliers (%) 0.4
表 4.10: 回折データと精密化の統計値
cLBDH-V254L/T165A bound NAD+ and BME Data-collection statistics
Beamline
Dataset 1 Dataset 2
Wavelength (˚A) 1.0000 1.8000
Space group C2221 C2221
Cell parameters
a (˚A) 81.3 81.3
b(˚A) 135.0 134.6
c(˚A) 88.1 87.8
Resolution range (˚A) 50 - 1.70 (1.76 - 1.70) 50 - 2.60 (2.69 - 2.60)
Unique reflection 53477 28150
Completeness 99.9 (100) 94.4 (98.3)
Average redundancy 6.5 (6.6) 6.0 (5.3)
Rmerge 5.4 (42.5) 9.8 (27.0)
⟨I⟩/σ⟨I⟩ 4.6 (25.7) 13.8 (6.2)
Refinement statistics
Resolution range (˚A) 39.36 - 1.70 Rwork/Rfree 0.1635 / 0.1978 RMSD
bonds(˚A) 0.010
Angles(◦) 1.325
Modeled molecular
Protein 2
Ligand 2 NAD+
Solvent 185
Average B-factor
Protein 18.9
Ligand 18.5
Solvent 22.0
Ramachandran favored (%) 96.9 Ramachandran outliers (%) 0.4
表 4.11: 回折データと精密化の統計値
cLBDH-V254L/D169E bound NAD+ and BME Data-collection statistics
Beamline
Dataset 1 Dataset 2
Wavelength (˚A) 1.0000 1.8000
Space group C2221 C2221
Cell parameters
a (˚A) 81.3 81.3
b(˚A) 134.9 134.9
c(˚A) 87.9 87.9
Resolution range (˚A) 50 - 1.70 (1.76 - 1.70) 50 - 2.60 (2.69 - 2.60)
Unique reflection 75431 27967
Completeness 97.4 (95.1) 97.2 (94.7)
Average redundancy 7.5 (7.3) 15.4 (14.9)
Rmerge 3.3 (31.0) 3.2 (9.5)
⟨I⟩/σ⟨I⟩ 6.7 (38.7) 75.7 (28.6)
Refinement statistics
Resolution range (˚A) 39.34 - 1.50 Rwork/Rfree 0.1718 / 0.2020 RMSD
bonds(˚A) 0.010
Angles(◦) 1.337
Modeled molecular
Protein 2
Ligand 2 NAD+, 2 BME
Solvent 211
Average B-factor
Protein 17.2
Ligand 18.5
Solvent 22.5
Ramachandran favored (%) 97.1 Ramachandran outliers (%) 0.4
表 4.12: 回折データと精密化の統計値
cLBDH-V254L/T165A/D169E bound NAD+ and BME Data-collection statistics
Beamline
Dataset 1 Dataset 2
Wavelength (˚A) 1.0000 1.8000
Space group C2221 C2221
Cell parameters
a (˚A) 81.2 81.2
b(˚A) 134.8 134.8
c(˚A) 88.0 87.9
Resolution range (˚A) 50 - 1.32 (1.36 - 1.32) 50 - 2.60 (2.69 - 2.60)
Unique reflection 109945 28121
Completeness (%) 97.3 (95.2) 97.9 (96.1)
Average redundancy 8.5 (7.5) 7.7 (7.6)
Rmerge 2.7 (14.9) 3.2 (7.5)
⟨I⟩/σ⟨I⟩ 45.2 (13.7) 50.0 (24.1)
Refinement statistics
Resolution range (˚A) 39.3 - 1.32 Rwork/Rfree 0.1657 / 0.1831 RMSD
bonds(˚A) 0.009
Angles(◦) 1.333
Modeled molecular
Protein 2
Ligand 2 NAD+, 2 BME
Solvent 299
Average B-factor
Protein 13.7
Ligand 14.0
Solvent 21.0
Ramachandran favored (%) 97.1 Ramachandran outliers (%) 0.4
表 4.13: 回折データと精密化の統計値
cLBDH-V254L/T165A/R168E/D169E bound NAD+ and BME Data-collection statistics
Beamline
Dataset 1 Dataset 2
Wavelength (˚A) 1.0000 1.8000
Space group C2221 C2221
Cell parameters
a (˚A) 81.3 81.3
b(˚A) 134.2 134.2
c(˚A) 87.4 87.5
Resolution range (˚A) 50 - 1.50 (1.55 - 1.50) 50 - 2.60 (2.69 - 2.60)
Unique reflection 76186 28282
Completeness 99.6 (99.0) 99.4 (98.6)
Average redundancy 9.1 (7.1) 7.5 (7.2)
Rmerge 4.0 (29.0) 6.4 (28.0)
⟨I⟩/σ⟨I⟩ 32.6 (6.5) 28.2 (6.9)
Refinement statistics
Resolution range (˚A) 43.7 - 1.50 Rwork/Rfree 0.1623 / 0.1844 RMSD
bonds(˚A) 0.007
Angles(◦) 1.181
Modeled molecular
Protein 2
Ligand 2 NAD+, 1 BME
Solvent 271
Average B-factor
Protein 15.3
Ligand 14.5
Solvent 22.8
Ramachandran favored (%) 97.5 Ramachandran outliers (%) 0.4
図4.11: cLBDH-V254L結晶構造のデータセット1による基質結合サイトのFo−Fcオミッ トマップ (2.7σレベル、緑)とデータセット2による異常分散フーリエマップ(3.0σレベ ル、オレンジ)。
図4.12: cLBDH-V254L結晶構造のデータセット1によるIle140側鎖のFo−Fcオミット マップ (3.0 σレベル、緑)。
びArg168のそれぞれの側鎖は、データセット1によるFo−Fcオミットマップより、結 晶内にそれぞれ2つのコンフォメーションが存在すると決定した(図4.14)。特にPro147、 Ile148およびAsp169は、側鎖の衝突を避けるために、Asp169の側鎖がPro147から離れ ているコンフォメーション(図4.15-A)、Pro147に接近しているコンフォメーション(図 4.15-B)と、排他的なコンフォメーションを形成していると推測された。cLBDH-V254L 結晶とは異なり、Ile140の電子密度は明瞭であり、単一のコンフォメーションで座標が決 定された。
図4.13: cLBDH-V254L/T165A結晶構造のデータセット1による基質結合サイトのFo−Fc
オミットマップ (2.7 σレベル、緑)とデータセット2による異常分散フーリエマップ (3.0 σレベル、オレンジ)。
cLBDH-V254L/D169E結晶の構造解析では、サブユニットAの基質結合サイトに、デー タセット1によるFo−FcマップでBMEと思われる電子密度を確認し、データセット2 の異常分散フーリエマップでBMEのS原子の異常分散効果による電子密度が確認された ため、BMEの座標を決定した(図4.16)。しかし、cLBDH-V254L結晶と同様、基質結合 サイトのFo−Fcマップはタンパク質分子によるものに比べて明確ではなく、また異常分 散フーリエマップもタンパク質分子内のMetのS原子によるものより小さいため、結晶 内における占有率は低いと推測された。また、Phe146とArg168の側鎖は、データセット 1によるFo−Fcオミットマップより、結晶内に2つのコンフォメーションが存在すると 決定した (図4.17)。
cLBDH-V254L/T165A/D169E結晶の構造解析では、サブユニットA、Bともに基質結 合サイトにデータセット1によるFo−FcマップでBMEと思われる電子密度を確認し、
データセット2の異常分散フーリエマップでBMEのS原子の異常分散効果による電子密 度が確認されたため、BMEの座標を決定した (図4.18)。基質結合サイトのFo−Fcマッ プは明確であるが、cLBDH-V254L結晶、cLBDH-V254L/D169E結晶と同様、異常分散 フーリエマップはタンパク質分子内のMetのS原子によるものより小さいため、結晶内 における占有率は低いと推測された。また、Arg168の側鎖は、cLBDH-V254L/D169E結
図 4.14: cLBDH-V254L/T165A結晶構造のデータセット1によるPro147 (サブユニット A)とAsp169およびArg168 (サブユニットB)側鎖のFo−Fcオミットマップ(3.0σレベ ル、緑)。
晶と同様、データセット1によるFo−Fcオミットマップより、結晶内に2つのコンフォ メーションが存在すると決定した (図4.19)。
cLBDH-V254L/T165A/R168Q/D169E結晶の構造解析では、サブユニットA、Bとも に基質結合サイトに、データセット1によるFo−FcマップでBMEと思われる電子密度 を確認し、データセット2の異常分散フーリエマップで、サブユニットAにのみBMEの S原子の異常分散効果による電子密度が確認されたため、サブユニットAのみBMEの座 標を決定した (図4.20)。cLBDH-V254L/T165A/D169結晶同様、サブユニットAの基質 結合サイトのFo−Fcマップは明確であるが、異常分散フーリエマップはタンパク質分子 内のMetのS原子によるものより小さく、サブユニットBでは明確に確認できないため、
座標を決定したものの、結晶内におけるこのコンフォメーションでの占有率は低いもの と推測された。cLBDH-V254LおよびcLBDH-V254L/T165A、cLBDH-V254L/D169E、 cLBDH-V254L/T165A/D169Eとは異なり、基質結合サイトおよびドメインBのβE-αE 間のループ付近で異なるコンフォメーションを形成すると推測される残基側鎖は存在しな かった。
ラマチャンドラン解析で外れ値であった残基は、cLBDH-V254L/T165Aのコンフォメー ションB (図4.15)を除いて、各cLBDH部位特異的変異体でサブユニットAおよびBの Ile148であり、これについては第5章で述べる。
図 4.15: cLBDH-V254L/T165A結晶構造内で排他的なコンフォメーションを形成してい ると推測されるサブユニットAのPro147-Ile148とサブユニットBのAsp169。Aはコン フォメーションA。BはコンフォメーションB。
図4.16: cLBDH-V254L/D169E結晶構造のデータセット1による基質結合サイトのFo−Fc
オミットマップ (3.0 σレベル、緑)とデータセット2による異常分散フーリエマップ (3.0 σレベル、オレンジ)。
図 4.17: cLBDH-V254L/D169E結晶構造のデータセット1によるArg168 (サブユニット B)側鎖のFo−Fcオミットマップ(3.0 σレベル、緑)。
図4.18: cLBDH-V254L/T165A/D169E結晶構造のデータセット1による基質結合サイト のFo−Fcオミットマップ(3.0 σレベル、緑)とデータセット2による異常分散フーリエ マップ (3.0 σレベル、オレンジ)。
図 4.19: cLBDH-V254L/T165A/D169E結晶構造のデータセット1によるArg168 (サブ ユニットB)側鎖のFo−Fcオミットマップ (3.0 σレベル、緑)。
図4.20: cLBDH-V254L/T165A/D169E結晶構造のデータセット1による基質結合サイト のFo−Fcオミットマップ(3.0 σレベル、緑)とデータセット2による異常分散フーリエ マップ (3.0 σレベル、オレンジ)。
4.3.5 cLBDH変異体の基質結合サイト周辺とBsLBDHおよびcLBDHにお