結果および考察

2.3.1 酵素の精製

3PLBDH-F212Y の精製表を表2.4 に、各精製段階におけるSDS-PAGEを図2.1 に示 した。硫安分画、疎水性相互作用クロマトグラフィ、強陰イオン交換クロマトグラフィの 3^{段階の精製により、}29 KDa付近に単一バンドを確認した。アミノ酸一次配列より推定 される3PLBDH-F212Y^{単量体の分子量が}26,671 Da ^であり、BD^{に対してそれぞれ}29 U/mg の活性を示すことから、このバンドが3PLBDH-F212Y によるものと確認された。

2.3.2 3PLBDH-F212Yの触媒効率

表2.5^に3PLBDH^、3PLBDH-F212Y^およびBsLBDHの動力学的パラメータを示した。

3PLBDH-F212YはL-BDに対するk_cat、K_mともに3PLBDHから改善され、k_cat/K_mは 3PLBDHの8.1倍となり、F212Yの変異によって3PLBDHの触媒効率が改善されたこ とが確認された。しかし、3PLBDH-F212YのL-BDに対するK_mがBsLBDHの230倍、

kcat/Kmが1/87^{倍であるため、}BsLBDHの触媒能に及ばないことも確認された。また、

3PLBDH-F212Y^はmeso-BDに対する触媒効率も上昇し、基質認識が緩んだことも確認 された。

表 2.5: 3PLBDH^、3PLBDH-F212Y^およびBsLBDH^{の動力学的パラメータ} k_cat

(sec⁻¹)

K_m (mM)

kcat/Km

(sec⁻¹·mM⁻¹)

Ratio of k_cat/K_m Enzyme Substrate

3PLBDH L-BD 45 ±1 67 ±3 0.67 ±0.01

-meso-BD - >400 -

-3PLBDH-F212Y L-BD 95 ±7 18 ±3 5.4 ±0.5 8.9

meso-BD 63 ±7 100±10 0.61 ±0.02 1

BsLBDH L-BD 37 ±3 0.080 ±0.010 470±40 960

meso-BD 0.99 ±0.02 2.0±0.1 0.49 ±0.02 1

2.3.3 3PLBDH-F212Yの結晶化

3PLBDH-F212Y (APR複合体)の結晶化は、初期のスクリーニングでは沈殿剤にPEG6000

またはPEG4000を使用した条件で針状の結晶や棒状の微結晶が確認された。これらの条

件を最適化することで、3PLBDH-F212Y^{はタンパク質溶液が}10 mg/mL^、10 mM Tris-HCl (pH8.0)^、1 mg/mL APR^{、リザーバー液が}50 mM MES^バッファ(pH6.2)^、27.5%PEG4000^、 15%グリセロールの条件で、長さ約 100µmの棒状の単結晶が形成された (^図2.2)^。

図2.1: 3PLBDH-F212Yの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポリアクリルアミド、6×6 cm ゲル使用。AはCFE、Bは硫安分画後、Cは疎水性相互作用クロマトグラフィ後、D は強陰イオン交換クロマトグラフィ後、mは分子量マーカー。各レーンタンパク質量5µg 供試。

表2.4: 3PLBDH-F212Y^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 490 73 6.6 100 1.0

硫安分画 200 38 5.2 41 0.8 疎水性相互作用クロマトグラフィ 90 4.2 21 18 3.2 強陰イオン交換クロマトグラフィ 50 1.7 29 10 4.4

図2.2: 3PLBDH-F212Y^{結晶。タンパク質}:10 mg/mL^、1 mg/mL APR^{。リザーバー液}:50 mM MES^{酸バッファ} (pH6.2)^、27.5%PEG4000^、15%^{グリセロール。}

2.3.4 X線回折像の撮影と構造解析

表2.6に3PLBDH-F212Y (APR複合体)結晶の回折データと精密化の統計値を示した。

3PLBDH-F212Y (APR複合体)結晶構造も3PLBDH (APR複合体)結晶構造同様、サブ ユニット A-Cについてはすべての残基の座標を決定できたが、サブユニットD^について

は200-204番残基の座標は電子密度が不明瞭なため決定できなかった。各サブユニットを

重ね合わせたところ、3PLBDH (APR^複合体)結晶構造同様、サブユニットA-C^は閉構造 であることが確認され、サブユニットDも閉構造であることが推測された。以後、サブユ ニットAを3PLBDH-F212Y (APR複合体)結晶構造の単量体閉構造として代表させた。

3PLBDH-F212Y (APR複合体)結晶構造はすべてのサブユニットにAPRの電子密度を 確認し、座標を決定した。

2.3.5 3PLBDHおよび3PLBDH-F212YのAPR複合体結晶構造の基質結合 サイトの比較

3PLBDH (APR^複合体)^{結晶構造および}3PLBDH-F212Y (APR^複合体)^{結晶構造の基} 質結合サイトを比較したところ、3PLBDH-F212Y (APR^複合体)^{結晶構造では、}Trp190^側 鎖が3PLBDHよりもわずかではあるが、さらに基質結合サイトへ内傾いていた(^図2.3-A)^。 しかし、3PLBDH (APR複合体)結晶構造のTrp190側鎖とPhe146側鎖、Trp190側鎖と Tyr212側鎖の最短距離はそれぞれ3.9 ˚A、4.1 ˚Aであったのに対して、3PLBDH-F212Y (APR複合体)結晶構造のTrp190側鎖とPhe146側鎖、Trp190側鎖とTyr212側鎖の最短

表 2.6: 回折データと精密化の統計値

3PLBDH-F212Y bound APR

Data-collection statistics

Beamline PF-AR NW-12A

Wavelength (˚A) 1.0000

Space group P212121

Cell parameters

a (˚A) 76.7

b(˚A) 118.4

c(˚A) 158.1

Resolution range (˚A) 50 - 2.48 (2.56 - 2.48)

Unique reflection 51523

Completeness 99.5 (96.9)

Average redundancy 6.8 (5.2)

R_merge 4.5 (12.6)

⟨I⟩/σ⟨I⟩ 35.6 (12.6)

Refinement statistics

Resolution range (˚A) 47.4 - 2.48 R_work/R_free 0.2387 / 0.2810 RMSD

bonds(˚A) 0.002

Angles(^◦) 0.646

Modeled molecular

Protein 4

Ligand 4 APR

Solvent 56

Average B-factor

Protein 27.0

Ligand 27.7

Solvent 22.6

Ramachandran favored (%) 96.9 Ramachandran outliers (%) 0.0

距離はそれぞれ4.1 ˚A、4.5 ˚Aであったため、F212Yの変異により疎水性相互作用が軽減 されたことは確認され、これによりNAD⁺と基質を結合した閉構造をとりうるTrp190の 配向の範囲が広がり (^図2.4)^、Kmが下がったものと推測された。

3PLBDH-F212Y^はL-BD^{に対する触媒効率が}3PLBDH^{よりも向上したが、}BsLBDH の1/112倍と依然小さかった。この原因を考察するため3PLBDH-F212Y (APR^複合体) 結晶構造とBsLBDH (APR複合体)結晶構造の基質結合サイトを比較した結果 (図 2.3-B)、3PLBDH-F212YのTrp190のC_α-Phe146のC_α間が12.4 ˚Aであり、これに相当する BsLBDHでの距離が14.0 ˚Aであった。このことより、3PLBDHおよび3PLBDH-F212Y が閉構造時にTrp190-Phe146間で疎水性相互作用が生じる原因はTrp190^とPhe146^が含 まれている主鎖間がBsLBDHよりも近いためと推測された。

そこで、Trp190^{が含まれる}3PLBDH (APR^複合体)結晶構造の基質結合ループと、

Phe146が含まれているβE-αE間のループの主鎖骨格を重ね合わせて比較した (図2.5、 2.6)。この結果、3PLBDHのTrp190のC_α自体はBsLBDHのTrp192と1.2 ˚Aの偏差で あったが、基質結合ループ内で最大3.8 ˚Aの違いがあった。3PLBDHのPhe146も同様に、

C_α自体は0.7 ˚Aの偏差であったが、Pro147では1.4 ˚Aと、βE-αE間のループ最大の偏差 があった。このことより、3PLBDHの触媒効率改善には、主鎖骨格を変えるためのさらに 広範な残基の変異を検討する必要があると推測された。