各 cLBDH 変異体の触媒効率

BsLBDH^、cLBDH^および各cLBDH部位特異的変異体の動力学パラメータを表4.8^に 示した。BsLBDH^はBD^のC2(S)-配向ヒドロキシ基を厳格に認識する酵素で、L-BD^の k_cat/K_mはmeso-BDのそれの960倍であった。しかし、基質結合サイトを構成する三葉 ドメインをBsLBDHに由来したcLBDHは136倍であり、BDのC2キラル配向認識が緩 んだ酵素であった。

第3^{章の考察から、まず}cLBDH-V254Lを作成し、その触媒効率を算出したところ、L -BD^のkcatとKmがともに上昇したため、kcat/KmはcLBDHと大きな変化はなかったが、

meso-BD^のkcatが減少し、Kmも上昇したため、結果としてkcat/Kmが下がり、L-BD^の k_cat/K_mはmeso-BDのそれに対して361倍となった。このことからcLBDHの254番残 基 (BsLBDHの256番残基)がBDのC2キラル配向認識に影響を与えていることが明ら かとなった。

しかし、cLBDH-V254L^は、BD^のC2^{キラル配向認識が}BsLBDH^{に及ばないため、さら} にT165A^またはD169Eの変異を与えた酵素を作成した(cLBDH-V254L/T165A^、 cLBDH-V254L/D169E)^。cLBDH-V254L/T165A^は、cLBDH-V254L^に対してmeso-BD^のkcatと K_mがともに減少したためk_cat/K_mに大きな変化はなかったが、L-BDのk_catが1.7倍の 上昇およびK_mが0.7倍の低下により、そのk_cat/K_mはcLBDH-V254Lの2.7倍に上昇し た。このため、L-BDのk_cat/K_mはmeso-BDのそれに対して約1000倍となり、BDのC2 キラル配向認識がBsLBDHとほぼ同様な酵素となった。またcLBDH-V254L/D169E^は、

cLBDH-V254L^に対してmeso-BD^のKmは変わらなかったもののkcatが1.4^{倍となった} ため、kcat/Kmは上昇したが、L-BD^のkcat/KmがcLBDH-V254L^{のそれに対して}2.4^倍 と大きく上昇したため、L-BDのk_cat/K_mがmeso-BDのそれに対して約600倍となった。

この結果、cLBDH-V254L/D169E)のBDのC2キラル配向認識はBsLBDHには及ばない

ものの、cLBDH-V254Lからは向上したことが確認された。

そこで、この両変異を併せ持つ酵素cLBDH-V254L/T165A/D169Eを作成した。 cLBDH-V254L/T165A/D169E^はcLBDH-V254L/D169E^の持つL-BD^{に対する高い}kcatを保持 したままKmが減少し、meso-BD^に対するkcat/KmもcLBDH-V254L^{より減少し、}L-BD のk_cat/K_m^がmeso-BD^{のそれに対して約}1800^倍と、BsLBDH^よりもBD^のC2^キラル 配向認識が厳格な酵素となり、cLBDHの165番残基 (BsLBDHの167番残基)と169番 残基 (BsLBDHの171番残基)がBDの触媒効率とそのC2キラル配向認識に大きく影響 を与えていることが明らかとなった。

さらに、cLBDH-V254L/T165A/D169E^にR168Q^{の変異を与えた酵素}

cLBDH-V254L/T165A/R168Q/D169E^{を作成したところ、}L-BD^のKmが減少したこと により、L-BD^のkcat/KmがcLBDH-V254L/T165A/D169E^に対して2^{倍に上昇した。し} かし、meso-BDのk_catも上昇しているため、結果としてL-BDのk_cat/K_mがmeso-BDの それに対して約2000倍となり、cLBDH-V254L/T165A/D169Eと同程度にBDのC2キ ラル配向を認識する酵素となった。このことから、cLBDHの168番残基(BsLBDHの169

図 4.1: cLBDH-V254Lの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポリアクリルアミド、6×6 cm ゲル使用。AはCFE、Bは硫安分画後、Cは疎水性相互作用クロマトグラフィ後、D は強陰イオン交換クロマトグラフィ後、mは分子量マーカー。各レーンタンパク質量5µg 供試。

表 4.3: cLBDH-V254L^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 240 79 3.1 100 1.0

硫安分画 450 73 6.1 190 2.0 疎水性相互作用クロマトグラフィ 91 10 9.0 38 2.9 強陰イオン交換クロマトグラフィ 68 3.2 21 28 6.8

図 4.2: cLBDH-V254L/T165Aの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポリアクリルアミ ド、6×6 cm ^{ゲル使用。}A^はCFE^、B^{は硫安分画後、}Cは疎水性相互作用クロマトグラ フィ後、Dは強陰イオン交換クロマトグラフィ後、mは分子量マーカー。各レーンタンパ ク質量 5 µg^供試。

表4.4: cLBDH-V254L/T165A^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 280 85 4 100 1.0

硫安分画 230 35 6.7 82 2.0 疎水性相互作用クロマトグラフィ 170 9.2 18 61 5.6 強陰イオン交換クロマトグラフィ 67 1.3 52 24 16

図 4.3: cLBDH-V254L/D169Eの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポリアクリルアミ ド、6×6 cm ^{ゲル使用。}A^はCFE^、B^{は硫安分画後、}Cは疎水性相互作用クロマトグラ フィ後、Dは強陰イオン交換クロマトグラフィ後、mは分子量マーカー。各レーンタンパ ク質量 5 µg^供試。

表4.5: cLBDH-V254L/D169E^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 350 88 3.9 100 1.0

硫安分画 270 33 8.0 77 2.0 疎水性相互作用クロマトグラフィ 300 9.8 31 86 7.8 強陰イオン交換クロマトグラフィ 120 1.4 83 34 21

図4.4: cLBDH-V254L/T165A/D169Eの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポリアクリ ルアミド、6×6 cm^{ゲル使用。}A^はCFE^、B^{は硫安分画後、}Cは疎水性相互作用クロマト グラフィ後、Dは強陰イオン交換クロマトグラフィ後、mは分子量マーカー。各レーンタ ンパク質量 5µg^供試。

表4.6: cLBDH-V254L/T165A/D169E^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 1000 92 11 100 1.0

硫安分画 540 26 21 54 1.9 疎水性相互作用クロマトグラフィ 520 15 35 52 3.2 強陰イオン交換クロマトグラフィ 200 2.5 80 20 7.3

図 4.5: cLBDH-V254L/T165A/R168Q/D169Eの精製段階におけるSDS-PAGE。12%ポ リアクリルアミド、6×6 cm ^{ゲル使用。}A^はCFE^、B^{は硫安分画後、}C^{は疎水性相互作用} クロマトグラフィ後、Dは強陰イオン交換クロマトグラフィ後、m^{は分子量マーカー。各} レーンタンパク質量 5µg^供試。

表4.7: cLBDH-V254L/T165A/R168Q/D169E^の精製表

Process Activity

(U)

Protein (mg)

Specific Activity (U/mg)

Yield

(%) Fold 無細胞抽出液 (CFE) 650 73 8.9 100 1.0

硫安分画 970 49 20 150 2.2 疎水性相互作用クロマトグラフィ 440 10 44 68 4.9 強陰イオン交換クロマトグラフィ 140 2.4 58 22 6.5

番残基)^はBDの触媒効率に影響を与えていることが明らかとなった。

表4.8:BsLBDH、cLBDHおよび各cLBDH部位特異的変異体の動力学パラメータ kcat (sec−1 ) Km (mM) kcat/Km (sec−1 ·mM−1 )

Ratioof kcat/KmEnzymeSubstrate BsLBDHL-BD37±30.08±0.01470±40960 meso-BD0.99±0.022.0±0.10.49±0.02 cLBDHL-BD10±10.070±0.003150±10140 meso-BD1.9±0.11.7±0.11.1±0.1 cLBDH-V254LL-BD14±10.10±0.01130±10360 meso-BD1.0±0.12.9±0.10.36±0.01 cLBDH-V254L/T165AL-BD24±10.068±0.006360±201000 meso-BD0.80±0.032.3±0.20.35±0.01 cLBDH-V254L/D169EL-BD45±30.15±0.02310±30610 meso-BD1.4±0.12.7±0.10.51±0.02 cLBDH-V254L/T165A/D169EL-BD45±50.11±0.02400±501800 meso-BD0.68±0.023±0.10.22±0.01 cLBDH-V254L/T165A/R168Q/D169EL-BD48±10.060±0.002800±302100 meso-BD1.1±0.022.7±0.40.39±0.04