得られたSmKS, SmDTC3, SmTPS9組換え酵素について, 試験管内で酵素反応を行い, 酵素反応抽
出液をGC-MS分析に供し機能解析を行った。またSmDTC3がnormal CDPを基質に合成する化合
物について, [U-13C6]MVAから酵素合成により完全13C標識化し, NMR分析により構造決定を行った。
1.2.5.1 酵素反応と生成物の抽出
SmDTC3, SmKSについては試験管内に下記の組成で反応液を調製し, 30ºCで2 h酵素反応を行っ
た。下記組成のうち, CPSに関しては必要に応じ添加した。
GGDP（Triammonium塩溶液, Sigma-Aldrich） 1 g AtCPS, SmMDSmutあるいはOsCPS4酵素溶液 酵素50–100 g
SmKSあるいはSmDTC3酵素溶液 酵素50 g
MgCl2 10 mM
タンパク質回収用バッファー up to 200 l
SmTPS9については下記の組成で反応液を調製し, 30 ºCで18 h酵素反応を行った。
31
GGDP（Triammonium塩溶液, Sigma-Aldrich） 1 g
SmTPS9酵素溶液 50 l
MgCl2 5 mM
各々得られた酵素反応液に 1 ml 程度の n-hexane を重層し, ボルテックスし激しく撹拌の後
n-hexane層を回収することで, 酵素反応生成物を抽出した。n-Hexaneによる抽出を3回繰り返し, 得
られた抽出液を液量200 l程度になるまで窒素ガスを吹き付けて濃縮した。
1.2.5.2 酵素反応抽出液のGC-MS分析
得られた酵素反応抽出液から1 l（抽出物の約0.5% v/v相当）をGC-MS分析に供した。特に断 りのない場合, 分析には下記の装置・条件を用いた（【条件1】）。
装置 GC: Agilent 6890ガスクロマトグラフ（Agilent） MS: JMS-Bu25（Jeol）
カラム: Equity-1（内径0.25 mm × 15 m, フィルム厚0.25 m, Supelco） 条件 キャリアガス: ヘリウム, 流速1 ml/min
GCインジェクター: スプリットレス, 250ºC
GC昇温条件: 80ºC, 1 min → 200ºCまで30ºC/minで昇温
→ 250ºCまで5ºC/minで昇温 → 250ºC保持 イオン化: . イオン化室温度250 ºC, EI+（70 eV）
上記条件で生成物の分離が困難であった一部の酵素反応抽出液については, 下記の点について変 更を行い分析した（【条件2】）。
装置 カラム: DB-WAX（内径0.25 mm × 30 m, フィルム厚0.25 m, J&W Scientific）
条件 GC昇温条件: 80ºC, 2 min → 230ºCまで20ºC/minで昇温 → 230ºC保持
また, normal CDP–SmDTC3生成物については構造解析を行うため, 上記四重極型MS装置よりも 精度の高い分析が可能となる二重収束型MS装置を用い, 精密質量分析も行った。精密質量分析を 行う場合には下記の点について変更を行い分析した（【条件3】）。
32
装置 GC: Agilent 7890ガスクロマトグラフ（Agilent）
MS: JMS-700（Jeol）
カラム: Equity-1（内径0.25 mm × 30 m, フィルム厚0.25 m, Supelco）
1.2.5.3 [U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物の酵素合成と精製
Sugai et al., 2011 (2)を参考に, MVA経路の組換え酵素群を用いて[U-13C6]MVAから[U-13C20]GGDP を経て[U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物を合成した（図 1–4）。以前の報告から合成系の改良を 行い, phosphomevalonate kinaseについてはピキア酵母（Pichia pastoris）由来のものにソースを変更 し, また合成系に加える酵素量に関しても最適化検討を行い以下のような組成で反応を行った。以 下の組成は酵素反応液全体の合計を示しており, 実際に反応を行う際にはこれを 104 本に分け各
600 lのスケールでガラス製試験管内に調製し, 30ºCで約16 h反応を行った。
[U-13C6]MVA（標識率99.7%） 12.2 mg
ATP 16 m
アカパンカビ（Neurospora crassa）由来MVA kinase 2.1 mg ピキア酵母由来phosphomevalonate kinase 2.1 mg アカパンカビ由来diphosphomevalonate decarboxylase 2.1 mg アカパンカビ由来IPP isomerase 2.1 mg 高熱性細菌Sulfolobus acidcaldarius由来GGDP synthase 5.2 mg
SmMDSmut酵素溶液 酵素3.1 mg
SmDTC3酵素溶液 酵素5.2 mg
MgCl2 20 mM
タンパク質回収用バッファー up to 62.4 ml
酵素反応液に各1 ml程度のn-hexaneを重層し, ボルテックスし激しく撹拌の後n-hexane層を回 収することで, 酵素反応生成物を抽出した。n-Hexaneによる抽出を3回繰り返し, n-hexane層をまと めてロータリーエバポレーター及び窒素ガスの吹きつけにより濃縮した。
33
濃縮した目的化合物のn-hexane溶液をシリカゲルカラム（Bond Elut-SI 500 mg; Agilent）に通し, 極 性夾雑物の除去を行った。溶媒を再度窒素ガスの吹きつけにより留去し, cyclohexane-d12で置換した。
得られた目的化合物のcyclohexane-d12溶液をNMR分析に供した。
1.2.5.4 [U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物のNMR分析
[U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物 約600 gを含むcyclohexane-d12溶液をNMR分析に供し構 造決定を試みた。測定時には微量サンプル用の同軸NMRチューブ（CMS-005; Shigemi）を用いた。
また, 装置にはBruker Avance III（1H共鳴周波数700 MHz, 13C共鳴周波数175 MHz）あるいはJEOL ECA-600（1H共鳴周波数600 MHz, 13C共鳴周波数150 MHz）を用いた。
1次元測定では, 通常の13C-{1H}-NMR測定の他, 逆ゲート1Hデカップルを行った13C-NMR測定 を行った。その際には標準的な逆ゲートデカップルパルスを用いる他pulse delayを10 secとること で, 半定量的な測定を試みた。2次元測定として13C-13C correlation spectroscopy（13C-13C COSY）測 定を行った他, heteronuclear single quantum coherence（HSQC）, edited HSQC, constant-time HSQC測定 も行った。13C-13C COSYパルスシークエンスについてはNagayama et al., 1980及びSugai et al., 2011 (2)の報告に準じた（Nagayama et al., 1980及びSugai et al., 2011 (2)）。同様に各種HSQC測定につい てはWillker et al., 1993, Vuister and Bax, 1992及びSugai et al., 2011(2)に従った（Willker et al., 1993, Vuister and Bax, 1992及びSugai et al., 2011(2)）。
34
節 目的 プライマー名 配列（5’から3’へ表記）
1.2.2.1 SmDTC1（SmTPS9）
部分配列の増幅 SmDTC1-P-Fwd TGTTGAACTCTCTGCACGACGG SmDTC1-P-Rev GCCCATGCTATTCCTTTGTCTGTCCA SmDTC2部分配列の
増幅 SmDTC2-P-Fwd ACGATGTTCCGCTCCCTGG
SmDTC2-P-Rev CAGAAACATCGTATCCGTGACTCCG SmDTC3部分配列の
増幅 SmDTC3-P-Fwd GGAAGTGAAGGGATGGCTGATGAAA
C
SmDTC3-P-Rev CCACAAAATAATATGCCCATAAGTAC GTGAGTTGC
SmDTC4（SmMDS）
部分配列の増幅 SmDTC4-P-Fwd TGCTCGTCGCGGAAGTGAAG SmDTC4-P-Rev CAGCCGCTCAATGGTGTCG SmDTC5部分配列の
増幅 SmDTC5-P-Fwd ACGTCACTGCTTGTCGCGG
SmDTC5-P-Rev AAGCTCTTTAATGTTTGTTGCGTAGTC C
SmDTC6
（SmCPSKSL1）
部分配列の増幅
SmDTC6-P-Fwd ACACAGCTTGGGTTGGTCGG SmDTC6-P-Rev GCAACCTGAGCAGACGAAAGCC SmDTC7（SmKS）
部分配列の増幅 SmDTC7-P-Fwd TTGCTGGCGTGAACGATGC
SmDTC7-P-Rev GAGAGAATCGTGCGTGTCCATAAAGT C
SmDTC8部分配列の
増幅 SmDTC8-P-Fwd AAATGCTGCGGTTGGTGTCC
SmDTC8-P-Rev TCGGCAAGGTCGTCACAAGC
1.2.2.2 5’-RACE GeneRacer 5’ CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
5’-RACE nested PCR GeneRacer 5’ nested GGACACTGACATGGACTGAAGGAGT A
3’-RACE GeneRacer 3’ GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG
3’-RACE nested PCR GeneRacer 3’ nested CGCTACGTAACGGCATGACAGTG
SmKSの5’-RACE SmKS-5RACE-Rev CGTAGCCATGACGACGAAGAATCCG
SmKSの5’-RACE
Nested PCR SmKS-5RACE-N-Rev CGGAAGCATCGTTCACGCCAGCA
SmKSの3’-RACE SmKS-3RACE-Fwd TGCTGGCGTGAACGATGCTTCC
SmKSの3’-RACE
nested PCR SmKS-3RACE-N-Fwd CGGATTCTTCGTCGTCATGGCTAC SmDTC3の5’-RACE SmDTC3-5RACE-Rev CAACGTGGTGGGAGTGGAATGGAG SmDTC3の5’-RACE
Nested PCR SmDTC3-5RACE-N-Rev GAGCGTGACCAGGCAAGAGAGCGTG SmDTC3の3’-RACE SmDTC3-3RACE-Fwd CGCTCTCTTGCCTGGTCACGCTCA
表1–1 第1章において使用されたプライマー
35
節 目的 プライマー名 配列（5’から3’へ表記）
1.2.2.2 SmDTC3の3’-RACE
Nested PCR SmDTC3-3RACE-N-Fwd CCATTCCACTCCCACCACGTTG SmTPS9の5’-RACE SmTPS9-5RACE-Rev TCCCAGGCGTTGTAAGCGGTCA SmTPS9の5’-RACE
Nested PCR SmTPS9-5RACE-N-Rev ACATGCCAGTGCCGAACAGATGCG SmTPS9の3’-RACE SmTPS9-3RACE-Fwd CGCATCTGTTCGGCACTGGCA SmTPS9の3’-RACE
nested PCR SmTPS9-3RACE-N-Fwd GACCGCTTACAACGCCTGGGA
1.2.3 SmKSORF断片の増幅 SmKS-Kpn-Fwd ACGGTACCATGACTCTCAGCATTCGG
TCCC
SmKS-Kpn-Rev GCGGTACCAGCCCAGCCAGTTAAAG ATTATTC
SmDTC3ORF断片の
増幅 SmDTC3-Kpn-Fwd ACGGTACCATGAGAGAAACGTCTCTG
CTCGTC
SmDTC3-Kpn-Rev GCGGTACCGGAAGGAACTCTGGGAA TATAT
SmTPS9ORF断片の
増幅 SmTPS9-Fwd ATGTGGGAACTCGTCGAAACCG
SmTPS9-Rev GCGAACTTGGCTGTGTAGTCCACC
表1–1 第1章において使用されたプライマー（続き）
36 lacZa断片
Multiple cloning site（MCS）, PCR産物挿入部位
f1複製領域
Kanamycin 耐性遺伝子 Ampicillin
耐性遺伝子 ColE1（pUC型）
複製領域
pCR2.1-TOPO 3,931 bp
pCold II 4,392 bp
Ampicillin 耐性遺伝子 lacI
ColE1（pBR322型）
複製領域
M13複製領域 cspAプロモーター lacオペレーター cspA5’非翻訳領域 TEE配列
6×His-tag MCScspA3’非翻訳領域
pQE30 3,461 bp
ColE1（pBR322型）
複製領域 Ampicillin 耐性遺伝子
T5プロモーター lacオペレーター 6×His-tag MCS
pCR2.1－TOPOベクター（Invitrogen）
トポイソメラーゼで活性化された T突出末端を持ち, A突出末端を持つ DNA断片をクローニングできる。
lacZaを利用した青白選抜, ampicillin 及びkanamycin耐性を利用したプラ スミド保持株の選抜が行える。
pCold IIベクター（Takara Bio）
大腸菌の低温発現タンパク質CspAの プロモーター, 配列を利用した組換え タンパク質発現用のベクターである。
lacオペレーター配列も持ち, 補助的に 組換えタンパク質発現の調節が可能で ある。目的タンパク質の発現を促す TEE配列がN末端側に付加される。
また, 得られる組換えタンパク質には N末端側に6×His-tagが融合される。
Ampicillin耐性を利用したプラスミド 保持株の選抜が行える。
pQE30ベクター（Qiagen）
T5プロモーターを利用した組換え タンパク質発現用のベクターである。
タンデムにつながった2つのlacオペ レーター配列を持ち, IPTGの添加によ り目的タンパク質の発現が促される。
得られる組換えタンパク質には N末端側に6×His-tagが融合される。
Ampicillin耐性を利用したプラスミド保 持株の選抜が行える。
図1–3 使用した大腸菌用ベクターのマップと特徴
37
図1–3 使用した大腸菌用ベクターのマップと特徴（続き）
lacIq pGEX-4T-3 4,968 bp
Ampicillin 耐性遺伝子 lacオペレーター GST
ColE1（pBR322型）
複製領域
Tacプロモーター
MCS
pET32a(+) 5,900 bp
ColE1（pBR322型）
複製領域
f1複製領域 Ampicillin
耐性遺伝子
lacI
T7プロモーター lacオペレーター trxA6×His-tag S・tag MCS6×His-tag
pGEX-4T-3ベクター（GE Healthcare）
Tacプロモーターを利用した組換えタ ンパク質発現用のベクターである。
lacオペレーター配列を持ち, IPTGの添 加により目的タンパク質の発現が促さ れる。
N末端側にGSTが融合した組換えタン パク質が得られ, GSTを利用した精製 が可能である。 また, Ampicillin耐性 を利用したプラスミド保持株の選抜が 行える。
pET32a(+)ベクター（Novagen）
T7プロモーターを利用した組換えタ ンパク質発現用のベクターである。
lacオペレーター配列を持ち, IPTGの添 加により目的タンパク質の発現が促さ れる。
目的タンパク質の可溶化を促すTrxA融合 タンパク質が得られ, 6×His-tagやS・
tagを利用した精製が可能である。6×
His-tag配列をC末端に付加するよう, 読み枠が合うように目的遺伝子を導入 した。Ampicillin耐性を利用したプラス ミド保持株の選抜が行える。
38
HOOC CH2OH OH
HOOC CH2OP OH
HOOC CH2OPP OH
OPP OPP
OPP [U-13C6]MVA
[U-13C6]Phosphomevalonate
[U-13C6]Diphosphomevalonate
[U-13C5]IPP [U-13C5]DMAPP
[U-13C20]GGDP
[U-13C20]normal CDP OPP
H
[U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物 MVA kinase
Phosphomevalonate kinase
Diphosphomevalonate decarboxylase
IPP isomerase
GGDP synthase
SmMDSmut
SmDTC3 ATP
ADP
ATP ADP
ATP ADP + Pi + CO2
3PPi
PPi
図1–4 [U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物合成経路
39 1.3 結果
1.3.1 イヌカタヒバcDNAライブラリーより得られた機能未知ジテルペン環化酵素遺伝子
1.2.2.1において, イヌカタヒバcDNAライブラリーを鋳型に8つの予想ジテルペン環化酵素遺伝
子を候補としPCRによるcDNA断片の増幅を試みた。その結果, この条件ではSmDTC1, SmDTC3,
SmDTC4及びSmDTC7の4遺伝子をもとに設計したプライマーセットで目的配列を持つcDNA断
片の増幅が見られた。これらのうちSmDTC4はSmMDS（Sugai et al., 2011 (2)）として既に機能が 報告されているため, その後の実験には用いなかった。その他3つの遺伝子について, SmDTC7は 後に単機能型KSをコードする遺伝子であると決定されたので, 混乱を避けるためSmKSと表記し た。また, SmDTC1は1.1に述べた通りSmTPS9（Li et al., 2012）とほぼ同一の配列を有するため, 同
じく SmTPS9 と表記することとした。これら SmKS, SmDTC3 及び SmTPS9 について 3'-RACE,
5'-RACEによりcDNA配列の決定を行った。以上の結果は岡山理科大学において確認された。
1.2.2.2のRACE解析により明らかとなったSmKS, SmDTC3及びSmTPS9の完全長cDNA配列を【図 1–5】,【図 1–6】, 【図 1–7】に示した。SmKSは753 a.a, SmDTC3は834 a.a., SmTPS9は740 a.a.
のタンパク質をコードすると予想された。想定アミノ酸配列から, SmKSはA型環化反応に必要な
DDxxDモチーフのみを持ち, A型環化反応を触媒する単機能型ジテルペン環化酵素と推定された。
裸子植物のKSと相同性が高く（Picea KSと比較しアミノ酸配列でidentity 37%）, 単機能型のKS と予想された。同じく SmDTC3 は DxDD モチーフ及び DDxxD モチーフの双方を有しており,
SmMDSと77%同一の配列を持つことからも多機能型のジテルペン環化酵素であると予想された。
SmTPS9については既にLiらによりCPSとして報告されており, B型環化反応に必要なDxDDモ
チーフのみを有することからも支持された。