1.3.4.1 GC-MS分析による酵素反応生成物の解析
SmKSは単機能型のKS, すなわちent-CDPをent-kaureneに変換する活性を有すると予想された。
そこで1.2.5.1に示す酵素反応液組成において, GGDPとAtCPSの共存下でSmKSをインキュベート
した。酵素反応生成物をn-hexaneで抽出してGC-MS分析を行った。保持時間6.67 minに単一の生 成物が確認され（図 1–9）, この生成物は ent-kaurene標品と保持時間, マススペクトルとも一致し た。SmKS酵素を単独でGGDPと反応させた場合には, 環化反応生成物は確認されなかった。よっ
て, SmKSは予想通りent-CDPをent-kaureneに変換する単機能型のKSであった。また，単機能型
のnormal-CPS, あるいはent-CPSとして機能が報告されているSmTPS9についてAtCPSの代わりに
SmKS 酵素反応液に導入したところ, 同じく ent-kaurene が生成した（図 1–10）。このことから,
SmTPS9 は ent-CPS であることが確認できた。以上の実験により, イヌカタヒバには単機能型の
ent-CPS及びKSが機能することが明らかとなった。
SmDTC3は2つのアスパラギン酸リッチモチーフを持つことから, GGDPから2段階の環化反応
を単独で触媒する多機能型ジテルペン環化酵素であると予想された。しかし予想に反し，SmDTC3 酵素を単独で GGDP を基質に反応を行っても, GC-MS 分析において生成物は確認されなかった。
GGDPを基質に環化反応を進行させるB型環化活性に必要なDxDDモチーフについて, SmDTC3は D367IED という不完全なモチーフしか持たないことが原因かもしれないと考えられた。そこで点変 異導入により D367IED を DIDD に変異させた酵素 SmDTC3E369D 発現コンストラクトを作製し,
SmTPS9と同じ昆虫無細胞発現系により酵素を調製したが, やはりGGDPを基質とした環化反応活
42 性は示さなかった。
次にSmDTC3酵素のA型環化反応活性を調べるため, ent-CDP, normal-CDP及び及びsyn-CDPを ぞれぞれ基質に用いて反応を行ったところ, 全ての反応系から環化反応生成物が確認された。
ent-CDPを基質にして環化反応を行うと, 保持時間7.97 minに主生成物を与えた（図 1–11）。保持
時間7.97 min付近には, 非酵素的に生成するent-CDPの脱リン酸化体ent-copalolもピークを与える
が, 1.2.5.2 に示す【条件 2】を用い分離を行うことで, この主生成物は ent-copalol ではなく
ent-16a-hydroxykauraneであることが明らかとなった（図 1–12）。また，より保持時間の短い副生成
物は全て分子イオンピーク m/z 272 を持ち, ジテルペン炭化水素体であると考えられる。同様に
normal-CDPを基質に反応を行った場合, SmDTC3は保持時間6.22 minに単一の生成物を与えた（図
1–13）。この化合物は分子イオンピークm/z 272を示すジテルペン炭化水素と考えられた。syn-CDP
を基質に用いた場合には, 分子イオンピークに m/z 290あるいはm/z 272を持つ生成物が複数確認
され, 保持時間8.17 minのジテルペンアルコール体の主生成物に加え, 炭化水素体・アルコール体
双方を含む複数の副生成物が生じていると考えられた（図 1–14）。以上示したように, SmDTC3は GGDP を変換する B 型環化活性は確認できないが, 複数の CDP 立体異性体を基質として認識し, 様々な環化反応生成物を与えるA型環化活性を示すことが明らかとなった。
1.3.4.2 normal CDP–SmDTC3生成物の構造解析
SmDTC3による環化反応生成物のうち , normal CDPから生成される化合物は単一であり, また
SmDTC3とアミノ酸配列レベルで77%同一のSmMDSもnormal CDPをA型環化反応基質とするこ
とから, その構造に興味が持たれた。1.2.5.2【条件3】を用いた精密質量分析によりnormal CDP–
SmDTC3生成物は一般的なジテルペン炭化水素に同じC20H32の分子式を持つと推定された（m/z
272.2509, 計算値m/z 272.2504）。さらに詳細な構造解析を行うため, Sugaiらの系による完全13C標 識化を行い, 13C核を主とするNMR測定により構造解析を行った。
[U-13C6]MVAから[U-13C6]GGDPを合成する酵素群にnormal-CPS, SmDTC3を加え,
[U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物を合成する7ステップの反応を1試験管内で行った（図 1–4）。 モル収率約9%で目的の完全標識化合物を約600 g得た。生成物を反応液からn-hexaneで抽出し, シ リカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製の後に各種NMR分析に供した（溶媒
cyclohexane-d12）。
【図 1–15】に通常の完全1Hデカップリングを行った13C-NMRスペクトル, 【図 1–16】に逆ゲ ート1Hデカップリングを行った13C-NMRスペクトルを示した。後者のスペクトルでは, 逆ゲート
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デカップリングにより1H核との核オーバーハウザー効果（NOE）によるピークの増大が大きく抑 えられ, またパルス–データ取り込み後から次のパルスまでの間隔を10 secと長く設け, 緩和時間の 違いによるピーク強度の差を減らすよう測定を行った。両者のスペクトルの比較として, 【図 1–17】
に低磁場領域の拡大を示した。通常の完全1Hデカップリングを行ったスペクトルでは, 1Hが2つ 直接結合しているC-16ピークの強度は相対的に強く, 逆に4級炭素であるC-8ピークの強度は弱く 観測された。これに対して, 逆ゲート1Hデカップリングを行ったスペクトルではこれらのピーク強 度が変化しており, ほぼ炭素数に比例したピーク面積の積分値が得られた。このようにピーク面積 が炭素数にほぼ比例する条件で13C-NMRスペクトルを取得することにより, 13C-13Cカップリングに より広幅化し互いに重なったピークについても, ピークの積分値から対応する炭素数を類推し解析 した（図 1–16）。【表 1–2】に得られた13Cピークの化学シフト値とカップリングパターンを示した。
炭素数20と予測された構造に対し, C 34.1にC-4とC-19由来のピークが完全に重なっており19の ピークが観測された（うちC-17由来のピークは溶媒ピークの端に観測され, 積分値を示すことがで きなかった）。C 110–150の低磁場領域に4本のピークが観測されたこと, そのうちC 110.4を示す C-16由来のピークがdのカップリングパターンを示したことから, [U-13C20]normal CDP–SmDTC3生 成物は2重結合を2つ持ちかつエキソメチレン構造を持つことが明らかとなった。
【図 1–19】には[U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物の13C-13C COSYスペクトルを示した。13C-13C COSY測定は, 非標識体に適用するincredible natural abundance double quantum transfer experiment
（INADEQUATE）測定と同様の結果が得られる2D測定法であり, 直接結合している13Cピーク同 士に相関が得られる。INADEQUATE測定ではパルス系列と位相回しにより, 希薄な13C-13C相関由 来のシグナルを二量子コヒーレンスとして選択的に得ている。【図 1–20】にクラリッジ著有機化学 のための高分解能NMRテクニックを参考とし, 単純化したCOSYとINADEQUATEのパルス系列 を示した（クラリッジ, 2006）。完全13C標識化化合物の測定では除去すべき12C-13C由来のシグナル はほぼ存在しないため（計算上, 13C標識率99.7%として0.6%程度）, INADEQUATE系列は冗長と 言える。パルス系列が無駄に長くなることはシグナル強度の損失にもつながるため, 本実験では単 純なCOSY系列を用いた。13C-13C COSYスペクトルの解析から表 1–2のような相関が得られたた め, [U-13C20]normal CDP–SmDTC3生成物は【図 1–18】に示す平面構造を持つと決定した。C-4と C-19由来のピークが重なり合っており相関の帰属を困難にしたが, 同じnormal CDPから生合成さ れ同様のA/B環構造を持つと考えられるmiltiradiene（SmMDS生成物; Sugai et al., 2011 (2)）の完全
13C標識体スペクトルとも比較し, 表 1–2に示す帰属が妥当であると判断した。また, 通常のHSQC 測定, edited HSQC測定, constant-time HSQC測定では, 炭素に対する水素の結合数などにより相関ピ
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ークの有無・位相が異なるため, 非標識体における各種distorsionless enhancement by polarization
transfer（DEPT）測定のように, 炭素の級数を確認することができる。これらの測定により, 表 1-19
の平面構造と炭素の級数に矛盾がないことを確認した。
Normal CDP–SmDTC3生成物には, C-5, C-9, C-10及びC-13の4つの立体中心が存在する。このう ちA/B環部分（C-5, C-9, C-10）に関してはnormal CDPの立体化学が保存され, 5S, 9S, 10Sであると 推測された。よってnormal CDP–SmDTC3生成物は, 13R体であるsandaracopimaradieneあるいは13S
体であるpimara-8(14),15-dieneであると考えられた。C-13の配置について, NOEを利用したNMR
測定により相対配置の決定を試みたが, C-13の周囲にNOE測定が可能である1H原子が少ないこと, C環周囲の1H原子についてNMRにおける化学シフト値が互いに近く, NOE測定において分離が困 難であったことなどが原因で決定に至らなかった。Sandaracopimaradieneとpimara-8(14),15-dieneは ジアステレオマーの関係にあり, 光学分割を必要とせず一般的な分析により分離して検出が可能で ある。そこで, GC-MSにおいて標品との比較を行うことで, 立体配置の決定を試みた。OsKSL10は イネ由来のジテルペン環化酵素であり, ent-CDPを基質として主生成物として
ent-sandaracopimaradieneを, 副生成物としてent-pimara-8(14),15-dieneを合成するA型環化を触媒す る（Otomo et al., 2004 (1)）。そこでent-CDPの共存下でOsKSL10をインキュベーションして得られ た生成物とnormal CDP–SmDTC3生成物をGC-MS分析により比較したところ, normal CDP–
SmDTC3生成物はent-sandaracopimaradieneと同じ保持時間, マススペクトルを示した（図 1–21）。
よってnormal CDP–SmDTC3生成物は13Rの立体配置を持つsandaracopimaradiene（図 1–18）であ ると決定した。
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図1–5SmKSのcDNA配列と推定アミノ酸配列
813 GTG CAT ATG CTT GAA GCG TTT CAT GAC CGT CCA AAG TGG CAA CGT 857 225 V H M L E A F H D R P K W Q R 239 858 CTT CTC AGA TAT CAA AGT AGC AGT GGA TCT TTA TTC TCT GTA ACA 902 240 L LR Y Q S SSG S L F S V T 254 903 CTG ACG GCG TGC GCG TAC ATG CAC ACT GGA GAC AGA AAG TGC CTT 947 255 L T A C A Y M H T G D R K C L 269 948 CGT TTC CTA AAC GGT CTT CTTGAG GGC CCA TTG ACC AAA CCA AAC 992 270 R F L N G L LE G P L T K P N 284 993 AAG AAC TTG AGT CAG CTG CTGCGA CTT ATA GAC TGG CTT GAG CAT 1037 285 K N L S Q L LR L I D W L E H 299 1038 CTG GGA ATC GAA AGG TTC TTT GAG AAA GAC ATC GAG CAA ACA TTG 1082 300 L G I E R F FE K D I E Q T L 314 1083 ATT CAA GCT TTC AGA TTT TGG AGG GGA AAT GCC GCA GGT AGC GGA 1127 315 I Q A F R F W R G N A AG S G 329 1128 AGG CAA CAACAT CTA AAA AGC TTT GAA GAT TCT GCT CTT TTG TTC 1172 330 R Q QH L K S F E D S A L LF 344 1173 CGG ATT CTT CGTCGTCAT GGC TAC GAA GTC TCC CCA GAC GTG CTA 1217 345 R I L R RH G Y E V S P D V L 359 1218 CAT CAA CGA ACA TTC TGC GAG ACA CGC GAT TTA AAG GAG CTG TCT 1262 360 H Q R T F C E T R D L K E L S 374 1263 TTA GCA TCA CAT TTT CTC TTT CCT AGT GAA AGC AGA AAA ATG CTA 1307 375 L A S H F L F P S E S R K M L 389 1308 GAC TCG ATT CCA ATC ATT GAT GTC GCG AAC CAA GAG ACG ACGTTT 1352 390 D S I P I ID V A N Q E T TF 404 1353 CCA TGG TAT AGT ATA CCG CAT CGG GTC CAG CAC ATT GAG TAC ATG 1397 405 P W Y S I P H R V Q H I E Y M 419 1398 ACT AAA TTT ATG GCA AGT ATG GAT TCC ATA AGC ATG AGT GAA CGT 1442 420 T K F M A S M D S I S M S E R 434 1443 GCT TCG TTA CTG GCC TTC ACA AAG TTC GAC TTC AAT GCT TGC CAG 1487 435 A S L LA F T K F D F N A C Q 449 1488 AAG ATC TAT CAG TCG GAT TTG CAG CGC GTT ATG AGG TGG AAC GGA 1532 450 K I Y Q S D L Q R V M R W N G 464 1533 GAG TGC GAC TTC GGA CGT CTG GGT TTT GCC CGA CAG AAA GAA GTG 1577 465 E C D F G R L G F A R Q K E V 479
1 TG 2 3 CAG AAG GTC TGG AAT TGT TAA CAG TCA AAT TGA GAC TTG AAA TAC 47 48 ACA GGA ACG CAA ACT GGC GCA GTA ATC CAT GCC CTC TCT CCA TTT 92 93 GGC GGT CTT GTC AAA GAA CAA AGT GGC CTC TAA CTG GCT GTG GCA 137 138 AGG ATG AGT TTT AGT GCT ATA CAA ATT TCT AGC GGC TTC TTCACG 182 M S F S A I Q I S SG F FT 183 CAA GAC AAC AAG ATC AAG TAT TTT CAC TCC GAT AGA CGC TCC AAG 227 15 Q D N K I K Y F H S D R RS K 29 228 GCT CTG AAT GTG GGC TCT TTC ACC CAA TTC TCA GCA GGC CTT GTG 272 30 A L N V G S F T Q F S A G L V 44 273 CTG AGA GCT GGA CGA GAA GTT CAT GGT ACT CTC AGC ATT CAG TCC 317 45 L R A G R E V H G T L S I Q S 59 318 CAT CTG TCA AGC AAA GAG AGC ACT ATC AAG AAGCTG TTT GCT GGC 362 60 H L S SK E S T I K KL F A G 74 363 GTG AAC GAT GCT TCC GGC TTC TCA GCT TAC GAC ATG GGA TGG ATT 407 75 V N D A S G F S A Y D M G W I 89 408 GCT CGA ATA CCT CAT GCT CAT AAC CCA GAA CTT GGA CCC CAG TTT 452 90 A R I P H A H N P E L G P Q F 104 453 CCT CGG AGC TTG GAA TGG ATC GTT CAC AAC CAG TGC GAG GAT GGG 497 105 P R S L E W I V H N Q C E D G 119 498 TCC TGG GAT CAA GGA GAA GAAGAT GTT CAA CGG GTT TGC AGC ACA 542 120 S W D Q G E ED V Q R V C S T 134 543 CTA TCG TGT GTC ACT GCT CTG AAA ACA TGG AAC CGA GGG GAG TGT 587 135 L S C V T A L K T W N R G E C 149 588 AGC ATC CAA AGA GGT GTA AGC TTT TTA ATG TCT CGG CTG CCA CTA 632 150 S I Q R G V S F L M S R L P L 164 633 GTT CAC AAT AAA CTT ACA AAA GAC ACG AAA GCC ATC TTG CAT AGA 677 165 V H N K L T K D T K A I L H R 179 678 TTATTACAA GAG GGC AAA TCA TTG GAT TTG GAG CTG AAT TAT GAC 722 180 L LQ E G K S L D L E L N Y D 194 723 GAA TCT TTT GTT CAA CAT ATT TGT GAA CAG GGT CAG GAA TTT CTT 767 195 E S F V Q H I C E Q G Q E F L 209 768 CAG AGG GTA TCA AAT GAC GCG TTG GAG CAG TAT CCG ACC TCT TTC 812 210 Q R V S N D A L E Q Y P T S F 224