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Figurel8NTHiup‑regulatesTLR2，ｂＩＩｔｎｏｔＴＬＲ４，inhumanepithelialcells．Ａ）Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＬＲ２ａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌwasmeasuI･ｅｄｂｙＲＴＰＣＲｉｎＮＴＨｉ−ｌｒｅａｔｅｄａｎｄｕｎｔｌ･eated h u m a n c e I ･ v i x e p i t h e l i a l H e L a c e l l s 、 Ｈ ｅ Ｌ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ Ｉ ･ a n s f e c t e d w i t h h u m a n w i l d ‑ t y p e T L R 2 e x p r e s s i o n p l a s m i d ( / ' 九 R 2 ) s e I ･ v e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l f o l ･ T L R 2 e x p r e s s i o n , w h e r e a s c y c l o p h i l i n w a s u s e d a s

acontI･ｏｌｆｂｒａｍｏｕｎ１ｏｆＲＮＡｕｓｅｄｉｎｅａｃｈｒeacljon，RTwaseithel･includedol･notincludedinRT reactionstoassuｒｅｔｈａｔｔｈｅＴＬＲ２ＰＣＲｐＩ･oductsl･esultfromcDNA､ｂｕｔｎｏｔｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，RT‑PCR

a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t i n d u p l i c a t e . Ｂ ) N T H i u p ‑ r e g u l a t e s T L R 2 m R N A i l l H e L a c e l l s i n a t i m e ‐

depelldentmanner､ＴＬＲ２ｍＲＮＡｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙＩ･eal‑timequantitativePCR・Similarresultswere alsoobservedｉｎＮＨＢＥ(primaryhLlmanairwayepithelial)cells.Ｃ)Real‑timequantitativePCRwas pelfol･medtoconfiI･mup‑regulationofTLR2atmRNAlevelinHel̲a､ＨＭＥＥＣ−ｌ（humanmiddleear epithelial),ａｎｄＮＨＢＥｃｅｌｌｓ､TLR2mRNAlevelswerenormalizedtothelevelofcyclophilinthat servedasanintemalcontI･olfOrtheamountofRNAusediI1eachreaction.Ｄ）ＮＴＨｉｓｔｌ･onglyup‐

regulatesTLR2,butnotTLR4inHeLacells,asassessedbyreal‑timequantitativePCR.Ｅ)NTHi alsoup‑regulatesexI〕ressionｏｆＴＬＲ２ａｔｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌａｓａｓｓｅｓｓｅｄbyWestemblotanalysis・HeLa cellswel･ｅｔｌ･eatedwithandwithoutNTHifo１．５ｈｒ､ProteinlysatesweI･ethenaI1alyzedbyWestem blottingusinganti‑hTLR2antibody（H‑l75)．EqualamountsofproteinsweI･eloaded、HeLacells transfectedwithhumanwild‑typeTLR2expressionI〕lasmid（TLR2)servedasapositivecontrolfOl・ TLR2expression､Similarresultswerealsoobsel･ｖｅｄｉｎＮＨＢＥｃｅｌｌｓ．

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第２項NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現上昇機構におけるIKK‑IKBa‑NF‑KB経路の

関 与

第２章で示したように，ＮＴＨｉの上皮細胞への感染は，IKK‑IKBa‑NFKB経路を活性 化させる．そこで，本項では，この経路が，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現上昇に 関与するか否かを検討した．Ｆｉｇｍ℃19Ａに示すように，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子 の発現上昇は，NF‑KB阻害作用を有するCAPE98およびMG‑l3239の前処置により阻害 された．さらに，ＩＫＢａのリン酸化部位の変異体(IKBa32/36)を過剰発現させ，NF‑KB の作用を阻害しても，ＴＬＲ２遺伝子発現上昇は抑制された(Figu正１９A)．これらの結果

より，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子の発現上昇には，NF‑KBの活性化が関与している ことが明らかになった．次に，上皮細胞においてNF‑KBがＴＬＲ２遺伝子の発現を正に 制御するか否かを直接的に証明するため，NF‑KBの構成サブユニットで転写活性化能

を持つｐ６５サブユニットを細胞内に導入し，TLR2遺伝子の発現が誘導されるか否かを 検討した．まず，ｐ６５をＨｅＬａ細胞に導入した際，実際にNF‑KBの活性化は誘導され

るか否かについてNF‑KBレポーター遺伝子を用いて検討した．その結果，ＮＴＨｉの感

染によってNF‑KB依存性プロモーター活性は，ｐ６５導入量依存的に大きく増加した (Fi９，℃１９B)．そこで，ｐ６５導入によるＴＬＲ２遺伝子の発現変化を定量的RT‑PCRによ り検討した．その結果，Figurel9Cに示すように，ＴＬＲ２遺伝子の発現量は，ｐ６５導入

量依存的に大きく増加した．

最後に，ＮＦＫＢ活性化における重要な上流分子であるＩＫＫ６の関与を明らかにする

ため，１KKβのドミナントネガティブ変異体１１KKβ（K44A)１の発現でNTHi誘導性

TLR2発現誘導が影響を受けるか否かを検討した．Figu唾１９，に示すように，１KKβ

(K44A）の細胞への導入は，ＴＬＲ２発現誘導を抑制したことから，NF‑KBの上流分子で あるIKK6もNTHi感染に伴うTLR2遺伝子発現の誘導を正に制御することが明らかに

なった．したがって，ＮＴＨｉ感染に伴って上昇するＴＬＲ２遺伝子の発現には，１ＫK‐

IKBa‑NFKB経路が関与していることが示唆された．

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Figu1℃１９IKK‑IKBa‑dependenttransl0catｉＯｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ−ＫＢｉｓ正qui正ｄｆｍ・

NTHi‑inducedTLR2up‑regulati⑪､．Ａ）ＣＡＰＥ，MG‑l32，ａｎｄｏｖｅ肥xpressionofa transdominantmutantoflKBainhibitNTHi‑inducedTLR2up‑regulationinHel‑acells・Similar rEsultswe1℃alsoobservedinNHBEcells.Ｂ)ａｎｄＣ)OveI℃xpressionofwild‑typep65induces NF‑KBactivation（B）ａｎｄＴＬＲ２ｍＲＮＡ（C）inadose‑dependentmannerinHeLacells,Ａｌｌ 妃al‑timequantitativePCR1℃actionswerecarriedoutinduplicate,Valuesa肥theｍｅａｎ±Ｓ､，.；

〃＝３.ＣＯﾉV,control．Ｄ）Overexp肥ssionofadominant‑negativemutanｔｆｂｎｎｏｆｌＫＫＩＩＫＫ (K44Ａ)labmgatedNTHi‑inducedTLR2up‑regulationinHeLacells､Similarresultswe肥also

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第３項NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現上昇機構におけるＭＫＫ３/6‑ｐ３８ＭＡＰキナ

ーゼ活性化経路の関与

第２章で示したように，ＮＴＨｉの上皮細胞への感染は，IKK‑IKBa‑NF‑KB経路のみ

ならず，ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路をも活性化し，本経路により相乗的にNF‑KBの活性化 を誘導するs８．そこで，本項では，NTHi感染によるMKK3/6‑ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化 経路が，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現上昇に関与するか否かを検討した．まず，

ｐ３８ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤であるピリジニル誘導体SB203580を前処理した場 合のＮＦＫＢプロモーター活性を調べた．その結果，興味深いことに，SB203580は濃

度依存的にNTHi誘導性TLR2遺伝子発現上昇をさらに増強した(Figure20A)．また，

ｐ３８ＭＡＰキナーゼαおよびβ２のドミナントネガティブ変異体であるfP38α(AF)およ びfp38β２(AF)を過剰発現させた場合も，NTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現上昇を増強し た（Fi9,℃２０B)．一方，野生型ｐ３８ＭＡＰキナーゼαおよびβ２を導入した場合は，

TLR2遺伝子発現上昇は増強されず，むしろ抑制した(Figu正２０B)．最後に，ｐ３８ＭＡＰ

キナーゼの上流に存在するキナーゼMKK3，ＭＫＫ６の関与を調べるため，MKK3/６の

ドミナントネガティブ変異体であるMKK3b(A)およびMKK6b(A）をHeLacellsに強

制発現させた(Figu正２０C)．その結果，どちらのドミナントネガティブ変異体もＮＴＨｉ

感染に伴い誘導されるＴＬＲ２遺伝子発現上昇を促進した．これらの結果より，NTHi感

染によって活性化されるＭＫＫ３/6‑ｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路は，NTHi感染に伴い誘導さ

れるＴＬＲ２の発現上昇を負に制御している可能性が示唆された．

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…画ｐ38画KAnp38画AF》Ｐ３8基MmP③802岬W、

Ｆｉｇｕ正２０ActivationofMKK3/6‑p３８／MAPkinasepathwayisnegativelyiIw0lvedin NTHi‑inducedTLR2expression.Ａ)SB203580greatlyenhancesNTHi‑inducedTLR2up‐

IEgulationinHeLacellsinadose‑dependentmanner.Ｂ）Ove1℃xpressionofadominant‐

n e g a t i v e m u t a n t f b r m o f e i t h e r p 3 8 a I p 3 8 α ( A F ) l ｏ ｒ p 3 8 6 2 I p 3 8 1 3 2 ( A F ) l a l s o e n h a n c e s ，

whe肥asoverexpressionofawild‑typep38aorp38132肥duces,theNTHi‑inducedTLR2 expにssioninHeLacells.Ｃ)Overexpressionofadominant‑negativemutantfbrmofeither MKK3IMKK3b(Ａ)ｌｏｒＭＫＫ６１ＭＫＫ６ｂ(Ａ)lenhancesNTHi‑inducedTLR2up‑regulation inHeLacells.Allreal‑timequantitativePCRI･eactionswerecarriedoutinduplicate､values

第４項NTHi誘導性TLR2遺伝子発現誘導に対するdexamethasoneの影響

Dexamethasoneに代表されるグルココルチコイド製剤は，後半に使用されるステロイ ド性抗炎症薬である 2 、その抗炎症作用の実体は，炎症性サイトカインの発現誘導に 重要な転写因子を阻害することによるものであり，主として，転写因子NF‑KBの阻害 によるものと考えられる 、本章において著者は，ＮＴＨｉ感染に伴いTLR2の発現が上 昇することを見いだし（第１項），その発現上昇のシグナリングにＮＴＨｉ感染によっ て誘導されるNF‑KBの活性化が必要であることを明らかにした（第２項）．したがっ て，NF‑KB阻害作用を有するグルココルチコイド製剤dexamethasoneの上皮細胞への 処理は，NTHi感染に伴い上昇するＴＬＲ２遺伝子発現を抑制できる可能性がある．そこ で，本項では，dexamethasoneによって，NTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇作用が 抑制されるか否かを検討した．

まず，dexamethasone(DEX）をHeLa細胞に前処理し，NTHi誘導性のNF‑KBの活性 化を抑制できるか否かをNF‑KBプロモーター活性を調べることで検討した．その結果，

過去の報告と同様に，ＤＥＸは濃度依存的にNTHi誘導性のNF‑KBの活性化を抑制した

(Figu正２１Ａ)．次に，本条件において，NTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇作用が抑

制されるか否かを，ＴＬＲ２特異的プライマーを用いた定量的RT‑PCR法を用いて検討し た．その結果，予想に反して，NTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇作用は，ＤＥＸ前

処理によって増強され，その作用は，濃度依存的であった（Figure21B)．さらに，こ

のＤＥＸによるNTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇の増強作用が，ＴＬＲ２蛋白質発現

にも影響を与えているか否かをWestemblotting法により確認した．その結果，Figure

21Ｃに示すように，ＤＥＸはNTHi誘導性のＴＬＲ２蛋白質発現の上昇をも増強した．

DEX・0.1Ｐ鮒１ＰＢＱ１０Ｐ股

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Fｉｇｍｅ２１GlucocoIticoidssynergisticallyenhanceNTHi‑inducedTLR2up‐

regulation．Ａ）GlucocorticoidsattenuatedNTHi‑inducedNFKBactivationHeLacells ｗｅ肥tmnsientlytmnsfectedwithanNF‑KB‑regulatedlucifeIasereporterconstructandwere thenpret肥ａｔｅｄｗｉｔｈｌＵＭＤＥＸｆｂｒ２ｈｒｂｅｆｂ肥beingstimulatｅｄｗｉｔｈＮＴＨｉｆｂｒ３ｈ眼 LuciferaseactivitywasthenassessedinNTHi‑treatedandunt肥atedcells，Valuesarethe means±ＳＤ;〃＝３.ＣＯﾉV,contIol.Ｂ）DEXsyneIgisticallyenhancesNTHi‑inducedTLR2 up‑1℃gulationatthemRNAlevelinHeLaceIlsinadose‑dependentmanne砿Similar肥sults werealsoobservedinＮＨＢＥａｎｄＨＭＥＥＣ−ｌｃｅｌｌｓ.Ｃ）ＤＥＸ（ｌＵＭ）alsosynergistically enhancesNTHi‑inducedTLR2up‑regulationatproteinlevelinHeLacellsasassessedby Westemblotanalysisusinganti‑hTLR2antibody（ＩＭＧ‑319)．Equalamountsofpmteins

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ことが報告されている"･６５．そこで，ＤＥＸによるNTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇 の増強作用が，ＧＲとの結合を介したものであるか否かを検討した．まず，ＤＥＸがＧＲ に結合するのを阻害する桔抗薬であるRU4866sを処理することでＤＥＸによるNTHi誘

導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇の増強が抑制されるか否かを検討した．Ｆi９，℃２２Ａに示

すように，ＧＲ桔抗薬RU486のＨｅＬａ細胞への前処理は，ＤＥＸによるNTHi誘導性の TLR2遺伝子発現上昇の増強を完全に抑制した．次に，上述したＤＥＸの作用において ＧＲが関与していることをさらに確認するため，ＨｅＬａ細胞にＧＲ発現プラスミド

(phGR）を導入し，ＮＴＨｉ感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現上昇作用が増強されるか否かを 検討した．その結果，ｐｈＧＲのＨｅＬａ細胞への導入は，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子 発現の上昇をさらに増強した（Figure22B)．これらの結果より，ＤＥＸは，細胞内に存

在するＧＲを介してNTHi誘導性TLR2遺伝子発現誘導を増強することが示唆された．

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第５項ＤＥＸによるNTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現誘導促進メカニズム

前項より，ＤＥＸは細胞内に存在するＧＲを介してNTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現誘 導を促進することが明らかになった．しかしながら，その詳細なメカニズムは明らか

ではない．興味深いことに，ＤＥＸと同様に，ｐ３８ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤である

ピリジニル誘導体SB203580はNTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現上昇をさらに増強した

(第３項)．すなわち，NTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇を負に調節するｐ３８ＭＡＰキ

ナーゼの阻害によるＴＬＲ２遺伝子発現上昇の増強作用は，ＤＥＸによるNTHi誘導性の

TLR2遺伝子発現上昇の増強作用と類似している．また，近年，ＤＥＸがｐ３８ＭＡＰキナ

ーゼの活性化を阻害するという興味深い知見も報告された"、これらの知見に鑑み，本

項では，ＤＥＸが，NTHi誘導性のＴＬＲ２遺伝子発現上昇を負に調節するｐ３８ＭＡＰキナ

ーゼ経路を抑制し，その結果，ＴＬＲ２遺伝子発現上昇を増強したのではないかという仮 説を立て，その可能性を検討した．

まず，ｐ３８ＭＡＰキナーゼの特異的阻害剤SB203580によるNTHi誘導性TLR2遺伝子

発現上昇の増強に対して，ＤＥＸがどのような影響を与えるかを検討した．Figure23A

に示すように，SB2035805UMの前処理およびＤＥＸｌｌＬＭの前処理において，NTHi誘

導性ＴＬＲ２遺伝子発現上昇は，同程度増強された．しかしながら，SB203580および D E X の 併 用 処 理 は ， そ れ ぞ れ 単 独 の 作 用 を さ ら に 増 強 す る こ と は で き な か っ た

(Figu1℃２３A)．しかしながら，SB2035805UMおよびＤＥＸｌＵＭという濃度は，ＴＬＲ２

遺伝子発現誘導増強作用においては比較的高濃度であり，併用投与による増強作用が

確認できなかった可能性がある．そこで，それぞれの薬物を低濃度（SB2035800､ｌＵＭ

およびＤＥＸＯ・ｌＵＭ)で単独または併用処理し，NTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現誘導作用

にどのような影響を与えるかを確認した．その結果，Figure23Bに示すように，

SB2035800・ｌＵＭおよびＤＥＸＯ・ｌｕＭ単独によりNTHi誘導性ＴＬＲ２遺伝子発現誘導は 増強され，また，それぞれの併用によって，さらに増強された．しかしながら，併用 による増強作用は，それぞれ単独による増強作用を，相乗的ではなく相加的に増強し

たものであったことから，ＤＥＸの作用点は，ｐ３８ＭＡＰキナーゼの抑制によるものであ る可能性が示唆された(Fi９，℃23B)．そこで，次に，ＤＥＸがｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性

化を抑制することで，NTHi感染に伴うＴＬＲ２遺伝子発現誘導を増強するか否かを検討

するため，ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化の指標であるｐ３８ＭＡＰキナーゼリン酸化状態を DEX処理下において検討した．抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を用いたWestem blottingの結果より，NTHi感染によって誘導されたｐ３８ＭＡＰキナーゼのリン酸化は，

ＤＥＸ前処理で抑制された（Figm℃２３C)．また，ＤＥＸによるｐ３８ＭＡＰキナーゼリン酸

化抑制作用は，ＧＲ桔抗薬RU486の作用によりレスキューされ，そのリン酸化レベル

はNTHi単独処理時と同様であった(Figure23C)．以上，本項で得られた結果を小括す ると，ＤＥＸは，NTHi感染に伴い活性化されるｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路の活性化をＧＲ

依存的な作用により抑制し，その結果，TLR2遺伝子発現上昇を増強することが明らか

になった．

ドキュメント内 寧 宇 デ 声 : ﾉ (ページ 58-76)