のXXXXのXXの(のrepresentsanaromaticaminoacid）
Fig.５７ＴＬＲ１,２，４and5havetheCaveolin‑bindingmotifSconsistwithのＸＸＸＸ①ＸＸの (の1℃presntsanaromaticaminoacid）
らの両分子が強く相互作用するためには，単にcaveolin‑lとＴＬＲ４が存在するだけでは 不十分であり，その他にＣＤｌ４分子が存在することが必要であると考えられる．ＣＤｌ４
Ｆ Ｖ Ｑ Ｓ Ｅ Ｗ Ｃ ● ● Ｈ Ｙ
Ｆ Ｖ Ｋ Ｓ Ｅ Ｗ Ｃ ■ ● Ｋ Ｙ
Ｉ」 Ｌ Ｋ ， Ｐ Ｌ Ｃ Ｋ ■ Ｒ Ｆ
Ｆ Ｉ Ｑ Ｓ Ｒ Ｗ Ｃ ■ ■ Ｉ Ｆ
Ｆ Ｌ Ｒ ， Ｇ Ｗ Ｃ Ｌ Ｅ Ａ Ｆ
第 ５ 節 小 括
本研究では，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下に関わるメカニズムの解明を 種々の方法を用いて行った．
まず，ＬＰＳ認識に重要なTLR4，ＭＤ−２およびＣＤｌ４を安定発現するＣＨＯ細胞 (TLIWMD‑2/CDl4‑CHO)，ＴＬＲ４およびＭＤ−２を安定発現するＣＨＯ細胞(TLR4/MD‑2‐
CHO)におけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下に関する検討をflowcytometIy
およびビオチン化法によって行った．その結果，TLR4/MD‑2/CDl4‑CHOにおいて，LPS誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下が顕著に引き起こされた．一方，TLR4/MD‑2‐
CHOにおけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下作用が引き起こされなかった ことから，本作用には，ＣＤｌ４の存在が必須であることが示唆された．また，ＬＰＳは，
TLR4のみでなく，その会合分子として知られるＭＤ−２蛋白質の膜上発現低下作用も 有しており，この作用においても，ＣＤｌ４の存在が必須であることが示唆された．
次に，ＴＬＲ４蛋白質の形質膜上発現低下作用が，ＬＰＳ耐性を引き起こすか否かに関 して検討した．TLR4/MD‑2/CDl4‑CHO細胞に，ＬＰＳ低濃度処理を行い，ＴＬＲ４蛋白質 の形質膜上発現を低下させ，その後，二度目のＬＰＳ刺激によるＩＫＢａの分解および
IKBaのリン酸化をWestemblottingにより検討した．その結果，本細胞において，
度目のＬＰＳ刺激によるＩＫＢａの分解およびIKBaのリン酸化は強く抑制された．また，
IL‑8promoter活性化を指標としてTLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHOおよびTLR4/MD‑2‑CHOの
両細胞におけるＬＰＳ耐性に関する検討を行ったところ，二度目のＬＰＳ刺激によるＩL‐８pIomoterの活性化は，TLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHO細胞においてのみ，抑制されていた．
これらのことから，TLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHO細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の
膜上発現低下作用は，ＬＰＳ耐性を引き起こす可能性があることが示唆された．
最後に，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下作用がエンドサイトーシスである のか，また，その場合，どのような経路でエンドサイトーシスが引き起こされている のかについて検討した．まず，ＬＰＳによって引き起こされるＴＬＲ４蛋白質の膜上発現 の低下が，エンドサイトーシスを阻害することで知られる低温条件においても引き起 こされたことから，本現象はエンドサイトーシスである可能性が強く示唆された．次 に，clathrinおよびcaveorae介在性エンドサイトーシス阻害剤を用いた検討から，ＬＰＳ によって引き起こされるＴＬＲ４のエンドサイトーシスには，caveoIae介在性エンドサ イトーシス経路が関与していることが明らかになった．さらに，抗ＴＬＲ４抗体および 抗caveolin‑l抗体を用いた免疫沈降法の結果より，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４エンドサイトー シスが引き起こされるTLR4/MD‑2/CDl4‑CHO細胞においてのみcaveolin‑lとＴＬＲ４が 強く相互作用していることが示された．この結果は，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４エンドサイト 一シスの機序にcaveoIae介在性エンドサイトーシス経路が関与していることを裏付け た．
以上，本研究は，ＬＰＳによって引き起こされるＴＬＲ４蛋白質の形質膜上発現低下の 機序にcaveome介在性エンドサイトーシス経路が関与していることを報告した最初の 報告である．また，その作用には，ＣＤｌ４分子の存在が必要であることを，本研究にお いて初めて示した．本研究で得られた結果は，分子生物学的知見に基づいたＬＰＳ応答 制御機構の解明に大きく貢献するものと思われる．
第 ６ 章 総 括
気道上皮および消化管上皮などの上皮細胞は，外界に対して最前線に位置し，外界 からの刺激や異物の排除において重要な役割を担う．これら上皮細胞は，パターン認
識受容体(PRRs：pattemrecognition肥ceptors)であるtoll‑likereceptor(TLR)familyを発現 し，多彩な病原微生物由来の非自己成分の構造（PAMPS：pathogen‑associatedmolecular pattems）を認識し，一連の免疫応答を開始する．TLRfamilyの免疫反応における重要
性は，各種ＴＬＲノックアウトマウスを用いた解析からも明確であり，生体にとっては，病原体感染時のＴＬＲシグナリングの活性化は極めて重要なイベントであるといえる．
一方，ＴＬＲシグナリングを介した宿主細胞の過剰な免疫活性化は，時に重篤な炎症
性疾患を誘発することでも知られる．実際，TLRfamily分子の過剰発現または過剰活 性化が炎症病態の遷延化に寄与しているという報告も多い．したがって，TLRfamily
分 子 の 発 現 の 制 御 機 構 を 解 明 し ， 適 切 に 制 御 す る こ と こ そ が ， 免 疫 制 御 お よ び 抗 炎 症 の 観 点 か ら も 極 め て 重 要 で あ る ． そ こ で ， 本 研 究 で は ， 生 体 防 御 の フ ロ ン ト ラ イ ン で あ る 上 皮 細 胞 に 着 目 し ， 細 菌 構 成 成 分 に 対 す る 炎 症 応 答 反 応 に 関 し て 種 々 の 検 討 を 行 った．まず，上皮細胞に端を発する炎症性疾患の理解を究極の目的とし，中耳炎やCOPＤ 病態増悪に大きく寄与するＮＴＨｉの構成成分が，宿主上皮細胞に対しどのような炎症
応答を惹起させるのか，さらに，その炎症応答に関与するTLRfamilyの同定を行った
(第２章)．その結果，NTHiは，ヒト上皮細胞において，「NIK‑IKKα/β依存性IKBαリ
ン酸化および分解経路」および「MKK3/6‑ｐ３８ＭＡＰキナーゼリン酸化経路」の２つの
経路を介してNF‑KBを活性化させた．また，NTHiは，ＴＡＫｌを介して，両方の経路を活性化させていることが示唆された．さらに，ＴＬＲ２が，ＮＴＨｉ感染によるＮＦＫＢ の活性化に必要であることが明らかとなった．最後に，NTHi外膜構成リポタンパク質 であるＰ６が，NF‑KBを活性化させ，この活性化は，NTHi感染によりおこるNF‑KBの
活性化と同様の経路を介して起こることが示唆された．
また，第２章によりＮＴＨｉ感染シグナリングにおいて重要であることを明らかにし た受容体ＴＬＲ２遺伝子の発現が，NTHi感染時にどのような制御を受けるのか，宿主の シグナル伝達経路機構に着目して明らかにした(第３章)．その結果，NTHiによって活
性化されるIKKl3‑IKBα依存性のNF‑KB活性化経路が，ＮＴＨｉによって誘導される
TLR2遺伝子の発現上昇において重要であることが明らかになった．さらに，興味深いことに，NTHiによって活性化されるMKK3/６依存性のｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化経路
が，NTHiによって誘導されるＴＬＲ２遺伝子の発現上昇を負に調節していることが明ら か に な っ た ． 次 に ， 従 来 か ら 強 力 な 抗 炎 症 薬 と し て 知 ら れ る グ ル コ コ ル チ コ イ ド 製 剤 dexamethasone(DEX)の，ＴＬＲ２発現上昇への影響を調べた．興味深いことに，ＤＥＸの 投与は，NTHi感染によって誘導されるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現誘導を増強し，その作用 はグルココルチコイド受容体（GR）を介することが示唆された．また，ＤＥＸ処理は，NTHi誘導 性ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化を抑制し，その結果，ＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現誘導
を増強することが示唆された．さらに，中耳炎患者における中耳上皮組織のＴＬＲ２の 発現量は，健常者におけるそれに比べ，高いことが明らかになった．下気道性炎症性の重篤な遺伝性疾患である嚢胞性線維症(ＣＦ：cysticfibrosis）患者由
来の上皮細胞におけるＴＬＲリガンド応答性およびＴＬＲｆａｍｉｌｙの遺伝子発現量を比較
し ， そ の 発 現 調 節 機 構 の 解 明 を 行 っ た （ 第 ４ 章 ） ． そ の 結 果 ， 健 常 人 由 来 の l6HBEl4o‐細胞に比べ，ＣＦ患者由来のCFBE41o‐細胞におけるＴＬＲ２の発現およびPGN応答性が上昇していることが示された．正常型ＣＦＴＲを恒常的に発現するＣＦ気 道上皮細胞（CFBE41o‑/WTLCFTR）を作製し，その表現系を確認したところ，
CFBE41o‑/WTLCFTR細胞は，CFBE41o‑細胞に比べ，ＴＬＲ２の発現が低く，ＰＧＮ応答 性が減少した．
次に，ＣＦ気道上皮細胞におけるTLR2発現上昇のメカニズムを解明することを目的 とし，種々検討した結果，ＣＦ細胞におけるエピジェネテイック遺伝子制御機構(DNA メチル化）の破綻が関与している可能性を示すことができた．bisulfiteを用いた
sequence法によりl6HBEl4o‑細胞およびCFBE41o‑細胞におけるＴＬＲ２プロモーター
領域のＤＮＡメチル化を数値化したところ，CFBE41o‑細胞において，顕著に脱メチル 化されていることを見い出した．最後に，上皮細胞におけるＴＬＲシグナリング抑制機構の解明の一端として，敗血 症の重要な起因物質であり，グラム陰性菌外膜主要構成分子であるＬＰＳに着目し，
LPS刺激がその受容体であるＴＬＲ４蛋白質の形質膜上発現量をどのように低下させる かについて，そのメカニズムの解明を行った（第５章)．その結果，TLR4，ＭＤ−２お よびＣＤｌ４を安定発現するＣＨＯ細胞(TLR4/MD‑2/CDl4‑CHO)において，ＬＰＳ誘導性 TLR4蛋白質の膜上発現低下が顕著に引き起こされた．一方，TLR4，ＭＤ−２を安定発 現するＣＨＯ細胞(TLR4/MD‑2‑CHO）におけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低 下作用が引き起こされなかったことから，本作用には，ＣＤｌ４の存在が必須であるこ とが示唆された．また，ＬＰＳは，ＴＬＲ４のみでなく，その会合分子として知られる ＭＤ−２蛋白質の膜上発現低下作用も有しており，この作用においても，ＣＤｌ４の存在が 必須であることが示唆された．さらに，種々の検討の結果，TLR4/MD‑2/CDl4‑CHO 細胞におけるＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下作用は，ＬＰＳ耐性を引き起こす
可能性があることが示唆された．最後に，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の膜上発現低下作 用がエンドサイトーシスである可能性を強く示唆し，caveome介在性エンドサイトー
シス経路が関与していることが明らかになった．