EOR誘導剤の作用部位をFigure34に示す．
その結果，両細胞ともＥＲストレスにより誘導されてくるＣＨＯＰｍＲＮＡの発現誘導
はみられたが(Figu唾３５C,Ｄ)，l6HBEl4o‑細胞においてＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現上昇はみ
られなかった（Figure35A,Ｂ)．また，末処理でl6HBEl4o‐細胞とCFBE41o‐細胞の
ＣＨＯＰｍＲＮＡの発現に変化がみられないことから，CFBE41o‑細胞ではＥＲストレス自 体も起こっていないことが示唆された．ＢＫ
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Protein AccumuIation
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intermediates（ＲＯＩ)，whichactivatetranscriptionfactornuclearfactor‑KB（ＮFKB)．A c t i v a t i o n c a n b e b l o c k e d b y a n t i o x i d a n t s a n d b y C a 2 ＋ c h e l a t o r s , ｏ ｒ ｉ ｔ ｃ ａ ｎ ｂ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｄ ｒ ｕ ｇ ｓ ｔ ｈ ａ ｔ ｃ a u s e a n a c t i v e r e I e a s e o f C a 2 + ｆ ｒ ｏ ｍ Ｅ Ｒ ・ N F ‑ K B i n d u c e s t r a n s c r i p t i o n o f g e n e s
involvedininflammatoryandimmuneresponses､ＣＰＡ,cyclopiazonicacid．u p ‑ r e g u l a t i o n ？
(ＨＥｌＫＥＬ,PAHLPhjsoﾉoacaﾉReWew,2002）
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の 影 響
以前，本研究窒では，中耳炎やＣOPDの原因鮒であるNTHi感染では，NF‑KBの活 性 化 を 介 し て Ｔ Ｌ Ｒ ２ の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と を 報 告 し た ． ま た ， い く つ か の 研 究 グ ル
−プにより，ＣＦ気道上皮細胞における恒常的なNFLKBの活性化が報告されている．
そこで，ＣＦ肺上皮細胞における先天的なＴＬＲ２の発現上昇は，内因性のNFLKBの活 性化によるものであるか否か，NFLKBを阻害するはたらきのあるＩＫＢａドミナント変 異体'6およびNF‑KBシグナル上流分子であるＮＩＫのドミナント変異体を過剰発現させ て検討した．
その結果，Figure36に示すようにCFBE41o‑細胞において，NF‑KB阻害作用をもつ
変異体過剰発現によるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現に対する顕著な抑制効果はみられなかった．このことから，ＣＦ肺上皮細胞における先天的ＴＬＲ２の発現上昇には，NFLKB活性化経 路 は 関 与 し て い な い こ と が 示 唆 さ れ た ．
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第 ４ 項 Ｃ Ｆ 気 道 上 皮 細 胞 に お け る Ｔ Ｌ Ｒ ２ 先 天 的 発 現 上 昇 に 対 す る Ｎ Ｆ Ｋ Ｂ 活 』 性 化 経 路
０８６４２０
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第５項５−azacytidineによるＤＮＡの脱メチル化とTLR2発現上昇
最近，Haehnelらによって，ＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域に関する研究報告がなさ れた７６．その論文によると，ＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域は，ＤＮＡメチル化を受け
やすいＣｐＧ配列(5,‑CG‑3,)が多く存在し(Figm℃25)，この領域の多くがメチル化を受
けるとＴＬＲ２遺伝子の発現は低下するということである．ＤＮＡのプロモーター領域の メチル化は，遺伝子発現制御の大きな指標であり，プロモーター領域にメチル化があ ると，最終的にＤＮＡのクロマチンリモデリング(DNAの立体構造変化)を起こし，メ チル化のあるプロモーター領域の遺伝子発現を抑制することが知られている 、そこ で，一般的にＴＬＲ２の発現が低いことが報告されている気道上皮細胞であるＡ549細胞をＤＮＡメチル化阻害剤５−azacytidine(5‑AC)処理死し，ＴＬＲ２遺伝子発現の上昇が見ら
れるか否かについて検討を行った．その結果，５−ＡＣ処理濃度依存的に，Ａ549細胞に おけるＴＬＲ２の発現は上昇したことから，Ａ549におけるＴＬＲ２の発現は，ＴＬＲ２プロモーター領域のメチル化によって制御されていたことが示唆された（Fi９，℃３７A,Ｂ)．
そこで，正常気道上皮細胞とＣＦ気道上皮細胞におけるＴＬＲ２ｍＲＮＡ発現がＡ549細胞 と同様にＴＬＲ２プロモーターのメチル化によって制御されているか否かを半定量的 RTzPCR法により検討した。その結果，興味深いことに，l6HBEl4o‑細胞では，５−AＣ の濃度依存的にＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現上昇がみられ，一方，CFBE41o‑細胞では，ＴＬＲ２
ｍＲＮＡ発現は変化させなかった（Figure37C)．また，l6HBEl4o‐細胞における５−AＣ
によるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現上昇は，定量的RTLPCR法によっても確認できた(Fi９，℃37,)．
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ResultsI･epresentthemean±SDfromexpeI･imentspeI･fol･medinduplicate．
FigIIre37Pretreatmentofl6HBE14o‑cellswith5‑azacytidine(5‑ＡＣ)increases TLR2expressioninA549andl6HBE14o‑cells.Ａ),Ｂ)ExpressionofTLR2induced by5‑azacytidine（5‑ＡＣ）inA549cells・TheexpI･essionofTLR2atmRNAlevelwas measul･edbysemiquantitativeRTPCRinA549cellstI･eatedwithDMSO（ＣＯＮ)ｏ１．５‐
AＣ（l‑lOlJLM)fo１．２４ｈｒ(Ａ).RelativeTLR2mRNAexpI･essionlevelswerenoImalized
tothｅｌｅｖｅｌｏｆＧＡＰＤＨｔｈａｔｓｅｌ･vedasanilltel･nalcontrolfbrtheamountofRNAusedin
eachreaction（Ｂ)．Ｃ）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＬＲ２ｍＲＮＡｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｓｅｍｉ‐
quantitativeRT‑PCRofRNAisolateｄｆｒｏｍｌ６ＨＢＥｌ４ｏ−ａｎｄＣＦＢＥ４１ｏ−ｃｅｌｌｓat diffel･ｅｎｔｌｉｍｅｓａｆｔｅｒａ７２ｈｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈ５−ＡＣ、ＧＡＰＤＨｅｘｐｌ･essiollwasalso analyzedtoassul･ｅｔｈａｔｅｑｕａｌａｍｏｕｎｔｏｆＲＮＡｗｅｌ･eusedineachreaction・Resultsare I･epresentativeofthl･eeindependentexperiments.Ｄ)ＴＬＲ２ｍＲＮＡｉｎｌ６ＨＢＥｌ４ｏ−ｃｅｌｌｓ ｔｌ･eatedwith5‑AC(５１ＵＭ)fol･７２hrwasdeterminedbyreal‑timequantitativeRTLPCR TLR2mRNAlevelswel･ｅｎｏＩ･malizedtothelevelofcyclophilin（intemalcontrol)．
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次に，５−ＡＣの作用が，直接ＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域の脱メチル化を引き起こ
しているか否かについて検討した．まず，Figu唾３８Ａに示すＴＬＲ２遺伝子プロモータ ー領域のメチル化可能サイト（CpGサイト）２０カ所7 について，ＤＮＡメチル化解析を 行った．ＤＮＡメチル化の検出には，BisulfiteSequencing法を用いた．その結果，
l6HBEl4o‑細胞におけるＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域内の多くのＣｐＧサイトにおけ るメチル化頻度は，５−ＡＣ処理により低下した（Figure38B)．また，検討した全ての CpGサイト２０カ所の平均メチル化頻度を算出すると，５−ＡＣにより低下した（Figure
38C)．すなわち，l6HBEl4o‑細胞におけるTLR2遺伝子プロモーター領域は，５−ＡＣ処 理により直接脱メチル化された．以上，本項の結果を小括すると，正常気道上皮細胞ではＴＬＲ２遺伝子のプロモータ
−のメチル化によりＴＬＲ２ｍＲＮＡ発現は抑制されているが，一方CFTＲ変異細胞では，
何らかの要因によってＴＬＲ２プロモーターが脱メチル化されており，ＴＬＲ２ｍＲＮＡの
発現上昇を引き起こしていることが示された．また，５−ＡＣ処理によりl6HBEl4o‐細 胞におけるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現が，CFBE41o‑細胞レベルまで発現上昇したことから，
CFBE41o‑細胞において脱メチル化を誘導する因子が，TLR2mRNAの発現上昇を引き 起こす大きな要因であることが示唆された．
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