＃；ＬＰＳ

︻凶︲角■戸︼

Figure46Lipopolysaccharide(LPS)andLPSrecognitionmolecules・Thestructu肥ｏｆＬＰＳｉｓｓｈｏｗｎｌｅｆｔ・LPSintheoutermembraneofGIam‑negativebacteriaistmnsferredto CDl4byLPSbindingprotein(LBP).ＬＰＳｉｓ肥cognizedbyTLR4‑MD‑2,whichdeliversa signalthroughtheplasmamembrane・RPlO5‑MD‑lisastructuIallyrelatｅｄｃｏｍｐｌｅｘａｎｄｈａｓａｒｏｌｅｉｎＢｃｅｌｌｒｅｓponsestoLPS・TheextracellulardomainsofCDl4,ＴＬＲ４,andRPlO5 consistofaproteinmotifcalledleucine‑richrepeats（LRR).Thecytoplasmicdomainof TLR4consistsofasignalingdomainsimilartotypelinterleukinlreceptor，called ＣＤｌ４欠損マウスではＬＰＳ低応答性を示し，エンドトキシンショックにも抵抗性とな

￨爾蕊露雨憲詞

Gram‑negativ

Bacteria

戸一両

ｊｌ

ｉｌ

Ｉｉｌ

Ｌ−Ｚ（４

このように，ＬＰＳの認識およびシグナリングには，TLR4，MD‑2，ＣＤｌ４の３分子が重要であることが明らかになり''５１生体の持つＬＰＳに対する適切な免疫応答は，グラム陰性菌に対する自然免疫活性化の観点からも極めて重要である．しかしながら，上述のように，過剰なＬＰＳ応答は時に組織の損傷を引き起こし，エンドトキシンショック様の炎症性疾患を誘発する．したがって過剰なＬＰＳ応答性を抑制することは，抗

炎症の観点からも重要である．興味深いことに，生体は，過剰ＬＰＳ応答に対する防御策をいくつか有しており（ｍｂＩｅ５)，これらの機序を介して，過剰な炎症応答を負に制御するネガテイブレギユレーシヨン機構(LPS耐性)を引き起こす1１８．

亜ble5MechamismsoftolerancetoLPSinmacmphagesj〃wjZｱ℃

Down‑regulationofsuIfaceexpressionofTLR4/ＭＤ−２ｃｏｍｐｌｅｘＵｐ−肥gulationofp50homodimers

InhibitionofIKK

InhibitionofNF‑KBbindingtoDNAbyIKBe,IKB《andOct‑l Down‑IEgulationofIRAK‑lpmteinexpression

InhibitionofdissociationoflRAK‑l/4fromMyD88bylRAK‑M(inactive‑kinaselRAK）

I､hibitionoffUnctionofMyD88byMyD88s(altemativeIysplicedfbrmofMyD88）

SOCS‑l‑mediatedinhibitionofNF‑KBactivationandJAKactivation

第２節本章の目的

ＬＰＳ過剰応答は，組織の損傷を引き起こし，エンドトキシンショック様の炎症性疾

患を誘発する．これらの過剰応答を負に制御するメカニズムの一つに，ＬＰＳ認識受容体であるＴＬＲ４蛋白質の細胞膜上からの発現量低下が報告されている．しかしながら，

LPSによって引き起こされる形質膜上ＴＬＲ４蛋白質の発現低下の詳細については，未

だ明らかでない点が多い．そこで，本章では，ＬＰＳ誘導性ＴＬＲ４蛋白質の発現低下に関わるメカニズムの解明を目的とし，以下に示す４つの観点から分子生物学的検討を行った．

l)TLR4/MD‑2/ＣＤｌ４を過剰発現するＣＨＯ細胞(TLR4/MD‑2/CDl4‑CHO）においてＬＰＳ誘導性形質膜上ＴＬＲ４蛋白質の発現低下が引き起こされるか否か．

2)ＣＤｌ４を欠損するTLR4/ＭＤ−２を過剰発現するＣＨＯ細胞(TLIWMD‑2‑CHO）におい

てLPS誘導性形質膜上ＴＬＲ４蛋白質の発現低下が引き起こされるか否か．

3)LPS誘導性形質膜上ＴＬＲ４蛋白質の発現低下は，ＬＰＳ耐性に関与するか否か．

4)ＬＰＳ誘導性形質膜上ＴＬＲ４蛋白質の発現低下は，どのようなメカニズムを介して引

き起こされるのか．

第３節実験成績

第１項形質膜上のTLR4発現に対するＬＰＳの作用

本研究では，これまでにＴＬＲシグナリングの抑制機構に関して詳細な検討がなされていない上皮細胞において，ＬＰＳ誘導性の形膜上ＴＬＲ４の発現低下が引き起こされるか否か，さらにそのメカニズムについて基礎的な研究を行なった．なお，本研究では，

LPS認識に重要なTLR4，ＭＤ−２およびＣＤｌ４を安定発現するChinesehamsterovary (CHO）細胞(TLR4/MD‑2/CDl4‑CHO)，ＴＬＲ４およびＭＤ−２を安定発現するＣＨＯ細胞

(TLR4/MD‑2‑CHO)，そして，コントロールとして空ベクターのみを遺伝子導入した pDisplay‑CHO細胞を用いて検討を行った．なお，本研究で用いたＣＨＯ細胞は，細胞

内輸送やシグナリングの分野でもっともよく利用される確立された上皮系細胞である．

(1)TLR4/MD‑2/CDl4‑CHOを用いた検討

まず，これまで報告されているＬＰＳ誘導性の形質膜上ＴＬＲ４の発現低下が TLR4/MD‑2/CDl4‑CHOにおいて引き起こされるか否かについて検討するため，ＬＰＳ(

ug/ml）刺激前後の形質膜上に発現するＴＬＲ４の発現量をビオチン化法にて定量した．

その結果，TLR4/MD‑2/CDl4‑CHOにおいて，ＬＰＳ刺激開始から３時間後に形質膜上の

TLR4の発現が低下していることが示された(Figu雁47A)．ＬＰＳ刺激後の形質膜上から

のＴＬＲ４発現量は，無刺激時の約45％であった(Figu正４７B)．次に，ＴＬＲ４抗体を用い

たF1owcytometry(FCM）によりＬＰＳ誘導性の形質膜上ＴＬＲ４の発現低下を検討したと

、饗ご

(Figure47C)．なお，この時ＬＰＳ刺激後の細胞全体でのＴＬＲ４の発現レベルは変化して

いなかったことから，ピオチン化法やＦＣＭによって観察されたＴＬＲ４の形質膜上発現低下は，ＴＬＲ４蛋にI質の分解が促進されたことに起因しないことが示唆された．また，

細胞内に発現するTLR4，ＭＤ−２，ＣＤｌ４ｍＲＮＡの発現は，ＬＰＳ刺激により変化しなか

った（FiglIre47D)．以上，これらの結果から，ＬＰＳ認識に重要とされるTLR4，MD‑2，

ＣＤｌ４の全てを発現する上皮細胞であるTLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHO細胞においてＬＰＳ誘導

性の形質I摸上ＴＬＲ４の発現低下が引き起こされることが明らかになった．

ＡＢ

︵一ｏ﹄一こ８一．違寸５Ｆｇ管．⑳ １１０００００００２０８６４２夫

ＴＬＲ４

ＴＬＲ４/ＭＤ−２/ＣＤ１４−ＣＨＯ

ＳｕｌｆａｃｅＴｏｔａｌ

− − 一一一

ＣＯＮＬＰＳＣＯＮＬＰＳ

﹁１︲

〒

' ' 三二一

ＴＬＲ４陸＝口願輯Ｏ ■ 爵．

閏○Ｎ

ころ，本法によってもＬＰＳ刺激による形質膜上のＴＬＲ４の発現低下が観察された

回恩

1同０

ＣＤ１４

ＧＡＰＤＨＭ団‑２

FigIIre47LPSdownregulatcssurfaceexpressionoi･'ＩＬＲ４ｍＴＬＲ４/Mll)−２/CD14‑CHOcells.Ａ）

LPS（lluLg/ｍＬ,３ｈｌ･)‑tI･eatedand‐untreatedTLR4/ＭＤ−２/ＣＤｌ４−ＣＨＯｃｅｌｌｓｗｅＩ･esuIface‑biotinylated andsubjectedtoWeslembloUinganalysiswithanti‑TLR4antibody(leftpanel).Thetotalamountof TLR4proteillwasassessedbyWestemblottingusingwholecelllysate(rightpanel).Ｂ)Quantitative analysesofsuI･'､aceexI〕ressionofTLR4incellstreatedwithorwilhoulLPS,Theintensityofsurface TLR4bandsinTLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHOcellswerequantificdbylmageGaugesoftware(FUJIFILM，

Japan）andexpressedasape1℃entageofthebandfromLPS‑untl･ealedcells（Fig.１Ａ,ＣＯＮ).Results representmeans±ＳＤｆｌ･oｍ（hreeindependentexperiments、Pvaluewascalculatedusingstudent，ｓ／ test(*P<0.001).Ｃ）ＬＰＳ（llug/ｍＬ､３ｈｒ)‑treatedand‐unll･eatedTLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHOcellswere incubatedwi(ｈａｎ(i‑TLR4anlibody（HTAl25),stainedwithsecondaryAlexa488‑labeledantibody，

andanalyzedbyflowcytometI．y・pDisplay‑CHOcellsslainedwithanti‑TLR4antibody（HTAl25）

wel･ealsoanalyzedfornegativecon(rol・FiguresshownaI･erepresentativesofthreeindependent experiments.（Ｄ)TheexpI･essionofTLR4,ＭＤ−２ａｎｄＣＤｌ４ａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌｗａｓｍｅａｓｕrｅｄｂｙＲＴＬＰＣＲｉＩ１ＬＰＳ（ｌトLg/ｍＬ,３ｈｌ･)‑tI･eatedol･‐uI1treatedTLR4/ＭＤ−２/CDl4‑CHOcells、ＧＡＰDHmRNA

pDISpIay

加卯印加

１

﹄の︒Ｅコ匡一一①︒

A I e x a 4 8 8 ( T L R 4 ） C O N L p S

LPSdownregulatcssurfaceexpressionofTLR4inTLR4/ＭＤ−２/CD14‑CHOcelIs.Ａ）

1.0ｏｌＯ力１０２１０コ Ⅲ０^『

胞（TLR4/MD‑2‑CHO）を用いて，前項と同様の実験を行なった．その結果，興味深いこれまでのＬＰＳ認識メカニズムに関する様々な研究から，ＬＰＳを認識してシグナル伝達を行なうためにはTLR4，ＭＤ−２およびＣＤｌ４が重要であることが分かっている 16.116.117．ノックアウトマウスを用いた研究などから，TLR4/ＭＤ−２複合体がＬＰＳを認識してシグナルを開始することが明らかにされ，ＣＤｌ４は血清中のLBP/LPS複合体から LPSを形質膜上のTLR4/ＭＤ−２へ効率的に引き渡す役割を持つことが明らかとなった．

そこで次に，前述したＬＰＳ誘導性の形質膜上ＴＬＲ４の発現低下にＣＤｌ４がどの様な役割を持つのか検討するため，形質膜上にTLR4/ＭＤ−２のみを安定発現させたＣＨＯ細 (2)TLR4/MD‑2CHOを用いた検討

ことに，TLR4/MD‑2‑CHOにおいては，ＬＰＳにより刺激（ｌＵｇ/m１，３ｈｒ）しても，ビオチン化標識された形質膜上のＴＬＲ４の発現は低下しなかった(Figure48B)．さらに高濃度のＬＰＳを処理（lOug/m１，３ｈｒ）しても形質膜上ＴＬＲ４の発現低下は観察されなかっ

た(Figure48C)．これらの結果は，ＬＰＳ誘導性の形質膜上ＴＬＲ４の発現量低下にＣＤｌ４の存在が必要であることを示唆するものである．なお，本細胞は，ＣＤｌ４を欠損してい

るため，ＬＰＳ認識の低下が引き起こされている可能性があったが，Figu歴４８Ａに示す

ように，ＬＰＳ誘導性IKBαリン酸化または分解の程度はTLR4/MD‑2‑CHOおよび TLR4/MD‑2/CDl4‑CHOの両方の細胞において同程度であった．

次に，本細胞にmembIane‑anchoredCDl4(mCDl4)をtransienttIansfectionにて導入し，

LPS誘導性の形質膜上ＴＬＲ４の発現低下が観察されるようになるか否かについて確認した．その結果，ｍＣＤｌ４を導入したTLR4/MD‑2‑CHOにおいても，ＬＰＳ誘導性の形質

ハ

は，抗ＣＤｌ４抗体を用いたＦＣＭにより確認した(]Figure48E）

画画』

Ａ

IＫＢａｐＩＫＢａ

ＴＬＲ４/ＭＤ−２−ＣＨＯ

ＳｕｒｆａｃｅＴｏｔａｌ

TLRWi……HO鍵爽蕊1嘩曇…

TLR4/MD‑2‑CHOi纏一』騨韓Ｉ−−

‐

p D i s p 1 a y ‑ C H O l 静堂

１

宇 1 門雲一

ＣＯＮＬＰＳＣＯＮＬＰＳ

ＴＬＲ４医'｡鍵ご̲i‐一一

＝重宝国Ｐ、凸‑叫手二旦画宇奈

画

LPS1LLg/ｍｌ LPs10IJLg/ｍｌ 1階IＵ

一一０●︑●胸■●■６■■■■■牌●■■︒

︒

■

■ ｑ

■

■ ｑ室

ｑ■■■■■■■■■ｑｄｑｑＰ︒■■■■４句■︒

『e】Ｎ

加卯釦釦

１

﹄のｐＥ．匡一一の︒

'０１０】Ｎ

ＯｆＷ

０

１０。１０１１０２１０３１０４１０｡1０１１０２１０３１０４ Alexa488(TLR4）AIexa488(TLR4）

回目

ＴＬＲ４/ＭＤ−２−ＣＨＯ＋ｐｃＤＮＡＴＬＲ４/ＭＤ−２−ＣＨＯ＋ＣＤ1４ＴＬＲ４/ＭＤ−２ＣＨＯ

1同０ 1ＨＯ

i 1 鴻窒賀

トー

Fｉｇｕｒｅ４８Membrane‑anchoredCD14isrequireｄｆｂｒＬＰＳ−ｉｎｄｕｃｅｄＴＬＲ４ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔion ofsurfaceexpression．Ａ）TLR4/ＭＤ−２/CDl4‑、TLR4/ＭＤ−２‐andpDisplay‑CHOcellswere treateｄｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｌＩ｣g/ｍＬＬＰＳｆｂｒｌＯｍｉｎａｎｄｃｅｌｌｓｗｅＩ･elysedandthelysateswere subjectedtoSDS‑PAGEfbllowedbyWestemblottingusinganti‑IKBa，anti‑phospholKBα (plKBα).pDisplay‑CHOcellswel･eusedasanegativecontrolofLPSsignaling・Figuresshownare representativesofthI･eeindependentexpeI･iments.Ｂ）ＬＰＳ（llLLg/ｍＬ,３ｈｒ)‑tI･eatedand‐untreated TLR4/MD‑2‑CHOcellsweresulfacebiotinylatedandsuhjectedtoWestemblottinganalysiswith anti‑TLR4antibody（leftpanel).ThetotalamountofTLR4proteinwasassessedbyWestem blottingusingwholecelllysate(I･ightpanel).Datashownarerepresentativesoftwoindependenl experiments．Ｃ）ＬＰＳ（１，ｌＯｌＬＬｇ/ｍＬ,３ｈｒ)‑tl･eatedand‐untreatedTLR4/MD‑2‑CHOcellswere incubatedwithanli‑TLR4antibody（HTAl25)，stainedwithsecondal･yAlexa488‑labeled antibody,andanalyzedbyflowcytometry,pDisplay‑CHOcellsstainedwithanti‑TLR4antibody (HTA125）wereusedasnegativecontrol．Ｄ)，Ｅ）TLR4/MD‑2‑CHOcellsweTetransiently tI･ansfectedwitheilherpcDNA3.（Ｄ,leftpanel)Ｃｌ･ＣＤｌ４(Ｄ,l･ightpanel)､andcellsweretreated withol・withoutLPSfbllowedbyflowcytometI･ｙｕｓｉｎｇｃｏｎｔｒｏｌｌｇＧａｎｄａｎｔｉ−ＴＬＲ４ａｎtibody

ヨ

ハCONl

I I 缶

膜上ＴＬＲ４の発現低下が観察された(Figure48D)．なお，ｍＣＤｌ４の形質膜上での発現

１４

ｐｃＤＮＡＧ

ｈ

ＬＰＳ

加卯印釦０

１

﹄の︒Ｅコ匡一一の︒

０００００２９６３

１