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第６項正常上皮細胞およびＣＦ上皮細胞におけるＤＮＡメチル化解析

前項より，ＣＦ気管支上皮細胞におけるＴＬＲ２遺伝子の発現上昇には，ＴＬＲ２遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ脱メチル化が関与している可能性が示唆された．そこで，

本項では，ＴＬＲ２プロモーター領域の脱メチル化が，ＣＦ上皮細胞において一般的な現象であるか否かの検討を行った．まず，CFTＲ遺伝子を正常に有する上皮細胞株 (l6HBEl4o−，Ａ549,HeLa)およびＣＦＴＲに変異を有するＣＦ上皮細胞株(CFBE41o‑，

CFTE29o‑，CFPAC‑l）のそれぞれにおけるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現量を半定量的RT‑PCR 法により比較した．その結果，ＣＦ上皮細胞株の全てにおけるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現は，

正常上皮細胞株に比し高いことが明らかになった(Figure39A)．次に，これらのＣＦ上

皮細胞株におけるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現量上昇が，ＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域の脱

メチル化によるものであるか否かについてBisulfiteSequencing法を用いて検討した．

Fig.に示すように，全てのＣＦ上皮細胞株におけるTLR2遺伝子プロモーター領域内の多くのＣｐＧサイトにおけるメチル化頻度は，正常上皮細胞株のそれに比べ低いことが

明らかになった．特に，ＴＬＲ２遺伝子の発現が高い上皮細胞であるCFBEl4o‐および

CFPAC‑lにおけるＣｐＧサイトのメチル化の低下は，顕著なものであった(Figure39B)．

また，正常上皮細胞株およびＣＦ上皮細胞株において検討した全てのＣｐＧサイト２０カ

所の平均メチル化頻度を算出した結果，ＣＦ上皮細胞株における平均メチル化頻度は，

正常上皮細胞株におけるそれに比較して低下していた（Figu正３９C)．すなわち，ＣＦ上

皮細胞株におけるＴＬＲ２遺伝子プロモーター領域は，脱メチル化されている傾向にあ

り，その結果，TLR2mRNAの発現量が上昇している可能性が示唆された．

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第７項ＣＦ気管支上皮細胞における他のTLRfamily遺伝子発現量の検討

前項までの結果より，ＣＦ気管支上皮細胞であるCFBE41o‑細胞におけるＴＬＲ２遺伝子発現量は高く，その発現上昇メカニズムに，ＴＬＲ２プロモーター領域のメチル化が関

与していることが示唆された．本項では，ＴＬＲ２以外のTLRfamily分子の遺伝子発現

量を比較し，その発現がＤＮＡメチル化の違いにより調節されているか否かについて

検討した．まず，Figu正４０Ａに示すように，l6HBEl4o‑細胞およびCFBE41o‑細胞に

おけるTLRfamily分子(TLRl‑TLR6)のｍＲＮＡ発現量に関して，半定量的RTLPCR法にて検討した．その結果，CFBE41o‐細胞においては，ＴＬＲ２遺伝子のみならずＴＬＲ４

遺伝子においても，その発現量が上昇していることが明らかになった（Figu正４０A)．

次に，CFBE41o‑細胞におけるＴＬＲ４遺伝子の発現上昇が，そのリガンド応答性に反映しているか否かについて検討した．その結果，ＴＬＲ４のリガンドでありグラム陰性菌の

外膜構成成分であるlipopolysaccharide（LPS）の刺激により，CFBE41o‐細胞における IL‑8プロモーター活性が上昇した（Figure40B)．一方，l6HBEl4o‐細胞におけるＬＰＳ応答性ＩＬ−８プロモーター活性の上昇が引き起こされなかったことから（Figure40B)，

確かに，CFBE41o‑細胞においてＴＬＲ４が高発現していることが確認された．最後に，

CFBE41o‑細胞におけるＴＬＲ４遺伝子の発現量上昇がＴＬＲ２のときと同様にＤＮＡ脱メチル化を介しているか否かについて検討した．ＤＮＡ脱メチル化の関与に関しては，

TLR4遺伝子の発現が５−ＡＣ感受性であるか否かで判断した．その結果，Figure40Cに

示すように，l6HBEl4o‑細胞におけるＴＬＲ４ｍＲＮＡの発現量は５−ＡＣにより影響を受けなかった．したがって，CFBE41o‑細胞におけるTLR4遺伝子の発現上昇には，ＤＮＡメチル化とは別の機序が関与しているものと思われる．

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CFTRは，呼吸器上皮細胞においてはｃＡＭＰ依存性のＣｌチャネルとして機能する．

したがって，ＣＦ気道上皮細胞においては，形質膜上におけるＣｌチャネル機能に障害があることが考えられる．そこで，ＣＦ細胞におけるＴＬＲ２の先天的発現上昇機;憐に CFTRのＣｌチャネル機能の異常が関わっているか否かを検討した．方法としては，正常気道上皮細胞であるl6HBEl4o‐細胞に，CFTＲ機能を阻害する薬物である glibenclamide(ＧＣ)及び５−nitro‑2‑(3‑phenylpropylamino)benzoicacid(ＮPPB)'００処理を施

し，半定雌的RT‑PCR法によりＴＬＲ２遺伝子発現量が変化するか否かについて検討した．その結果，l6HBEl4o‑細胞においてＧＣ及びNPPＢ処理によりＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現が上昇した(Figure41A,Ｂ)一方，ＧＣ処理によるＴＬＲ２ｍＲＮＡの発現上昇は，ＣＦ気

道上皮細胞においては観察されなかった（Figure41A）したがって，機能的なＣＦＴＲの

発現が上皮細胞におけるＴＬＲ２の発現制御に重要であることが示唆された．

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第８項l6HBEl4o‑細胞におけるCFTＲ機能阻害実験

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PI･ｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｌ６ＨＢＥｌ４ｏ−ｃｅｌｌｓＮＰＰＢ，whichalsoblocksthechannclfilncｔｉｏｎｏｆＣＦＴＲ，

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２４【hr】

第９項CFBE41o‐細胞におけるＣＦＴＲレスキユー実験

本項では，CFTＲ遺伝子に変異を有し，その機能が阻害されているCFBE41o‑細胞に，

CFTＲ遺伝子を導入するレスキュー実験を行った．一般にtransienttransfectionによる CFTRの発現量は低いことが報告されているので，本項では，まず，WTLCFTRを安定的に高発現するCFBE41o‑細胞(WTLCFTR/CFBE41o‑)を，stabletransfection法により作製した．その際，機能的なＣＦＴＲを発現しないネガティブコントロールとして，変異型ＣＦｒＲ(△F508‑CFTR)を安定的に高発現するCFBE41o‑細胞(△F508‑CFTR/CFBE41o‑）

も同様に作製し，実験に用いた．なお，作製したそれぞれの細胞におけるＣＦＴＲの発現および機能の有無は，定量的RTLPCR法及びshortcimuitcurrent法により確認されている(datanotshown)．

次に，それぞれの細胞におけるＴＬＲ２遺伝子の発現量に関して検討した．Ｆi9,℃

42Ａに示すように，半定量的RT‑PCRの結果，WTCFTR/CFBE41o‐細胞における TLR2遺伝子の発現量は，CFBE41o‐細胞および△F508‑CFTR/CFBE41o‐のそれに比較して，減少していた．本現象は，TLR2特異的プライマーおよびプローブを用いた定量的RT‑PCR法によっても確認できた(Figure42B)．なお，これらの細胞におけるＰＧＮ応答性を検討したところ，WILCFrR/CFBE41o‐細胞において顕著に低下していたこと

から（Figme42D)，ＣＦ細胞に対するＣＦｒＲの導入は，ＴＬＲ２発現量を低下させ，その

結果，ＰＧＮ応答性の減少を誘起したものと考えられた．最後に，ＣＦＴＲレスキュー細

胞におけるTLR2遺伝子の発現低下が，ＴＬＲ２プロモーター領域ＣｐＧサイトのＤＮＡメ

チル化状態の変化に起因するものであるか否かを検討した．その結果，ＷＴ ‐

CFrR/CFBE41o‑細胞における検討した全てのＣｐＧサイト２０カ所の平均メチル化頻度

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その頻度は，l6HBEl4o‐細胞のそれと同等であった（Figure42C)．以上，前項及び本

項の結果より，気道上皮細胞におけるＣＦＴＲの存在は，TLR2遺伝子の発現量の制御において重要な役割を担うことが示唆され，その制御メカニズムに，ＴＬＲ２プロモーター領域のメチル化状態が強く相関していることが明らかになった．

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ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴＬＲ２ｍＲＮＡｗａｓｄｅｔｅrminedbysemi‑quantitativeR'ＰＰＣＲｏｆＲＮＡｄｅｒｉｖｅｄｆＩ･ｏｍＣＦＢＥ４１ｏ−ｃｅｌｌｓａｎｄＣＦＢＥ４１ｏ−ｃｅｌｌsstablytI･aI1sfもcｔｅｄｗｉｔｈＷＴ‑ＣＦＴＲｏｒ△F‐ ＣＦＴＲ、GAPDHexpressionwasalsoanalyzedｌｏｅｎｓｕｒｅｌｈａｔｅｑｕａｌａｍｏｕｎｔｓｏｆＲＮＡｗere usedineachreaction､Resultsal･erepresentativeofthI･eeindepelldelltexpel･iments.Ｂ)Real‐ timequantitativeR『ＰＰＣＲｗａｓｐｅＩｆｂｒｍｅｄｔｏｍｅａｓｕＩ･ｅＴＬＲ２ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣＦＢＥ４１ｏ−ｃeｌｌｓａｎｄＣＦＢＥ４１ｏ−ｃｅｌlsstablytI･ansfectedwithWFCFTRol･△F508‑CFTR・

TLR2mRNAlevelswerenormalizedtothelevelofcyclophilin(intemalcontrol).Results representthemean±SDfromtheexperimentspelfbrmedinduplicate.Ｃ)Theaverageof％

methylationateachCpGsitewithinａｌｌＣｐＧｆｒｏｍｈｕｍａｎＴＬＲ２ｐＩ･oximalpl･omotel･silleach celllineisshown（､＝lOfOreachsample)．Resultsl･eI〕resentthemeaI1±SEM．Ｄ）ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌＬ−８ａｔｍＲＮＡｌｅｖｅｌswasmeasuredbyReal‑1imequantitａｌｊｖｅＲＴ−ＰＣＲｉｎＣＦＢＥ４１ｏ‐ｃｅｌｌｓａｎｄＣＦＢＥ４１ｏ‐cellsstablytI･ansfectedwithWI迄ＣＦＴＲｏｒ△F508‑CFrR afterstimula1ionwithＰＧＮ(８．αI"e"s)fOr4h1..11‑戸８mRNAlevelswel･enormalizedtothe levelof62‑microglobulin（intemalcontrol)．Resultsl･epresentthemean±SDoftwo independenlexperimentspelfbI･medinduplicate．

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たＣＦＴＲ変異体発現マウス（dclF508CFマウス)ｌｏｌＪ０ｚと正常ＣＦＴＲを発現するマウスと比べ，TLR2/４発現の上昇がみられるか否かを半定埜的RT‑PCR法を用いて検討した．

なお，delF508マウスは，ＣＦの原因遺伝子であるＣＦＴＲに，ヒトにおいて最も多くみ

られる△馬０８変異(508番目のフェニルアラニンを欠損）を導入したＣＦのモデルマウスである、また，これらのマウスのCFTＲ遺伝子型解析は，Figure43のように，それ

ぞれのマウスからゲノムＤＮＡを抽出しＰＣＲ反応を行い，制限酵素ＳＪｐｌで切断され

るか否かで判断した．その後，マウスから各種臓器を摘出しＲＮＡを抽出し，検討を行

〆Ａ、

第１０項CFTＲ変異体発現マウス(delF508CFマウス)気道系上皮組織におけるTLR2/４発現解析

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ドキュメント内寧宇デ声 : ﾉ (ページ 100-116)

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