第 3 章 月桃根茎由来 5,6-dehydrokawain と
第 1 節 5,6-Dehydrokawain 類縁体の合成
1. 目的
本節では，構造活性相関研究を行うためのDK類縁体を合成することを目的 とした。
2. 結果と考察
DK類縁体（Fig. 4-4) は，市販のα-pyroneをアルキル化した後にaldol反応に より種々のアルデヒドとのカップリングを行うことで合成した (Schemes 4-1,
4-2)。マグネシウムをメタノール中, 窒素雰囲気下で加熱（60 ℃)し，Mg(OMe)2
を調製した。この溶液中に2-pyroneと対応するアルデヒドを添加し， 4－8時間 加熱還流した。溶媒を除去した後，酢酸水溶液（3.3 M)を添加して酢酸エチルで 3回抽出した。有機層を合わせて水で洗浄した後，無水硫酸ナトリウムで乾燥後，
エバポレータで溶媒を除去した。粗精製物を移動相溶媒に溶解させ，ODSカラ ムを用いた逆相分取HPLCで精製した。類縁体4-35は，4-24の10% Pd/Cを用 いた水素添加により得た。生成物の純度は，HPLCにより95％以上であること を確認した(Table 4-1)。
Scheme 4-1. Synthesis of 5,6-dehydrokawain analogs 4-11－4-13. Reagents and conditions: (a) dimethyl sulfate, K2CO3, DMSO, rt; (b) diethyl sulfate, K2CO3, DMSO, rt; (c) dipropyl sulfate, K2CO3, DMSO, rt; (d) benzaldehyde, Mg(OMe)2, MeOH, 60 °C.
Scheme 4-2. Synthesis of 5,6-dehydrokawain and its analogs. Reagents and conditions:
(a) Me2SO4, K2CO3, DMSO, rt; (b) RCHO, Mg(OMe)2, MeOH, 60 °C.
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Fig. 4-4. Structures of synthesized 5,6-dehydrokawain analogs in this study.
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Table 4-1. HPLC retention time and purity data for the 5,6-dehydrokawain analogs synthesized in this study. HPLC purity was evaluated by integration of peak areas.
Compound Retention time (min) Purity
2-5 8.0 99.9
4-11 9.1 99.9
4-12 10.7 99.3
4-13 15.2 99.5
4-14 15.6 95.8
4-15 11.3 96.5
4-16 6.0 98.8
4-17 8.2 99.9
4-18 11.3 99.8
4-19 10.3 95.6
4-20 7.7 96.2
4-21 12.3 99.9
4-22 6.9 98.3
4-23 8.9 99.7
4-24 14.0 95.1
4-25 13.9 99.8
4-26 12.4 99.4
4-27 10.4 98.7
4-28 10.5 97.9
4-29 9.8 99.4
4-30 20.4 99.7
4-31 30.2 99.8
4-32 23.7 99.8
4-33 8.4 95.3
4-34 8.4 99.9
4-35 11.8 99.4
HPLC analysis used the following conditions; HPLC column: Wakosil-II 5C18 RS Prep 4.6 × 250 mm, mobile phase: 60% acetonitrile/40% water, flow rate: 1 mL/min, monitored wavelength: 254 nm, analyze time: 40 min.
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第 2 節 5,6-Dehydrokawain の骨芽細胞分化促進作用に
対する構造活性相関
1.目的
第1節において，骨芽細胞分化促進作用を有する5,6-dehydrokawainの類縁体 を合成した。本節では，これらの骨芽細胞分化促進作用について調べ，構造活 性相関を明らかにすることを目的とした。
2.結果と考察
2-1. 細胞数への影響
合成したDKおよび化合物4-11－4-32, 4-35のMC3T3-E1細胞数に与える影響
を WST-8 法にて評価した(Fig. 4-5)。30 µM の添加濃度において，化合物 4-13
以外については，コントロールに対して80-120%の細胞数の範囲内に収まる結果 となったため，本濃度では細胞毒性は見られないと判断し，以降の試験に進む こととした。
Cont rol M) DK (
30
M) DK (
60 4-11 4-12
4-13 4-14
4-15 4-16
4-17 4-18
4-19 4-20
4-21 4-22
4-23 4-24
4-25 4-26
4-27 4-28
4-29 4-30
4-31 4-32
4-35
0 50 100 150
30Ｍ
Cell Number (% of Control )
Fig. 4-5. Effects of synthesized 5,6-dehydrokawain analogs against cell proliferation of MC3T3-E1 cells. The cells were cultured with or without test compounds in an osteoblast differentiation medium containing ascorbic acid (50 µg/mL) and β-glycerophosphate (10 mM) for 4 days. Cell numbers were measured using WST-8 reagent. The data represent means ± SD of triplicate wells.
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2-2. A環の影響
合成したDK (2-5)については，天然物と同様に骨芽細胞分化促進作用が認め
られた(Fig. 4-6)。A環部位の構造を変換した化合物4-11～4-13の骨芽細胞分化
促進活性は，0.1－60 µMの範囲において，いずれもDKの活性を下回ったこと から，A環の構造は活性発現に重要である可能性が示唆された。
Control
30 60 0.1 1 10 30 60 0.1 1 10 30 60 0.1 1 10 30 60
0 100 200 300 400
DK 4-11 4-12 4-13
(M)
M in e ra liz at io n （ ％ o f C o n tr o l）
Fig. 4-6. Structures of DK and compounds 4-11~4-13 and their effects on mineralization in MC3T3-E1 cells. The cells were cultured with or without test compounds in an osteoblast differentiation medium containing ascorbic acid (50 µg/mL) and β-glycerophosphate (10 mM) for 10 days. For quantification of mineralization, cells were solubilized with cetylpyridinium chloride and the absorbance of the solution was measured at 550 nm. The data represent means ± SD of triplicate wells.
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2-3. B環の影響
B環の芳香環部位の重要性を調べるために，類縁体4-14~4-24を合成し，活性 試験に供した(Fig. 4-7)。芳香環をシクロヘキシルに変換した類縁体4-14では、
ALP活性の促進が見られたが，シクロペンチル，シクロプロピルとした4-15お よび4-16では，活性上昇はみとめられなかった。これらは，作用濃度を高めて も骨芽細胞分化促進効果を示さなかった。次に芳香環の置換基効果を調べるた めに，類縁体4-17~4-24を合成した。芳香環のパラ位に塩素を導入した化合物
4-18，トリフルオロメチル基やエチル基を導入した4-21および4-24でALP活性
が大きく促進された。また，エトキシ基やエチニル基を導入した4-19や4-23で も中程度のALP活性促進効果を示した。一方，チオフェンに変換した4-22では 活性が低下した。ALP活性の傾向とカルシウム沈着の傾向は良い一致を示した (Fig. 4-7C)。以上の結果より，B環部位は六員環が必要であるが，必ずしも芳香 環は必要ではなく，またB環パラ位に様々な置換基を導入することで，DKの骨 芽細胞分化促進効果が大きく増強されることが示唆された。
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Fig. 4-7. Structures of synthesized DK and compounds 4-14~4-24 (A), and their effects on ALP activity (B) and mineralization (C) in MC3T3-E1 cells. The cells were cultured with or without test compounds in an osteoblast differentiation medium containing ascorbic acid (50 µg/mL) and β-glycerophosphate (10 mM) for 4 days (ALP activity) and 10 days (mineralization). Mineralization was visualized by Alizarin Red S staining and photographed. The data represent means ± SD of triplicate wells. The photographs show representative views of triplicate wells. *P < 0.05 versus the vehicle control by Dunnett’s test.
Control M) DK
(30
M) DK
(60 4-14 4-15
4-16 4-17
4-18 4-19
4-20 4-21
4-22 4-23
4-24
0 100 200 300 400
*
*
*
* *
*
* *
* *
30Ｍ B
ALP Activity (％ of Control)
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2-4. B環置換基の位置の影響
置換基の位置効果を調べるため，B環のオルト，メタ，パラ位にメチル基，エ チル基を導入した類縁体4-24~4-29を合成した(Fig. 4-8)。パラ位への炭素鎖の導 入はALP活性およびカルシウム沈着を著しく促進させた。置換基の位置をメタ 位にするとパラ位の時よりもカルシウム沈着が低下する傾向を示し(Fig. 4-8B,
C)，さらにオルト位にするとALP活性とカルシウム沈着はともに有意に低下し
た。
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Fig. 4-8. Structures of synthesized compounds 4-24~4-29 (A) and their effects on ALP activity (B) and mineralization in MC3T3-E1 cells (C). The experimental procedure is the same as that in Fig. 4-6 and 4-7. For quantification of mineralization, cells were solubilized with cetylpyridinium chloride and the absorbance of the solution was measured at 550 nm. The data represent means ± SD of triplicate wells. The various letters indicate significant differences in Tukey-Kramer test results (P < 0.05).
Cont rol4-24
4-25 4-26
4-27 4-28
4-29
0 200 400 600 800
1000 a
b c
a
b bc bc
30 Ｍ
C
Mineralization （％ of Control）
Con
trol 4-24 4-25 4-26 4-27 4-28 4-29
0 100 200 300 400
a a
b b
c cd
d
30 Ｍ
B
A L P A c ti vi ty (％ o f C o n tr o l)
80
2-5. B環パラ位における炭素鎖長の効果
B環パラ位にエチル基を導入することで活性が大きく上昇したため，炭素鎖 の鎖長をさらに長くした類縁体4-30と4-31およびtert-ブチル基を導入した4-32 を合成した(Fig. 4-9A)。鎖長を長くするとALP活性，カルシウム沈着共に促進 効果が強まることが示唆される結果となった。4-32の効果は4-31よりも弱まっ たことから，直鎖上に炭素鎖を伸ばした方がより活性が強まる可能性が示唆さ れた(Fig. 4-9B, C)。
Fig. 4-9. Structures of synthesized compounds 4-27, 4-24, 4-30~4-32 (A) and their effects on ALP activity (B) and mineralization in MC3T3-E1 cells (C). The experimental procedure is the same as that in Fig. 4-6. The data represent means ± SD of triplicate wells. The various letters indicate significant differences in Tukey-Kramer test results (P < 0.05).
Con
trol 4-27 4-24 4-30 4-31 4-32
0 200 400 600
a b c c
d e
30 Ｍ
B
A L P A c ti vi ty (％ o f C o n tr o l)
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2-6. 連結部位の影響
A環とB環の連結2重結合が活性に与える影響を調べるため，類縁体4-24 のA環とB環の連結2重結合部位を接触水素化により還元し，類縁体4-35を合 成した(Fig. 4-10A)。骨芽細胞の分化促進効果を調べたところ，4-35は，ALP活 性およびカルシウム沈着(Fig. 4-10B, C) ともに4-24よりも低くなった。
A
B C
Fig. 4-10. Structures of synthesized compounds 4-24 and 4-35 (A) and their effects on ALP activity (B) and mineralization in MC3T3-E1 cells (C). The experimental procedure is the same as that in Fig. 4-6 and 4-7. The data represent means ± SD of triplicate wells. The various letters indicate significant differences in Tukey-Kramer test results (P < 0.05).
Control 4-24
4-35 0
100 200 300
400
a
b c
A L P a c ti v it y (％ o f C o n tr o l)
Control 4-24
4-35 0
200 400 600 800
1000
a
b
M in e ra li z a ti o n （ ％ o f C o n tr o l） c
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2-7.
第2節のまとめ本節では，DKの骨芽細胞分化促進効果における活性発現に必要な構造因子を 明らかにすることならびに,さらに高活性な類縁体を得ることを目的とし，DK の構造を部分的に変換した化合物を合成してその効果を検証した。その結果，A 環の構造を変換した化合物については，骨芽細胞分化促進効果が認められるも のもあったが，DKよりも活性が弱まる事も明らかとなった(Fig.4-6 )。一方，B 環パラ位とメタ位にアルキル鎖やトリフルオロメチル基などの置換基を導入す ることで，DKの活性が逆に著しく高まる事が明らかとなった(Fig. 4-7, 4-8)。B 環パラ位に導入したアルキル鎖の鎖長は長くするほど活性が高まる傾向にあっ
たが（Fig. 4-9)，C4程度が最適と考えられ，それ以上に鎖長を伸ばすと培地へ
の溶解性が低下した。DKは，有意な骨芽細胞分化促進効果を示すのに40 µM以 上の処理濃度が必要であったが，今回見出した高活性のDK類縁体4-24や4-31
は，30 µM以下でもALP活性の促進作用やカルシウム沈着促進作用が認められ，
4-31については10 µMにおいてもカルシウム沈着が認められた。今回得られた 高活性DK類縁体について，次節ではさらなる作用機構解明へと進めることと した。
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