5,6-Dehydrokawain 誘導体の RAW264 細胞における 破骨細胞分化抑制作用とその作用機序

87

第 4 節 5,6-Dehydrokawain 誘導体の RAW264 細胞における

88

A

B

DM

SO M) Ipri (20

M) DK (20

10 20 10 20

0 50 100

150 TRAP activity

Cell proliferation

4-24 4-31

(Ｍ)

**

** **

**

** *

％ of C on tr ol

Fig. 4-16. Effects of 5,6-dehydrokawain (DK), derivatives 4-24 and 4-31, and ipriflavone (Ipri) on RANKL-induced osteoclast differentiation from RAW264 cells.

RAW264 cells were cultured with the test compounds in the presence of RANKL (10 ng/mL) for 3 days. For microscopic analysis, cells were fixed and stained by TRACP &

ALP double-stain Kit (Takara). Arrows show TRAP-positive multinucleated cells containing more than five nuclei. Each picture is representative of at least three independent cultures (A). TRAP activities were measured using TRACP&ALP assay kit (Takara) and cell numbers were measuerd using WST-8 reagent according to the manufacture's protocol. The data represent means ± SD of triplicate wells. *P < 0.05 and **P < 0.01 versus the vehicle control by Dunnett’s test (B).

89

2-2. 合成DK類縁体の破骨細胞分化抑制効果に対するスクリーニング

今回合成した DK 類縁体のうち，強い破骨細胞分化抑制効果を有するものを 見出すためにスクリーニング試験を行った。20 µM 以上の濃度においては，類 縁体4-24や4-31は破骨細胞分化抑制作用を示したが（Fig. 4-16B)，5 µMにお いては効果を示さなかった（Fig. 4-17B)。今回スクリーニングを行った25化合 物のうち，DKのB 環オルト位にフッ素を導入した4-34に顕著な破骨細胞分化 抑制効果が認められた。また，5 µMにおいて4-34は細胞毒性を示さなかった(Fig.

4-17C)。

90

DMS O

DK 4-11

4-12 4-13

4-14 4-15

4-16 4-17

4-18 4-19

4-20 4-21

4-22 4-23

4-24 4-25

4-26 4-27

4-28 4-29

4-30 4-31

4-32 4-33

4-34 0

50 100 150

5M

B

TRAP Activity (% of Control)

DMS ODK

4-11 4-12

4-13 4-14

4-15 4-16

4-17 4-18

4-19 4-20

4-21 4-22

4-23 4-24

4-25 4-26

4-27 4-28

4-29 4-30

4-31 4-32

4-33 4-34 0

50 100 150 200

5M

C

Cell Number (% of Control)

Fig. 4-17. Effects of synthesized DK analogs on RANKL-induced osteoclast differentiation from RAW264 cells. RAW264 cells were cultured with the test compounds in the presence of RANKL (10 ng/mL) for 3 days. After incubation, TRAP activities (B) and cell numbers (C) were measured. The data represent means ± SD of triplicate wells.

91

2-3. 類縁体4-34の破骨細胞分化抑制効果の検証

5 µMにおいて顕著なTRAP活性抑制効果を示した類縁体4-34について，破骨 細胞分化抑制効果があるかを詳細に検証した。0.1－20 µMにおけるTRAP陽性 多核化細胞形成およびTRAP活性に与える影響を調べたところ，いずれも類縁 体4-34は濃度依存的に抑制し，TRAP活性抑制効果のEC50値は，4.3 µMであっ た(Fig. 4-18B, C)。また，フッ素の置換位置の違いが破骨細胞分化抑制効果に与 える影響を調べるため，フッ素の位置がB環パラ位，オルト位である4-17およ び4-33についてTRAP活性に与える影響を調べたところ，いずれも10 µMにお いて有意な抑制効果は示さなかった(Fig. 4-18D)。以上の結果より，B環オルト 位へのフッ素の導入が破骨細胞分化抑制効果に重要であることが示唆された。

92

B

0 50 100 150

4-17 - 2.5 5 10 - - - (M) 4-33 - - - - 2.5 5 10 (M) RANKL + + + + + + +

D

TRAP Activity (% of Control)

Fig. 4-18. Effect of the substitution position of fluorine on TRAP activity inhibitory effect. Structures of compounds in these experiments (A). RAW264 cells were cultured with the test compounds in the presence of RANKL (10 ng/mL) for 3 days. For microscopic analysis, cells were fixed and stained by TRACP & ALP double-stain Kit (Takara). Arrows show TRAP-positive multinucleated cells containing more than five nuclei (B). TRAP activities (C and D) and cell numbers (E) were measured. The data shown are expressed as mean ± SD (n = 6). *P < 0.05 and **P < 0.01 versus the vehicle control by Dunnett’s test.

0 50 100 150

RANKL + + + + + + + + 4-34 0 0.1 0.5 1 2.5 5 10 20 (M)

**

**

**

**

C

TRAP Activity (% of Control)

0 50 100 150

4-34 0 1 2.5 5 10 20 40 (M)

**

E

Cell Number (% of Control)

93

また，分化した破骨細胞による骨吸収の抑制効果を調べる目的で，骨吸収評 価プレート(PGリサーチ社）を用いた試験を行った (Fig. 4-19）。本プレートは，

培養ウェルの底面にリン酸カルシウムがコートしてあり，RANKLの刺激により

RAW264細胞から分化した破骨細胞が放出するプロトンにより生じる骨吸収窟

(pit) の面積を測定することで破骨細胞による骨吸収量を評価することができ る。

RAW264細胞をプレートに播種後，RANKLとともに4-34を0.01–10 µMで添

加し，分化した破骨細胞による骨吸収によって生じる骨吸収窟の面積を定量化 したところ，0.5 µM以上の4-34処理により有意な骨吸収抑制効果が認められた (Fig. 4-20)。骨吸収抑制効果に対するEC50値は，1.7 µMであった。

Fig. 4-19. Bone resorption by osteoclast.

94

Fig. 4-20. Effects of compound 4-34 against osteoclastic bone resorption. RAW264 cells were cultured with or without compound in an osteoclast differentiation medium containing RANKL (50 ng/mL) for 6 days. Images of pits (black area) were obtained by phase-contrast microscopy (A). Total black areas were summed using image analysis software (B). Values are expressed as mean ± SD of quadruplicate wells. *P < 0.05, **P

< 0.01 versus the vehicle control by Dunnett's test.

95

2-4. 類縁体4-34の破骨細胞関連遺伝子に対する作用の検証

破骨細胞分化のマスター転写因子である Nfatc1 の発現を遺伝子レベルで有意 に抑制した(Fig. 4-21)。また，破骨細胞マーカーであるAcp5, Ctsk, Mmp9, Oscar についても濃度依存的に有意な抑制効果を示した。また，細胞融合関連因子で

あるOcstampのmRNA発現抑制作用が認められた。

DMSO 1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

*

(M)

**

**

Relative mRNA expression

4-34

DMSO 1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

(M)

**

** **

Relative mRNA expression

4-34

DMSO 1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

**

**

(M)

Relative mRNA expression

4-34

DMSO 1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

** **

(M)

Relative mRNA expression

4-34

DMSO 1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

**

** **

(M)

Relative mRNA expression

4-34 ^DMSO

1.2

5 2.5 5

0.0 0.5 1.0 1.5

**

**

(M)

Relative mRNA expression

4-34

Acp5 Ctsk Mmp9

Nfatc1 Oscar Ocstamp

Fig. 4-21. Effects of compound 4-34 on osteoclast-related genes in RAW264 cells.

The cells were incubated for 2 days with the compound in the differentiation medium containing RANKL. Total RNA was isolated and mRNA levels of the genes were measured by real-time PCR and normalized to Actb. The data represent means ± SD of two or three independent experiments. *P < 0.05, **P < 0.01 versus the vehicle control by Dunnett's test.

96

2-5. 合成類縁体の破骨細胞分化抑制効果まとめ

今回合成した全25種の化合物について5 µMの終濃度における破骨細胞分化 抑制効果を評価したところ，DKのB環オルト位にフッ素を導入した類縁体4-34 に顕著な活性が認められた。化合物4-34の破骨細胞形成におけるTRAP活性抑 制効果のEC50値は，4.3 µMであった。また，破骨細胞における骨吸収の抑制効 果に対するEC50値は，1.7 µMであり，骨粗鬆症治療薬の一つであるIpriflavone の活性を大きく上回った。また，フッ素の導入位置が異なる類縁体4-17と4-33 については10 µMにおいてTRAP活性抑制効果が認められなかったため，B環 オルト位へのフッ素の導入が破骨細胞分化抑制効果に極めて重要である可能性 が示唆された(Fig. 4-18)。

4-34は破骨細胞分化のマスター転写因子であるNfatc1の発現を遺伝子レベル で有意に抑制した。また，破骨細胞マーカーであるAcp5, Ctsk, Mmp9についても 濃度依存的に有意な抑制効果を示した(Fig. 4-21)ことより，4-34はNfatc1の mRNA発現を抑制することで,その転写活性を抑制し，その下流の破骨細胞の分 化関連遺伝子の発現を抑制していると考えられた。今後4-34の作用機構をより 詳細に調べることで，破骨細胞成熟が異常に亢進し引き起こされる関節リウマ チなどの炎症性疾患の治療薬開発につながる可能性が示唆された。

97

第 5 節 実験項

1. 第4章の使用機器

高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は，分析および分取用ともに島津製作所 製のものを用いた。システムコントローラー (CBM-20A), オートサンプラー (SIL-10AP), デガッサー (DGU-20A), ポンプ (LC-20AR), 紫外可視検出器 (SPD-20A)で分析および分取を行った。赤外吸収スペクトルの測定は，JASCO FT/IR-4100を用いた。核磁気共鳴 (NMR)装置は，JEOL JNM-ECZ400S, Bruker Biospin Avance III HD 600を用いた。融点の測定には，Yanagimoto micro melting point apparatusを用いた。また，高分解能質量分析 (HRMS)は，Thermo scientific Q exactiveを用いて測定した。マイクロプレートリーダーは，Molecular Devices 社製 Spectra Max M2を使用した。光学顕微鏡観察は，Olympus IX71 microscope を用いた。

2. 第1節の実験 2-1. NMR測定

NMRの測定溶媒は，重水素化クロロホルム (TMS 0.05 wt%入り)を用い，内 部標準物質としてTMS (¹H: 0.00 ppm), 重クロロホルム (¹³C, 77.0 ppm)を用い た。

2-2. (E)-4-Methoxy-3-methyl-6-styryl-2H-pyran-2-one (4-11) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール (20 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱（60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-3,6-dimethyl-2-pyrone⁶⁵（4-8, 200 mg, 1.30 mmol)とbenzaldehyde (0.140 µL, 1.38 mmol) を加え，60 ℃で8時間 加熱した。冷却した後、3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽 出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min,

98

Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 11.9 min）で精製しstyrylpyrone 4-11 28 mg (0.12 mmol, 9%)を黄色固体として得た。

4-11: Mp 201–202 °C; ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 165.6, 164.8, 157.3, 135.3, 135.1, 129.3, 128.9, 127.3, 118.9, 103.1, 96.0, 56.2, 8.9; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1016. The ¹H NMR data agreed with literature values.⁶⁵

2-3. (E)-4-Ethoxy-6-styryl-2H-pyran-2-one (4-12) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール (20 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱（60 ℃)し懸濁させた。この中に4-ethoxy-6-methyl-2-pyrone⁷⁵(4-9,200 mg, 1.30 mmol)とbenzaldehyde (0.140 µL, 1.38 mmol)を加え，60 ℃で8時間加熱した。

冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出した。抽 出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column:

Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 13.4 min) で精製し, styrylpyrone 4-12 31 mg (0.13 mmol, 10%)を白色固体として得た。

4-12： Mp 136–138 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52–7.48 (m, 3H), 7.39–7.33 (m, 3H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.05 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.43 (t, J = 7.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 170.3, 164.1, 158.5, 135.6, 135.2, 129.4, 128.9, 127.4, 118.7, 101.6, 89.2, 64.7, 14.1; IR (ATR) 2983, 2939, 1709, 1641, 1550, 1428, 1387, 1250, 1220, 1150 cm^-1; HRMS (ESI):

[M+H]⁺ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1016.

99

2-4. (E)-4-Propoxy-6-styryl-2H-pyran-2-one (4-13) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(20 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に6-methyl-4-propoxy-2-pyrone⁷⁵(4-10,275 mg, 1.07 mmol)とbenzaldehyde (0.140 µL, 1.38 mmol)を加え，60 ℃で5時間加熱した。

冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出した。抽 出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆相 HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column:

Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 18.1 min）で精製し, styrylpyrone 4-13 92 mg (0.36 mmol, 33%)を白色固体として得た。

4-13：Mp 95–96 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.52–7.48 (m, 3H), 7.39–7.25 (m, 3H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.93 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.82 (m, 2H), 1.03 (t, J = 7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.4, 164.1, 158.5, 135.6, 135.2, 129.4, 128.9, 127.4, 118.7, 101.6, 89.2, 70.4, 21.9, 10.3; IR (ATR) 2968, 2938, 2878, 1705, 1639, 1609, 1549, 1425, 1385, 1249, 1220, 1151, 962, 810 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₆H₁₇O₃, 257.1178; found, 257.1172.

2-5. 6-[(E)-2-Cyclohexylvinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-14) の合成

マグネシウム(156 mg, 6.41 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 300 mg, 2.14 mmol)とcyclohexanecarbaldehyde (266 µL, 2.20 mmol)を加え，60 ℃で4時間 加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(40 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽

100

出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 19.7 min）で精製し, 化合物 4-14 157 mg (0.67 mmol, 31%)を白色固体として得た。

4-14：Mp 86–87 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.70 (dd, J = 8.4, 15.6 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.58 (m, 1H), 1.84–1.36 (m, 8H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.3, 164.3, 158.9, 144.6, 119.4, 99.4, 88.2, 55.8, 43.5, 32.8, 25.3; IR (ATR) 2922, 2850, 1716, 1652, 1614, 1449, 1406, 1340, 1250, 1156, 1032, 966, 954, 809 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C13H17O3, 221.1178; found, 221.1171.

2-6. 6-[(E)-2-Cyclopentylvinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-15) の合成

マグネシウム(156 mg, 6.41 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,300 mg, 2.14 mmol)とcyclopentanecarboxaldehyde (235 µL, 2.20 mmol)を加え，60 ℃で5 時間加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(40 mL)で酸性とし，酢酸エチル で抽出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去し た。逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 14.4 min）で精製し, 化 合物 4-15 82.3 mg (0.37 mmol, 17%)を白色固体として得た。

4-15: Mp 86–87 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.70 (dd, J = 8.4, 15.6 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.74 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.80 (s, 3H), 2.58 (m, 1H), 1.84–1.36 (m, 8H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.3, 164.3, 158.9, 144.6, 119.4, 99.4, 88.2, 55.8, 43.5, 32.8, 25.3; IR (ATR) 2950, 2866, 1717, 1654, 1614, 1556, 1451, 1408, 1254, 1154, 967, 810 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C13H17O3, 221.1178; found, 221.1171.

101

2-7. 6-[(E)-2-Cyclopropylvinyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-16) の合成

マグネシウム(156 mg, 6.41 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,300 mg, 214 mmol)とcyclopropanecarboxaldehyde (167 µL, 2.20 mmol)を加え，60 ℃で5 時間加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(40 mL)で酸性とし，酢酸エチル で抽出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去し た。逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 8.9 min）で精製し, 化 合物 4-16 120 mg (0.63 mmol, 29%)を白色固体として得た。

4-16: Mp 80–82 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.17 (dd, J = 10.0, 15.2 Hz, 1H), 6.02 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 5.70 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.40 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 1.59–1.53 (m, 1H), 0.95–0.91 (m, 2H), 0.63–0.59 (m, 2H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.4, 164.3, 158.7, 144.7, 118.4, 98.5, 87.8, 55.8, 15.0, 8.5; IR (ATR) 3085, 3009, 2956, 1723, 1638, 1619, 1556, 1446, 1410, 1251, 1220, 1152, 962, 940 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₁H₁₃O₃, 193.0865; found, 193.0861.

2-8. (E)-6-(4-Fluorostyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-17) の合成

マグネシウム(156 mg, 6.41 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,300 mg, 2.14 mmol)と4-fluorobenzaldehyde (240 µL, 2.20 mmol)を加え，60 ℃で5時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(40 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆

102

相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 11.2 min）で精製し, 化合物 4-17 106 mg (0.43 mmol, 20%)を白色固体として得た。

4-17: Mp 143–145 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49－7.43 (m, 3H), 7.07 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 163.9, 163.3 (d, J = 249.0 Hz), 158.4, 134.5, 131.4 (d, J = 3.0 Hz), 129.2 (d, J = 7.9 Hz), 118.3, 116.0 (d, J = 21.7 Hz), 101.4, 88.9, 56.0; IR (ATR) 3087, 2954, 1716, 1695, 1639, 1550, 1508, 1453, 1407, 1258, 1222, 1158, 997, 956, 820, 812 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C14H12FO3, 247.0771; found, 247.0765. The ¹H and ¹³C NMR data were in agreement with literature values.⁶³

2-9. (E)-6-(4-Chlorostyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-18) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(10 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と4-chlorobenzaldehyde (225 mg, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で4時間加 熱した。冷却した後、3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 15.2 min）で精製し, 化合物 4-18 144 mg (0.55 mmol, 38%)を白色固体として得た。

4-18 Mp 156–159 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.46－7.33 (m, 5H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.95 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.9, 163.8, 158.2, 135.2, 134.3, 133.7, 129.1, 128.5, 119.1, 101.7, 89.0, 56.0; IR (ATR) 3079, 1727, 1641, 1614, 1556, 1491, 1451, 1413, 1401, 1252, 1220, 1179, 1153, 1027, 1002, 952, 815, 772 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C14H12ClO3, 263.0475; found, 263.0470. The ¹H and ¹³C NMR data were in

103

agreement with literature values.⁶³

2-10. (E)-6-(4-Ethoxystyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-19) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(10 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と4-ethoxybenzaldehyde (225 mg, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で4時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 13.8 min）で精製し, 化合物 4-19 100 mg (0.37 mmol, 26%)を淡黄色固体として得た。

4-19: Mp 161–162 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.47–7.42 (m, 3H), 6.88 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.44 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.88 (s, 1H), 5.47 (s, 1H), 4.06 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.82 (s, 3H), 1.43 (t, J = 6.9 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.2, 164.2, 160.1, 159.1, 135.5, 129.0, 127.8, 116.2, 114.8, 100.4, 88.3, 63.6, 55.9, 14.8; IR (ATR) 3078, 2979, 1724, 1639, 1556, 1509, 1449, 1409, 1260, 1220, 1155, 828, 772 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₆H₁₇O₄, 273.1127; found, 273.1120.

2-11. (E)-4-Methoxy-6-(4-methoxystyryl)-2H-pyran-2-one (4-20) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(10 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg,

104

1.43 mmol)と4-methoxybenzaldehyde (195 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で5時間 加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽 出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 10.9 min）で精製し, 化合物 4-20 84 mg (0.33 mmol, 23%)を淡黄色固体として得た。

4-20: Mp 153－154 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.47 (d, J = 8.8 Hz 2H), 7.43 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.47 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.82 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.2, 164.2, 160.7, 159.1, 135.5, 129.0, 128.0, 116.3, 114.4, 100.5, 88.4, 55.9, 55.4; IR (ATR) 3078, 2934, 1725, 1643, 1603, 1555, 1453, 1412, 1258, 1220, 1023, 956, 817 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C15H15O4, 259.0970; found, 259.0966.The ¹H and ¹³C NMR data were in agreement with literature values.^65,76

2-12. (E)-4-Methoxy-6-(4-trifluoromethylstyryl)-2H-pyran-2-one (4-21) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と4-trifluoromethylbenzaldehyde (218 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6 時間加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチル で抽出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去し た。逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 10.9 min）で精製し, 化 合物 4-21 104 mg (0.35 mmol, 25%)を白色固体として得た。

4-21: Mp 159–161 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.64–7.58 (m, 4H), 7.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 6.00 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.8, 163.6, 157.7, 138.6, 133.9,

105

130.9 (d, J = 32.4 Hz), 127.5, 125.8 (q, J = 3.7 Hz), 123.9 (q, J = 270.4 Hz), 120.9, 102.5, 89.4, 56.0; IR (ATR) 3080, 1730, 1643, 1613, 1558, 1455, 1408, 1325, 1253, 1107, 1065, 952, 824 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₅H₁₂F₃O₃, 297.0739;

found, 297.0735.

2-13. 4-Methoxy-6-[(E)-2-thiophen-3-ylvinyl]-2H-pyran-2-one (4-22) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と3-thiophenecarboxaldehyde (145 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で5時 間加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで 抽出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 9.7 min）で精製し, 化合物 4-22 134 mg (0.57 mmol, 40%)を黄色固体として得た。

4-22: Mp 168－170 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.50 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 7.41 (m, 1H), 7.34－7.32 (m, 1H), 7.28 (dd, J = 1.4, 5.1 Hz, 1H), 6.41 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.1, 164.0, 158.7, 138.2, 129.7, 126.9, 126.4, 124.7, 118.4, 100.9, 88.6, 55.9; IR (ATR) 1724, 1639, 1560, 1513, 1453, 1407, 1220, 1145, 1035, 1003, 957 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₂H₁₁O₃S, 235.0429; found, 235.0424.

106

2-14. (E)-6-(4-Ethynylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-23) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と4-ethynylbenzaldehyde (210 mg, 1.61 mmol)を加え，60 ℃で5時間 加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽 出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 11.9 min）で精製し, 化合物 4-23 141 mg (0.56 mmol, 39%)を黄色固体として得た。

4-23: Mp 164–166 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.50–7.43 (m, 5H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 3.18 (s, 1H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.9, 163.9, 158.2, 135.5, 134.7, 132.6, 127.2, 122.9, 119.6, 101.9, 89.1, 83.3, 78.9, 56.0; IR (ATR) 3210, 3073, 3018, 2985, 2943, 1696, 1637, 1605, 1538, 1450, 1405, 1252, 1220, 1151, 1033, 1011, 957, 827 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₆H₁₃O₃, 253.0865; found, 253.0858.

2-15. (E)-6-(4-Ethylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-24) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol )と4-ethylbenzaldehyde (210 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で5時間加熱 した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出し た。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆相

107

HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 17.3 min）で精製し, 化合物 4-24 125 mg (0.49 mmol, 34%)を黄色固体として得た。

4-24: Mp 94－96 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.25 (t, J = 7.8 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 152.3, 146.7, 142.5, 132.3, 124.1, 121.6, 118.2, 117.4, 109.5, 96.1, 86.3, 60.1, 38.4, 27.7; IR (ATR) 3086, 2964, 2931, 1699, 1642, 1606, 1546, 1453, 1407, 1253, 1220, 1155, 958, 827 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C16H17O3, 257.1178; found, 257.1172.

2-16. (E)-6-(3-Ethylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-25) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と3-ethylbenzaldehyde⁷⁷ (210 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 16.6 min）で精製し, 化合物 4-25 118 mg (0.46 mmol, 32%)を黄色固体として得た。

4-25: Mp 93–94 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.49 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.33–7.27 (m, 3H), 7.18 (m, 1H), 6.58 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 2.67 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.6 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 164.0, 158.7, 144.9, 136.0, 135.2, 129.2, 128.9, 126.9, 124.9, 118.3, 101.2, 88.8, 55.9, 28.8, 15.5; IR (ATR) 3022, 2964, 2933, 2872, 1712, 1638, 1610, 1550, 1450, 1405, 1341, 1251, 1220, 1150, 1034, 998, 957, 810 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C16H17O3, 257.1178; found, 257.1171.

108

2-17. (E)-6-(2-Ethylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-26) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と2-ethylbenzaldehyde (210 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で5時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 15.8 min）で精製し, 化合物 4-26 129 mg (0.50 mmol, 35%)を黄色固体として得た。

4-26: Mp 101–103 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.75 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.28–7.21 (m, 3H), 6.50 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.80 (q, J = 7.5 Hz, 2H), 1.22 (t, J = 7.6 Hz, 3H);

13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 164.0, 158.8, 143.4, 133.6, 133.1, 129.4, 129.2, 126.2, 125.8, 120.1, 101.4, 88.9, 55.9, 26.3, 15.7; IR (ATR) 2967, 2873, 1714, 1641, 1607, 1553, 1450, 1407, 1253, 1220, 1154, 1035, 998, 959, 813 cm^-1; HRMS (ESI):

[M+H]⁺ calcd for C₁₆H₁₇O₃, 257.1178; found, 257.1172.

2-18. (E)-4-Methoxy-6-(4-methylstyryl)-2H-pyran-2-one (4-27) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と4-methylbenzaldehyde (188 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆

109

相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 13.8 min）で精製し, 化合物 4-27 48 mg (0.20 mmol, 14%)を黄色固体として得た。

4-27: Mp 174–176 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.53 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 2.37 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 164.1, 158.9, 139.7, 135.8, 132.4, 129.6, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 21.4; IR (ATR) 3078, 2952, 1723, 1640, 1607, 1554, 1447, 1405, 1254, 1220, 1151, 956, 816 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1016.

2-19. (E)-4-Methoxy-6-(3-methylstyryl)-2H-pyran-2-one (4-28) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と3-methylbenzaldehyde (0.189 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間 加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽 出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 13.8 min）で精製し, 化合物 4-28 113 mg (0.47 mmol, 33%)を黄色固体として得た。

4-28: Mp 129–131 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.31－

7.24 (m, 3H), 7.15 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.49 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.37 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 164.0, 158.7, 138.5, 135.9, 135.1, 130.3, 128.8, 128.0, 124.7, 118.4, 101.2, 88.8, 55.9, 21.4; IR (ATR) 3080, 2944, 1703, 1640, 1610, 1552, 1448, 1407, 1252, 1150, 1030, 957, 849, 807 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C15H15O3, 243.1021; found, 243.1015.

110

2-20. (E)-4-Methoxy-6-(2-methylstyryl)-2H-pyran-2-one (4-29) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と2-methylbenzaldehyde (185 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 13.4 min）で精製し, 化合物 4-29 113 mg (0.47 mmol, 33%)を黄色固体として得た。

4-29: Mp 110–111 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.71 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.53–

7.51 (m, 1H), 7.24–7.19 (m, 3H), 6.50 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.94 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.0, 164.0, 158.7, 137.3, 134.2, 133.3, 130.8, 129.2, 126.2, 125.6, 119.9, 101.4, 88.8, 55.9, 20.0; IR (ATR) 2944, 1714, 1640, 1607, 1552, 1450, 1407, 1252, 1220, 1153, 1034, 958, 811 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₅H₁₅O₃, 243.1021; found, 243.1016.

2-21. (E)-4-Methoxy-6-(4-propylstyryl)-2H-pyran-2-one (4-30) の合成

マグネシウム(156 mg, 6.41 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 300 mg, 2.14 mmol)と4-propylbenzaldehyde (236 µL, 2.20 mmol)を加え，60 ℃で5時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出

111

した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 24.2 min）で精製し, 化合物 4-30 134 mg (0.50 mmol, 23%)を白色固体として得た。

4-30: Mp 111–113 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.50–7.41 (m, 3H), 7.19–7.17 (m, 2H), 6.54 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.92 (s, 1H), 5.48 (s, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.59 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 0.97–0.93 (m, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 164.1, 158.9, 144.6, 135.8, 132.7, 129.0, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 37.9, 24.4, 13.8; IR (ATR) 2955, 2870, 1699, 1641, 1607, 1547, 1453, 1408, 1254, 1220, 1154, 1037, 1002, 942, 820 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C17H19O3, 271.1334; found, 271.1328.

2-22. (E)-6-(4-Butylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-31) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3,200 mg, 1.43 mmol)と4-butylbenzaldehyde (267 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で4時間加熱 した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出し た。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆相 HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H2O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 30.7 min）で精製し, 化合物 4-31 88 mg (0.31 mmol, 22%)を白色固体として得た。

4-31: Mp 104–106 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.54 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.62 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (m, 2H), 0.93 (t, J = 7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 164.1, 158.9, 144.8, 135.9, 132.7, 129.0, 127.4, 117.6, 100.9, 88.6, 55.9, 35.5, 33.4, 22.3, 14.0; IR (ATR) 3071, 2955, 2931, 2857, 1708, 1639, 1606, 1545, 1453, 1406, 1252, 1220, 1157,

112

1037, 959, 833 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₈H₂₁O₃, 285.1491; found, 285.1484.

2-23. (E)-6-(4-tert-Butylstyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-32) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と4-tert-butylbenzaldehyde (267 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間 加熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽 出した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。

逆相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 24.8 min）で精製し, 化合物 4-32 107 mg (0.38 mmol, 26%)を白色固体として得た。

4-32: Mp 155–156 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.48 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 7.43 (m, 2H), 7.39 (m, 2H), 6.54 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.92 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 1.33 (s, 9H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.1, 164.1, 158.9, 152.9, 135.7, 132.4, 127.2, 125.8, 117.8, 100.9, 88.6, 55.9, 34.8, 31.2; IR (ATR) 3083, 2960, 2868, 1719, 1640, 1605, 1551, 1451, 1405, 1251, 1220, 1152, 1109, 957, 826, 806 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₈H₂₁O₃, 285.1491; found, 285.1489.

The ¹H and ¹³C NMR data were in agreement with literature values.⁶⁷

2-24. (E)-6-(3-Fluorostyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-33) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で

113

加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と3- fluorobenzaldehyde (169 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 11.4 min）で精製し, 化合物 4-33 144 mg (0.58 mmol, 41%)を黄色固体として得た。

4-33: Mp 178–179 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.45 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.34–

7.31 (m, 1H), 7.26–7.18 (m, 2H), 7.05–7.00 (m, 1H), 6.57 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.96 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.51 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.9, 164.3, 163.0 (d, J = 245.0 Hz), 158.0, 137.5 (d, J = 7.6 Hz), 134.4, 130.4 (d, J = 8.1 Hz), 123.6, 119.9, 116.2 (d, J = 21.2 Hz), 113.4 (d, J = 21.6 Hz), 102.0, 89.2, 56.0;

IR (ATR) 3077, 2952, 1724, 1642, 1612, 1557, 1453, 1410, 1259, 1220, 1156, 1038, 1001, 957, 828, 809 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₄H₁₂FO₃, 247.0771; found, 247.0764.

2-25. (E)-6-(2-Fluorostyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-34) の合成

マグネシウム(104 mg, 4.28 mmol)をメタノール(15 mL) 中，窒素雰囲気下で 加熱(60 ℃)し懸濁させた。この中に4-methoxy-6-methyl-2-pyrone⁶⁷ (3-3, 200 mg, 1.43 mmol)と2-fluorobenzaldehyde (169 µL, 1.60 mmol)を加え，60 ℃で6時間加 熱した。冷却した後，3.3 M酢酸水溶液(30 mL)で酸性とし，酢酸エチルで抽出 した。抽出エキスを無水硫酸ナトリウムで乾燥し，減圧下溶媒を除去した。逆 相HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (70:30), Flow rate: 10 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 11.7 min）で精製し, 化合物 4-34 251 mg (1.02 mmol, 71%)を黄色固体として得た。

4-34: Mp 129–131°C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.56 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 7.51–

114

7.47 (m, 1H), 7.33–7.26 (m, 1H), 7.17 –7.06 (m, 2H), 6.72 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.97 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.50 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170.9, 163.8, 161.1 (d, J = 249.8 Hz), 158.4, 130.6 (d, J = 8.5 Hz), 129.0 (d, J = 3.4 Hz), 128.8, 124.4 (d, J = 3.5 Hz), 123.3 (d, J = 11.4 Hz), 121.4 (d, J = 8.4 Hz), 116.2 (d, J = 21.9 Hz), 101.9, 89.1, 56.0; IR (ATR) 3084, 1715, 1642, 1608, 1554, 1493, 1451, 1411, 1219, 1153, 1107, 1030, 1000, 955, 819 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C14H12FO3, 247.0771; found, 247.0763.

2-26. 6-[2-(4-Ethylphenyl)ethyl]-4-methoxy-2H-pyran-2-one (4-35) の合成

化合物4-24 (100 mg，0.39 mmol)をMeOHに溶解させ，10% Pd/C(30 mg)を添 加した。フラスコ内を真空にした後にH2ガスを4回吹き込んだ。15分間撹拌し た後，H₂ ガスを除去し，セライトろ過後に濃縮した。濃縮物を逆相 HPLC (Detection: 210 nm, Solvent: MeCN/ H₂O (60:40), Flow rate: 10 mL/min, Column:

Wakosil-Ⅱ5C18RSPrep φ20×250 mm, Rt: 21.9 min）で精製し, 化合物 4-35 49 mg (0.19 mmol, 49%)を白色固体として得た。

4-35: Mp 56–58 °C; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.11 (m, 4H), 5.73 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 2.96–2.92 (m, 2H), 2.76–2.71 (m, 2H), 2.62 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.6 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) δ 171.2, 164.9, 164.5, 142.3, 137.0, 128.2, 128.0, 100.1, 87.7, 55.8, 35.5, 32.4, 28.4, 15.6; IR (ATR) 3079, 2954, 2930, 1719, 1651, 1566, 1457, 1414, 1251, 1147, 1032, 1007, 934, 872, 852, 815, 742 cm^-1; HRMS (ESI): [M+H]⁺ calcd for C₁₆H₁₉O₃, 259.1334; found, 259.1330.

115

1H and ¹³C NMR spectra of synthesized compounds in this study

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

116

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

117

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

118

¹H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

119

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

¹³C NMR (100 MHz, CDCl3)

120

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

121

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

122

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

123

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

124

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

125

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

126

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

127

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

128

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

129

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

130

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

131

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

132

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

133

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

134

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

135

1H NMR (400 MHz, CDCl3)

13C NMR (100 MHz, CDCl3)

136

3. 第2節の実験方法 3-1. 試薬

Alpha-minimum essential medium (α-MEM)および penicillin streptomycin は，

Sigma-Aldrich社製を用いた。FBSとGlutaMAX^TMは，Life Technologies社製を用 いた。β-Glycerophosphateは和光純薬工業株式会社のものを用いた。他の試薬に ついては可能な限り最上級のものを用いた。

3-2. 細胞培養

MC3T3-E1細胞は，RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japan)より購入した。細胞は，

10% FBS, 1% GlutaMAX^TM, 100 units/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycinを添加

した α-MEM 培地にて培養した（培養培地）。MC3T3-E1 細胞を骨芽細胞へと分

化誘導させるため，50 µg/mL ascorbic acidと10 mM β-glycerophosphateを培養培 地に添加した分化培地を用いた。サンプルは，DMSO に溶解したものを用い，

DMSOの終濃度が0.1% (v/v)以下となるように培地に添加した。

3-3. MC3T3-E1細胞を用いた骨芽細胞分化促進効果の評価

細胞試験の方法は，Yonezawaらの方法¹³を改変した。MC3T3-E1細胞を1.0×10⁴

cells/wellの密度で96 well プレートに播種し，培養培地で3日間培養した。培養

した後，分化誘導培地に，DMSO (溶媒コントロール）もしくはサンプルを溶解 させた溶液に交換し，さらに4日間培養したのちにALP活性を測定した。プレ ート上の細胞を冷却したMeOHで固定化し，TRACP and ALP assay kit (タカラバ イオ株式会社）の基質溶液を50 µL添加後，37 ℃, 30 minインキュベートした。

インキュベート後，マイクロプレートリーダーで405 nmにおける吸光度を測定 した。ALP活性促進率は，コントロールの吸光度を100％とした相対値として算 出した。

カルシウム沈着の測定については，10 日間分化誘導を行った細胞について，

プレート上の細胞を冷却したMeOHで固定化し，20 mM alizalin red S 溶液（和 光純薬工業株式会社）で染色した。染色後，水で洗浄し，写真撮影を行った。

カルシウム沈着量の定量のため，cetylpyridinium chloride溶液 (10% w/v)で細胞 および色素を溶解させ，96 well プレートに移したのちに，550 nmにおける吸光 度をマイクロプレートリーダーで測定した。カルシウム沈着の促進率は，コン

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