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asiatica), マカ (Lepidium sp.)，パパイヤ(Carica papaya), ハイビスカス（Hibiscus hybrids), グァバ（Psidium sp.), クコ（Lycium chinense), クワンソウ（Hemerocallis fulva), ク ミ ク ス チ ン （Orthosiphon stamineus), ヤ エ ヤ マ ア オ キ （Morinda citrifolia)，アマチャヅル（Gynostemma pentaphyllum)は，2014年4月に沖縄県薬 草協同組合より乾燥物を提供いただいた。ニトベギク（Tithonia diversifolia), ホ オズキ（Physalis sp.), 月桃（Alpinia zerumbet), クービー（Elaeagnus glabra), イ シマーチは，株式会社 比嘉製茶より乾燥物を購入した。ボタンボウフウ
（Peucedanum japonicum), ウズラ豆(Phaseolus vulgaris)，ウズラ豆皮(Phaseolus vulgaris)，ニガナ，ナスタチウム（Tropaeolum majus），ササゲ（Vigna unguiculata), エンサイ(Ipomoea aquatica)は，2014年4月にＪＡおきなわ 中部ファーマーズ マーケット ちゃんぷる～市場にて生鮮物を購入した。生鮮物は，粉砕後，凍 結乾燥した。各サンプルを粉砕後，MeOH で抽出し，ろ過したのちに溶媒を除 去し凍結乾燥した。凍結乾燥後，50 mg/mLの濃度となるようDMSOに溶解し，
スクリーニング用サンプルとした。
4-2. NO産生抑制試験
RAW264細胞を 96ウェルプレート（1.0×105 cells/well）に播種した。各サン
プルを終濃度が50 µg/mLとなるよう培地に溶解して細胞に添加し，LPS（100 ng / mL）を添加して24時間培養した。 インキュベーション後，採取した培地サン プルをGriess試薬（1％ sulfanilamide，0.1％ N-(1-Naphthyl)ethylenediamine・2HCl および2.5％リン酸）と混合し, 37 ℃, 20分間インキュベートした。インキュベ ーション後，540 nmでの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し， 亜硝酸 ナトリウムを用いた標準曲線と比較した。 細胞生存率の評価のために，水溶性 テトラゾリウム塩（WST）細胞毒性アッセイを，Cell Counting Kit-8（Dojindo）
を用いて行った。結果は，LPS添加したコントロールを100%とした相対値で表 した。
5. 第2節の実験
5-1. 化合物の単離・構造決定
化合物の分離は，第2節で述べたとおり行った。NMRの測定溶媒は，重水素 化クロロホルム (TMS 0.05 wt%入り)を用い，内部標準物質としてTMS (1H: 0.00
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ppm), 重クロロホルム (13C, 77.0 ppm)を用いた。
5,6-Dehydrokawain (2-5): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52－7.35 (5H, m, aromatic), 7.50 (1H, d, J = 15.9 Hz, 8-H), 6.59 (1H, d, J = 16.0 Hz, 7-H), 5.95 (1H, d, J = 2.4 Hz, 5-H), 5.50 (1H, d, J = 2.0 Hz, 3-H), 3.83 (3H, s, MeO-); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 164.0, 158.6, 135.8, 135.2, 129.4, 128.9, 127.4, 118.6, 101.3, 88.8, 55.9; IR (ATR) 3080, 1723, 1639, 1608, 1559, 1148, 958, 890, 832, 755 cm-1; HRMS (ESI):
[M+H]+ calcd for C14H13O3, 229.0865; found, 229.0866.
Dihydro-5,6-dehydrokawain (2-6): 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.31－7.16 (5H, m, aromatic), 5.72 (1H, s, 5-H), 5.41 (1H, s, 3-H), 3.77 (3H, s, MeO-), 2.97 (2H, t, J = 7.8 Hz, CH2), 2.75 (2H, t, J = 8.0 Hz, CH2); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171.1, 164.9, 164.3, 139.8, 128.6, 128.3, 126.4, 100.2, 87.7, 55.8, 35.4, 32.8; IR (ATR) 3080, 1702, 1648, 1568, 1128, 1138, 942, 862, 842, 818, 743 cm-1; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C14H15O3, 231.1021; found, 231.1024.
5-2. NO産生抑制試験
RAW264細胞を 96ウェルプレート（1.0×105 cells/well）に播種した。各サン プルを終濃度が分画物の場合25もしくは 50 µg/mLとなるよう培地に溶解して 細胞に添加した。単離した化合物は50, 100 µMとなるように培地に溶解して細 胞に添加した。サンプル添加後，LPS（100 ng / mL）を添加して24時間培養し た。培養後の処理は，4-2と同様に行った。
5-3. 統計解析
統計解析は，GraphPad Prism V5.02 softoware for Windows (Graphpad Softoware) を用い，一元配置分散分析とDunnettの多重比較検定に供した。5%未満の危険 率で，コントロールとの有意差の有無を判定した。
6. 第3節の実験
6-1. 化合物の単離・構造決定
沖縄県薬草協同組合より入手したサルカケミカン（乾燥茎）を，ミルで粉 砕後，100 gを1 LのMeOHで80 ℃，2時間加熱還流抽出した。この操作をも
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う一度繰り返し，MeOH抽出液を減圧化で濃縮乾固後，重量を測定した(10.5 g)。
MeOH抽出物を100 mLの水で懸濁し，Hexane (100 mL)を加えて，振とう抽出
した。この操作を４回繰り返し，Hexane抽出液を濃縮乾固後，重量測定した( 1.75
g)。残った水層にEtOAc (100 mL)を加えて振とう抽出し，この操作を４回繰
り返した。さらに，残りの水層にBuOH (100 mL)を加えて振とう抽出し，この 操作を４回繰り返した。残りの水層，EtOAc抽出液，BuOH抽出液は，それぞれ 濃縮乾固して重量を測定した (水抽出物: 1.75 g, BuOH抽出物: 1.12 g, EtOAc抽 出物: 0.63 g)。
EtOAc 抽出物の一部 (217 mg)を Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical, Tokyo,
Japan)を用いたオープンカラムクロマトグラフィーに供し，20% MeCN (E. Fr-1),
40% MeCN (E. Fr-2), 60% MeCN (E. Fr-3), 80% MeCN (E. Fr-4), 100% MeCN (E.
Fr-5)で溶出した。溶出液を濃縮乾固後，重量測定した(E. Fr-1: 16.8 mg, E. Fr-2:
56.7 mg, E. Fr-3: 45.6 mg, E. Fr-4: 29.5 mg, E. Fr-5: 25.4 mg)。Hexane抽出物は，
DiaionHP-20（φ 3.0×140 mm)に供し，20% MeCN (H. Fr-1), 40% MeCN (H. Fr-2), 60% MeCN (H. Fr-3), 80% MeCN (H. Fr-4), 100% MeCN (H. Fr-5)で溶出した(各 200 mL)。溶出液を濃縮乾固後，重量測定した(H. Fr-1: 19 mg, H. Fr-2: 28 mg, H.
Fr-3: 423 mg, H. Fr-4: 604 mg, H. Fr-5: 112 mg)。H. Fr-3を逆相HPLC (Detection:
210 nm, Solvent: MeCN/H2O (50:50), Flow rate: 5 mL/min, Column: Wakosil-Ⅱ 5C18RSPrep φ20×250 mm)で分取し，化合物2-12 (Rt: 15.6 min,199.3 mg),化合物 2-13 (Rt: 47.7 min, 12.8 mg)をそれぞれ白色固体として単離した。
Aculeatin (2-12): 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.88 (1H, dd, J = 9.5, 0.2 Hz, H-4), 6.65 (1H, s, H-8), 6.25 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 3.91 (3H, s, H-10), 3.87 (3H, s, H-9), 2.98－2.93 (1H, m, H-2'), 2.98－2.86 (2H, m, H-1'), 1.43 (3H, s, H-5'), 1.31 (3H, s, H-4'); 13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 161.8 (C-7), 161.1 (C-2), 156.1 (C-5), 155.2 (C-8a), 138.9 (C-4), 116.8 (C-6), 112.5 (C-3), 107.2 (C-4a), 95.5 (C-8), 63.6 (C-9), 63.2 (C-2'), 59.1 (C-3'), 56.1 (C-10), 24.8 (C-4'), 23.5 (C-1'), 18.9 (C-5'); IR (ATR) 2917, 1734, 1610, 1456, 1381, 1205, 1130, 1086, 822, 774 cm-1; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H19O5, 291.1233; found, 291.1218; [α]D27
−14.7 (c = 0.1 in AcOEt).
Toddaculin (2-13): 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.87 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-4), 6.62 (1H, s, H-8), 6.23 (1H, d, J = 9.6 Hz, H-3), 5.14 (1H, m, H-2'), 3.89 (3H, s, H-10), 3.83 (3H, s, H-9), 3.35 (2H, d, J = 6.6 Hz, H-1'), 1.78 (3H, s, H-5'),1.68 (3H,s, H-4');
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13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ 161.7 (C-7), 161.3 (C-2), 155.2 (C-5), 154.6 (C-8a), 139.0 (C-4), 132.0 (C-3'), 122.1 (C-2'), 120.3 (C-6), 112.2 (C-3), 107.1 (C-4a), 95.4 (C-8), 63.1 (C-9), 56.0 (C-10), 25.7 (C-4'), 22.7 (C-1'), 17.8 (C-5'); IR (ATR) 2959, 1733, 1610, 1564, 1458, 1381, 1356, 1309, 1204, 1136, 1088, 1011, 952, 917, 823 cm-1; HRMS (ESI): [M+H]+ calcd for C16H19O4, 275.1283; found, 275.1270.
6-2. NO産生抑制試験
RAW264細胞を 96ウェルプレート（1.0×105 cells/well）に播種した。各サン プルを終濃度が分画物の場合5, 10, 20 µg/mLとなるよう培地に溶解して細胞に 添加した。単離した化合物は25, 50, 100, 200 µMとなるように培地に溶解して細 胞に添加した。サンプル添加後，LPS（100 ng / mL）を添加して24時間培養し た。培養後の処理は，4-2と同様に行った。
7. 第4節の実験 7-1. 細胞毒性試験
RAW264細胞を96ウェルプレート(1.0×10 5cells/well)に播種した。次に各種濃 度でACUまたはTOD処理し, LPS (100 ng / mL)を添加して24時間培養した。イ ンキュベーション後， Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて, 水溶性テトラゾリ ウム塩(WST)細胞毒性アッセイを行った。
7-2. ELISA法
RAW264細胞を24ウェルプレート(5×105 cells/well)に播種した。次に各種濃度
でACUまたはTOD処理し，LPS(100 ng / mL)を添加して24時間培養した。 イ
ンキュベーション後, 採取した培地中のTNF-αおよびIL-6の量をMouse TNF-α ELISA MAXTMとMouse IL-6 ELISA MAXTM(Biolegend)を用いてそれぞれ定量し た。
7-3. DNAマイクロアレイおよび定量的RT-PCR
RAW264 マクロファージ細胞から，TRIzol 試薬(Life Technologies)および
RNeasy Mini Kit(Qiagen)を用いてTotal RNAを抽出した。抽出したTotal RNA
を用いてBiotin標識RNAを作製した後， 183個の遺伝子を搭載したフォーカス
ト DNA マ イ ク ロ ア レ イ 分 析 (Genopal Mouse Mouse innate immunity Chip,
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Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japan)を, 製造者のプロトコールに従って実施した。
リアルタイム定量 RT-PCR のために, random primers および PrimeScript reverse transcriptase (Takara Bio)を用いてcDNAを合成した。 mRNA発現量の測定には，
Fast SYBR Green Master MixTM (Applied Biosystems)を用い，Tabele 2-5 に示した 遺伝子特異的プライマーで標的 cDNA を増幅させ，StepOnePlusTMリアルタイム PCRシステム (Applied Biosystems)にて測定を行った。各種mRNA発現量は，比 較Ct法により，コントロールのmRNA発現量に対する各試験区のmRNA発現量 をmRNA発現率として算出した。内部標準としてβ-actinのmRNA発現量で標準 化を行った。
Table 2-5. Primer pairs used in this study
Gene name Primer Primer sequence (5' to 3')
Actb Forward CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC
Reverse ATGGAGCCACCGATCCACA
Mcp1 Forward GCATCCACGTGTTGGCTCA
Reverse CTCCAGCCTACTCATTGGGATCA
Nos2 Forward GGAATGGAGACTGTCCCAGCA
Reverse GTCATGAGCAAAGGCGCAGA
Il6 Forward CAACGATGATGCACTTGCAGA
Reverse CTCCAGGTAGCTATGGTACTCCAGA
Il1β Forward TCCAGGATGAGGACATGAGCAC
Reverse GAACGTCACACACCAGCAGGTTA
Il1α Forward TGGTTAAATGACCTGCAACAGGAA
Reverse AGGTCGGTCTCACTACCTGTGATG
Cox2 Forward GTGTGCGACATACTCAAGCAGGA
Reverse TGAAGTGGTAACCGCTCAGGTG
7-4. NFκBレポーターアッセイ
既 製 品 の 手 順 書 に 従 い, Lipofectamine LTX お よ び PLUS Reagents (Life Technologies Japan) を用いてホタル pGL4.32 /NFκB プラスミドおよび Renilla
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pGL4.73 / SV40対照プラスミド(Promega, Tokyo, Japan) をRAW264細胞へトラ ンスフェクションした。トランスフェクション後の RAW264 細胞(5.0×104
cells/well) を 96 ウェルプレートへ播種し，16 時間培養した。 培養後，細胞を
異なる濃度のACUおよびTODで処理し，次いでLPS（100 ng/mL）を添加した。
6時間後，細胞を溶解し，Dual luciferase reporter assay system（Promega）を用い てルシフェラーゼ活性を測定した。 値は対照ルシフェラーゼ活性によって標準 化し，コントロールの値を100％とした相対値で表した。
7-5. ウエスタンブロット
RAW264細胞をACUおよびTOD（100 µM)で1時間処理し, 次いでLPS (100 ng /mL)にそれぞれ15および30分間暴露した。細胞をPBSで2回洗浄し，cOmpleteTM Lysis-MおよびPhos-STOPTM(Roche Diagnostic, Tokyo, Japan)を用いて溶解させた。
溶解物を13,000 rpmで5分間遠心分離し，上清を回収した。タンパク質含量は，
Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, USA)を用いて測定した。
ライセートを13,000 rpm，4 ℃で5分間遠心し，上清を回収した。上清のタンパ ク量は，Pirce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific)を用いて定量し，サンプル 間で均一となるよう適宜希釈した。ライセートを2-mercaptoethanolを 5%含有さ せた2×Lamimli Sample Buffer (Bio-Rad)に溶解させ，100 ℃で5分間変性させた。
同量のタンパクを SDS-PAGE にて分離し，PVDF メンブレン (Merck Millipore) に転写した。2% ECL Blocking reagent (GE Healthcare)でブロッキングを行った後，
TPBS で各種一次抗体を希釈し，4 ℃で一晩インキュベートした。その後，メン ブレンをTPBSにて4回洗浄し，2次抗体(GE Healthcare)にて室温，1 時間反応 させた。反応後，さらにTPBSで4回洗浄し，ECL Prime Western Blotting Detection Reagent (GE Healthcare)を添加し，LAS-4000 Luminescent Image Analyzer (GE Healthcare)を使用して検出した。タンパクの定量は，Multi Gauge version 3.11 software (Fujifilm Life Science)を用いて行った。
7-6. 細胞内取り込み量の定量
RAW細胞 (3.0×106細胞)を25 cm2のフラスコに播種し，100 μMのACUおよ びTODと共に4時間および24時間インキュベートした。 インキュベーション
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後，細胞をPBSで2回洗浄し，回収した細胞数を血球計算盤を用いて計測した。
1,000 rpmで2分間の遠心分離後, 1 mLのMeOHを添加し，細胞を数秒間超音
波処理により粉砕抽出した。 溶液を10,000 rpmで10分間遠心分離し，収集し た上清をN 2ガスで乾燥させた。乾燥物を200 μLのHPLC移動相に溶解し，0.2 μmのメンブレンフィルターを通して濾過した。 次に, 20 μLのサンプルをC18 カラム(Wakosil-Ⅱ5C18RS-Prep, 4.6×250 mm, 和光純薬工業株式会社)に注入し
た。 移動相は 50％アセトニトリル(ACU)または 70％アセトニトリル(TOD)を
使用した。流速は1 mL/min, UV波長310 nmにおける吸収を検出した。ACUお よびTODの標準品で検量線を作成し，ピーク面積値を定量に用いた。
7-7. 統計処理
統計解析は，GraphPad Prism V5.02 softoware for Windows (Graphpad Softoware) を用い，一元配置分散分析とDunnettもしくはTukey-Kramerの多重比較検定に 供した。5%未満の危険率で，コントロールとの有意差の有無を判定した。
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