雲5  0

出濃度も高かった（図17と図19）。このような結果から回収する蛋白質は、

βサブユニットのときと同じようにピーク以降で蛋白濃度もピークのときと比 べて1／2以上あるものにした。ピ・一一・一クより後（17番〜19番）を回収して次の冊65 疎水カラムクロマトグラフィにかけることにした。

 このような結果は、他のαサブユニットの精製のときでも同様になり、NaCl OM〜0．4Mまでの濃度勾配をかけたとき、蛋白質溶出濃度のピークは0．15M〜

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2．5

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16 P5

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B3        i         i

口

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岩1・5

1g      i

o

₁

0．5

1

0

0  5  10 15   20   25   30 フラクション番号

図18 α（D）のHW65カラムによる精製

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      マーカー16  17 18  19  16 17 18  19 精製前DEAE後αΦ）

      L＿＿＿＿＿＿＿」 L＿＿＿＿」

       DEAEカラム   HW65カラム

DAEAフラクション17番〜19番を回収して、 HVV65カラムで精製をした。 HW65フラクション17番〜19番を回収して蛋 白質標品α（D）にした。

      図19 α（D）精製の電気泳動

表3 αサブユニットの精製結果

No

^{菌種 菌量 SONIFIER後}

^ンパク量

DEAE後

^ンパク量： ピーク濃度

HW 65後

^ンハ0ク量 ピーク濃度

精製

T

^{pkkα／HB101 3．09 250mg 173mg}

0．16M

108mg

_0．56M 級ﾊ

○

W

^{pkkα／HB101 3．09 504mg 110mg}

^0．10M

^67mg

^0．60M

^×

Y

^{pkkα／HB101 3．99 787mg 135mg}

^0．11M

^130mg

^0．58M

^○

＊Z pkkα／HB 101 3．99 600mg 168mg

_0．15M

95mg

_0．54M ○

＊A

pkkα／HB 101 3．89 572mg 112mg

_0．15M

58mg

_0。54M ○

＊B ^{pkkα／HB101 2．19 168mg 73mg}

^0．18M

^21mg

^0．54M

^○

＊C ^{pkkα／HB101 4．09 338mg 202mg}

^0．16M

^43mg

^0．58M

^○

＊D pkkα／HB 101 4．39 728mg 152mg

_0．16M

88mg

_0．60M

○

＊E ^{pkkα／HB101 4．29 546mg 108mg}

^0．15M

^71mg

^{0．63M 使用せず}

＊F ^{pkkα／HB101 4．29 461mg 152mg}

^0．16M

^78mg

^{0．59M ○}

＊のマークがある物はピークより後のフラクションを回収したのも

＊のマークがない物はピーク前後のフラクションを回収したもの 精製結果について 0はこのタンパクを使って結晶ができたもの       ×はこのタンパクを使って結晶ができなかったもの

1−1−4．α3β3複合体の結晶化条件 1−1−4−1．添加物存在下での結晶化実験

 これまでの実験でα3β3複合体の結晶化条件は、再現性という点でまだ問題 が残っていた。しかし、精製方法の確立により純度の高い蛋白質を得られるこ

とができ結晶もコンスタントにできるようになった。それで、X線回折強度測 定にかけられる結晶（0．5mm以上）を確実に作ることに重点を移していった。

 そこで、DTTやEDTAを加えて結晶化を行い、より大きな結晶が得られるかを

試みた。

 DTT lmMとEDTA O．1mMを両方加えて結晶化をするとX線回折強度測定にかけ られるくらいの結晶（図20）がセットアップごとに必ず得られることができた

（表4）。また、1つのドロップの中にできる結晶の数も3〜4個できること もあり、何も入れないときと比べて多くできた。DTT lmMだけEDTA O．1rnMだけ の場合は、時々大きな結晶ができることはあるが再現性はあまりなかった。

表4 添加物存在下での結晶化実験結果

PEG濃度、結晶化結果 ^添加物 α3β3

ドキュメント内 好熱菌F1-ATPaseのα3β3複合体の構造解析 (ページ 43-46)