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0   5   10  15  20 25 30 35 40

フラクション番号

図12蛋白質標品FDのHW65カラムによる精製

マーカーα（F）β（D）精製前FD 31  32  33

  フラクション番号31番〜33番を回収して蛋白質上品FDにした。

 図13 蛋白質三品FD精製の電気泳動

1−1−2．βサブnニットの精製

 従来、DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィとHVV65疎水カラムクロマト グラフィの2段階で精製を行い、それぞれにおいて蛋白濃度のピークの前後を 標品として回収していた。そこで、βサブユニットの純度を上げるためにカラ

ム後のピーク付近の各フラクションを採って、SDS電気泳動で不純物の有無を 調べ、どのプロファイルを標語として回収したらよいかを検討した。

1−1−2一一1．DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィ

 蛋白濃度がピーク付近のフラクションを見てみると、ピー・一クより1つ前（20 番）ではβサブユニットのバンドの上下に他の蛋白質のバンドが表れて、バン

ドも濃く不純物が多く混在している。ピーク後になると他のバンドが薄くなっ て不純物が少なくなっている。ピークのフラクションより3つ目（24番）より 後は、蛋白濃度が低すぎる（図14）。このような結果から回収する蛋白質は、

ピーク以降で蛋白濃度もピークのときと比べて1／2以上あるものにした。ピー クより後（21番〜23番）を回収して次の冊65疎水カラムクロマトグラフィに

かけることにした（図14）。

 このような結果は、他のβサブユニットの精製の時でも同様になり、NaCl OM

〜0．5Mまでの濃度勾配をかけたとき、蛋白質溶出濃度のピークは0．22〜0．27M

であった。 （表2）。

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フラクション番号

図14 β（A）のDEAEカラムによる精製

1−1−2−2．HW 65疎水カラムクロマトグラフィ

 蛋白溶出濃度がピーク付近のフラクションを見てみると、ピークより1つ前

（17番）ではβサブユニットのバンドの上下に他の蛋白質のバンドが表れて、

バンドも濃く不純物が多く混合している。それが、ピーク後では、他の蛋白質 のバンドが薄くなっていて不純物が少なくなってきている。ピークのフラクシ

ョンより3つ目（21番）より後は、蛋白濃度が低すぎる（図15）。

 このような結果から回収する蛋白質は、ピ・…一・ク以降で蛋白濃度もピークのと きと比べて1／2以上あるものにした。このことによってαサブユニットは、ほ とんど不純物が混ざらないものになった。これをα3β3複合体の精製に使うこ とにした。この実験では、ピークより後（18番〜20番）を回収した。

 このような結果は、他のβサブユニットの精製の時でも同様になり、

（NH4）2SO41．2M〜OMまでの濃度勾配をかけたとき、蛋白質の溶出濃度ピークは 0．50〜0．54Mになった（表2）。

3

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フラクション番号

図15 β（A）のHW65カラムによる精製

     マーカー20 21 22 23 17 18 19 20精製前DEAE後β（A）

         一 一

         DEAEカラム  HW65カラム

DAEAフラクション21番〜23番を回収して、冊65カラムで精製をした。 HW65フラクション18番〜20番を回収して蛋

白質標品β（A）にした。

       図16 β（A）精製の電気泳動

表2 βサブユニットの精製の結果

No

^菌種 菌量 SONIFIER後

^ンハ．ク量

DEAE後

^ンパク量 ピーク濃度

HW 65後

^ンハ。ク量 ピーク濃度

精製

R

puc118β／HB 101 3．19 483mg 150mg

_0．29M

77mg

_0，46M 級ﾊ

○

T

puc118β／DK8 4．39 858mg 243mg

_0．24M

125mg

_0．52M △

V

puc 118β／HB 101 3．89

500溢g

210mg

_0．27M

113mg

_0．66M

×

＊X puc118β／HB 101 3．79 624mg 150mg

_0．27M

86mg

_0．48M

○

＊Y puc 118β／HB 101 3．89 573mg 176mg

_0。25M

67mg

_0．50M ○

＊A

puc 118β／HB 101 3．79 550mg 176mg

_0．22M

84mg

0．54M

^○

＊D puc118βノHB 101 4．19 599mg 174mg

_0．26M

92mg

_0．54M

○

＊のマークがある物はピークより後のフラクションを回収したのも

＊のマークがない物はピーク前後のフラクションを回収したもの 緒製結果について ○はこの蛋白質を使って結晶ができたもの

      Xはこの蛋白質を使って結晶ができなかったもの

      △はこの蛋白質を使って結晶はできたが大きくならなかったもの

1−1−3．αサブユニットの精製

 βサブユニットの精製と同様にDEAEイオン交換カラムクロマトグラフィと HW65疎水カラムクロマトグラフィの2段階で精製を行い、それぞれにおいて蛋

白濃度のピークの前後を標品として回収していた。そこで、αサブユニットの 純度を上げるためにカラム後のピーク付近の各フラクションを採ってSDS電気 泳動で不純物の有無を調べて、どのプロファイルを二品として回収したらよい

かを検討した。

H−3−1．DEAEイオン交換カラムクロマトグラフィ

 蛋白溶出濃度がピーク付近のフラクションを見ると、βサブnニットでは、

βサブユニットのバンドの上下に他の蛋白質のバンドがはっきり見えていたが、

αサブユニットでは、αサブユニットのバンドより上のバンドが薄くなってい た。ピーク前（16番）では、ピーク後（17番〜19番）と比べてαサブユニット のバンド部分も細くαサブユニットの蛋白溶出濃度が低かった。さらにαサブ ユニットのバンドの下に他の蛋白質のバンドがあり、このバンドも濃く不純物 が多く混在していた。ピーク（17番）では、ピーク以降（18番と19番）と比 べてαサブユニットのバンドより下で他の蛋白質のバンドが見られるがピーク 前（16番）と比べてこのバンドが薄く、αサブユニットのバンドも太く蛋白溶

出濃度も高かった（図17と図19）。このような結果から回収する蛋白質は、

βサブユニットのときと同じようにピーク以降で蛋白濃度もピークのときと比 べて1／2以上あるものにした。ピ・一一・一クより後（17番〜19番）を回収して次の冊65 疎水カラムクロマトグラフィにかけることにした。

 このような結果は、他のαサブユニットの精製のときでも同様になり、NaCl OM〜0．4Mまでの濃度勾配をかけたとき、蛋白質溶出濃度のピークは0．15M〜

ドキュメント内 好熱菌F1-ATPaseのα3β3複合体の構造解析 (ページ 38-43)