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        フラクション番号

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図33 DEAEカラムによる精製

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  マーカー14 23 24 25  26 27 28精製前 精製後

      フラクション26番〜28番を回収してBUTYLカラムでの精製に使った。

  図34 DEAEカラムによる精製の電気泳動

2−3−2．BUTYLイオン交換カラムクロマトグラフィー

 （NH4）2SO4濃度を0．75M〜OMまでの濃度勾配をかけて、さらにOMの（NH4）2SO4 バッファを流していくと、その直後にピークが表れた（図35）。

 電気泳動で各フラクションを調べるとピークより前（32番と33番）では、

α3β3γ複合体のバンドより上で他の蛋白質のバンドが濃く表れているがピ ークよりすぐ後（34番〜36番）になるとバンドが薄くなって不純物が少なくな っていた。さらに後になるとα3β3γ複合体のバンドの上下に他の蛋白質の バンドが表れてきて不純物が混ざっていた（図36）。

 その結果、ピークとその後のフラクションを回収してα3β3γ複合体の結 晶化にすることにした。

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フラクション番号

図35 BUTYLカラムによる精製

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      フラクション34番〜36番を回収して、α3β3γ複合体の蛋白質標品とした。

  図36 BUTYLカラムによる精製の電気泳動

表18 α3β3γ複合体の精製の結果

DEAE前 DEAE後 BUTYL後

菌体の種類 大腸菌量 ^{タンパク量 タンパク量 ピーク濃度 タンパク量 ピーク濃度 精製日}  JmO3△

iuncB−uncD）／pKABG1

39 399mg _124．7mg

0．32M

25．lmg OM 95．6．21

2−4．PEG 20K、 pH8での結晶化

 α3β3複合体を安定な状態にしておくためには、Na2SO4が必要であるが、

α3β3γ複合体はすでに安定な状態になっているので、脱塩のときNa2SO4が 入っていないpH7 bufferを使って透析をした蛋白質で結晶化を行った。

 Na2SO4濃度を0．05Mにしたときは、温度15℃、25℃ともに白濁するか変化が なかった。Na2SO4濃度を0．2MにしたところPEG濃度12％で白濁して、それよ

り低い濃度では変化がなかった。

 Na2SO4濃度を0．12Mにしたときは、温度15℃でPEG濃度IOo／・で0．1㎜くらい の結晶が無数でき、PEG濃度8％で0．2㎜くらいの結晶が2個できた。

 この条件は、α3β3複合体の結晶化条件と比べてPEG濃度が2％ぐらい下

がつた以外はすべて同じだった。しかし、結晶の大きさについては、X線強度 測定に用いられるほどではなかった。温度25℃では、PEG濃度8％で0．1mm以 下の結晶が無数できた（表19）。

表19 PEG20K，pH8での結晶化実験 PEG20K濃度

セツトアツフ．No 14％ 12％ 10％ ^{8％ 6％}

Na2SO4濃度

温度

3−1 白濁 白濁 白濁

C 0．05M 15℃

3−2 白濁 白濁 白濁 白濁

0．05M 25QC

3−3 白濁 白濁

0．1㎜結晶 0．2㎜結晶 0．12M 15℃

3−4 白濁 白濁 白濁 ^{α1以下結晶}

0．12M 25℃

3−5 白濁

C C

^0．2M

15℃

3−6 白濁

C C

^0．2M

25℃

3、βミュータントからのα3β3複合体の結晶化実験

 アミノ酸配列の1部が異なる蛋白質を使い、分子置換法でα3β3複合体の構 造解析を行うために、東京工業大学より、βE190Q、βY341A、βY341しの3 種類のβミュータントを供給してもらいそれをもとに実験を行った。

3−1．βE190Qの結晶化実験

 βE190Qは、βサブユニットのアミノ酸配列190番目のグルタミン酸をグル タミンに変えたもので、触媒基E190の電荷をとったために活性が消失したもの である。このことによって、α3β3複合体のATP活性をなくすはたらきがある。

これを使ってα3β3複合体を作り結晶化実験を行った。

3−1−1．βE190Qを使ったα3β3複合体の精製

 HW65カラムによってα3β3複合体の精製を行い、 SDS電気泳動でそれぞれの 蛋白質標品を調べた。αサブユニットに比べて、βE190Qサブユニットの方が

βのバンドの上下に他のタンパクのバンドがはっきり見えている。特にβのバ ンドの上よりも下の方がよりバンドが濃く表れていた（図38）。

 このβミュータントのα3β3複合体を精製すると（NH4）2SO4濃度が0．25Mのと きに蛋白濃度がピークになった（図37と表20）。この値は、α3β3複合体の精 製の値とほとんど一致した。

 さらに、このピーク付近のフラクションをSDS電気泳動で調べてみるとピーク の前後では、α3β3複合体のバンドの下では、あまり他の蛋白質のバンドの濃 さが変化していないけれど、上ではピーク前（34番）よりは、ピーク後（35番

〜37番）の方がバンドが薄くなってきて他の蛋白質が少なくなってきている。

 この結果から、蛋白質溶出濃度のピークより後のフラクションを回収するの が良いことがわかった。

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フラクション番号

図37HW65カラムによる精製

表20 βE1900を使ったα3β3複合体の精製の結果 HW65後

標品 ^{精製前タンパク量}

^{タンパク量}

^{ピーク濃度} 収率

GE

^{58．8㎎ 28．9mg}

^0．25M

^49％

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マーカーα（G） β（E）精製前精製後 34  35  36  37

       フラクション35番〜37番を回収して、蛋白質標品GEにした

   図38HW 65カラムによる精製の電気泳動

3−1−2．結晶化実験

 ct 3β 3ts合体の結晶化条件を基にして、PEG20K、 Na2SO4濃度0．12M、温度15℃

でpHを7．6〜8．4に変えて結晶化実験を行った。

 pH7．6のとき、 PEG濃度14％で0．3㎜の結晶が20個くらいできた。 pH8、 pH8．4 と比べても一番結晶の様子が良かった。

 pH8とpH8．4では、 PEG濃度120／・のとき金平糖状の結晶ができたが、 pH8の方が 若干大きな結晶ができた（表21）。

表21Na2SO4濃度＝0．12M，温度15℃での結晶化実験

PEG20K濃度

^温度

pH

セヅトアップNo 16％ 14％ 12％ 10％

1−1 白濁 0．3 20個 0．1金平糖状10個

C 150C

^7．6

1−2 0．1以下無数 0．1金平糖状60 0．3金平糖状4個

C 15℃ ⁸

1−3 0．5コ口無数 0．2 50個 ^{0．2金平糖状5個}

C 15℃

^8．4

 このような結果から、pH7．6が一番良い条件と考えた。そして、さらに条件を 探るために温度条件を調べることにした。

 温度だけを5℃、15℃、25℃と変えたところ、5℃のときPEG濃度12％と10％

で0．4mmくらいの結晶ができた。結晶の様子も他の温度のときと比べても一番

良かった。

 15。Cと25℃では、どちらもPEG濃度120／・のとき0．3mmくらいの二二の結晶が できた。結晶の数は15℃のときが多くできた（表22）。

表22Na2SO4濃度＝0．12M， pH7．6での結晶化実験

PEG20K濃度

^温度

pH

^その他

セヅトアツプNo 16％ 14％ 12％ 10％

1−4 0．1以下無数 ^{0．1金平糖状無数} α4  3個 ^0．41個 5℃ ^{7．6 凍結保存タンパク使用}

1−5 0．1以下無数 0．1 無数 0．3菱状5個

C

15℃ ^{7．6 凍結保存タンパク使用}

1−6 白濁 白濁 0．3菱状1個

C

^{25℃ 7．6 凍結保存タンパク使用}

 pH7．6のとき5℃で一番良い結晶が得られたので、pH 8のときでも同じように 調べた。5℃のときでは、葉状の結晶しか得られなかったが、15。Cのときで

はPEG濃度14％で0．3mmくらいの金平挙状の結晶や菱状の結晶を得ることができ た（表23）。

表23Na2SO4濃度＝0．12M， pH8での結晶化実験

PEG20K濃度

^温度

pH

セットアップNo 14％ 12％ 10％ 8％

2−1 0．4葉状20個 0．4葉状20個

C C

^5QC

⁸

2−2 0．3金平糖状10個 0．1 2個

C C

15℃ ⁸

2−3 0．3菱状30個

1．0葉状7個 C C

15℃

⁸

 以上のような結果から、βサブユニットにE190Qを使ったα3β3複合体の 結晶化条件は、①PEG20 Kで濃度10％〜12％、 pH7．6、温度15℃、 Na2SO4濃度 0．12Mが一番良いことがわかった。

 その他の条件では②PEG20 Kで濃度14％、pH 8、温度5。C、Na2SO4濃度0．12M

③PEG20 Kで濃度14％、 pH7．6、温度15℃、 Na2SO4濃度0．12Mであることがわ かった。

3−1一一3．X線回折強度測定

 菱状の結晶を高エネ研でX線回折強度測定をしたところ、3．3Aくらいの分解 能のデータが得られた。

3−2．βY341Aの結晶化実験

 βY341Aは、βサブユニットのアミノ酸配列341番目のチロシンをアラニン に変えたものである。このβY341Aを使ったα3β3複合体は、 ATPへの親和 性が野生型より大変弱くなるが、過剰のATP存在下では酵素活性が野生型より 大きくなる。これを使ってα3β3複合体を作り結晶化実験を行った。

3−2−1．βY341Aの精製

 DEAEカラムを用いてβY341Aの精製をした。 NaC10M〜0．5Mまでの濃度勾配 をかけたときピークが2っ出た（図39）。1っは、0．17M付近でもう1つは、

0．28M付近であった（表24）。βY341Aをサブユニットに持つ、α3β3複合 体をDEAEカラムで精製するとNaCl濃度が0．17M（12番）とO． 28M（20番）で 蛋白濃度がピークになった（図39）。各フラクションをSDS電気泳動で調べる と0．28MのときがβY341Aのバンドであることがわかった。また、この濃度は、

βサブユニットのときのピーク濃度と同じだった。ピークより2つ前（18番）

では、βY341Aのバンドがない。1っ前では、βY341Aのバンドはあるがその 上下で他の蛋白質のバンドが濃く表れている。ピークより後（2G番〜21番）に なると他の蛋白質のバンドが薄くなっている。それ以降では、再び他の蛋白質 のバンドが目立ってきた（図41）。

 その結果、DEAEカラムによる精製は、ピークより後を回収してそれをHW65 カラムによる精製にかけることにした。

 12 な10器 万き 

ドキュメント内 好熱菌F1-ATPaseのα3β3複合体の構造解析 (ページ 65-73)