神経細胞実験

4.7章で示した手法と同じ手順にて神経細胞実験を行った。実験系を図4-56に示 す。また、実験の様子を図 4-57 に示す。実験開始直後は外部からのノイズが大き く、神経細胞の電位を取得できなかった。そこで、計測部分をアルミホイルで覆い、

外部からの電磁場を遮断する構造とした。結果を図 4-58 に示す。外部ノイズ遮断 前と比較して、外部ノイズの低減がなされた。しかし、ノイズが軽減された時点で、

実験開始から2時間ほどが経過しており、本来であれば電極から定期的に取得され る細胞電位が見られなかったので、ディッシュ内の神経細胞が死滅したと考えられ る。

図4-56 電位取得実験系

(a)広域 (b)狭域

図4-57 電位取得実験の様子

127

(a)外部ノイズ遮断前 (b)外部ノイズ遮断後

図4-58 取得電位のグラフ

時間[s]

電位[mV]

時間[s]

電位[mV]

128

4.10 結言

本章では、神経細胞ネットワークを解明する手法の一つであるOptogeneticsでの応 用を目指し、神経細胞培養による集積化に用いる材料検討、生体内の局所に対し集光 した可視光を照射するマイクロレンズ、細胞電位取得用微細電極、そして輝点となる ピンホールと光源固定構造の集積化方法を検討した。

・神経細胞を培養できるチップ表面状態を取得する目的で、電極とSU-8で覆われた チップ表面を、作製条件を変更して構築し、神経細胞を播種することにより表面状態 を評価した。神経細胞ネットワークの構築に適したチップ表面の作製条件を求めた。

SU-8 をハードベークすることで、細胞培養用のポリスチレンと同様の神経細胞の伸 展が見られた。

・神経細胞ネットワーク上の局所領域への光刺激を目的に、電極とマイクロレンズを 表面に集積したチップを作製した。SU-8 とガラス基板上の半球形状を利用したマイ クロレンズ、および電極のフォトリソグラフィとエッチングのみを用いたチップ上へ の集積化方法を提案・検討した。作製したマイクロレンズの形状等を評価したところ、

クラックなどの存在しない滑らかな半球形状を有していることがわかった。また、各 電極の界面抵抗は白金めっきにより軽減できた。

・チップ上に電極・マイクロレンズに加えてピンホールを集積した。光の散乱を抑制 する目的で、マイクロレンズとピンホールは基板の裏面側に集積した。作製されたチ ップを観察した結果、各要素を設計した配置で作製できた。マイクロレンズとピンホ ールを基板裏面側に集積したことで、外部の発行光源とチップ間の距離を小さくした。

光源を有するデバイスを作製し、デバイスに格納した光源からチップに対して細胞刺 激光を入射したところ、チップ上面側に細胞刺激光が照射されていた。チップに光源 が近接したので、チップ上に照射される細胞刺激光の輝度値が増したと考えられる。

・電極、マイクロレンズ、ピンホールと合わせて、光源を固定する構造を集積した。

Si 基板の垂直異方性加工により、光源の固定構造を作製し、SU-8 の接着性を利用し て集積した。各光源から異なる光が照射され、マイクロレンズを通過した光を評価し たところ、各輝点から異なる波長の光を同時に照射できた。

以上の結果より、最大4つの微細要素を集積したチップは、神経細胞ネットワーク 内の局所領域に対して、異なる波長の光を同時に照射でき、細胞電位を取得できると 期待される。また、4つの微細要素の集積方法は、他の細胞の操作用バイオマイクロ デバイスに応用できると考えられる。

129

参考文献

[1] J.C. McDonald, D.C. Duffy, J.R. Anderson, D.T. Chiu, H. Wu, O.J.A. Schueller, and G.M. Whitesides, “Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane)”, Electrophoresis, Vol. 21, pp. 27-40, 2000.

[2] L. Amato, S.S. Keller, A. Heiskanen, M. Dimaki, J. Emneus, A. Boisen, and M. Tenje,

“Fabrication of high-aspect ratio SU-8 micropiller arrays”, Microeletronic Engineering, Vol. 98, pp. 483-487, 2012.

[3] Y. Chuang, F. Tseng, J. Cheng, and W. Lin, “A novel fabrication method of embedded micro-channels by using SU-8 thick-film photoresists”, Sensors and Actuators A:

Physical, Vol. 103, pp. 64-69, 2003.

[4] N. Shiraishi, M. Kimura, and Y. Ando, “Basic characteristic of polycarbonate-based dual cantilever sensors for detecting VOC”, The Japan Society of Machanical Engineering, Vol. 1, pp. MN0055_1-MN0055_12, 2014.

[5] S. Yoo and Y. Toi, “Numerical simulation of mechanical sensors using hydrated IPMCs”, The Japan Society of Machanical Engineering, Vol. 2, pp. 14-00326_1-14-00326_16, 2015.

[6] H. Miyajima, N. Asaoka, M. Arima, Y. Minamoto, K. Murakami, K. Tokuba, and K.

Matsumoto, “A durable, shock-resistant electromagnetic optical scanner with polyimide-based hinges”, Journal of Micromechanical Systems, Vol. 10, pp. 418-424, 2001.

[7] T. Fujiya, K. Maenaka, and Y. Takayama, “Dual-axis MEMS mirror for large deflection-angle using SU-8 soft torsion beam”, Sensors and Actuators A: Physical, Vol. 121, pp.

16-21, 2005.

[8] A. Ezkerra, L.J. Fernandez, K. Mayora, and J.M. Ruano-Lopez, “A microvalve for lab-on-a-chip applications based on electrochemically actuated SU8 cantilevers”, Sensors and Actuators B: Chemical, Vol. 155, pp. 505-511, 2011.

[9] C.K. Chung, Y.J. Syu, H.Y. Wang, C.C. Cheng, S.L. Lin, and K.Z. Tu, “Fabrication of flexible light guide plate using CO2 laser LIGA-like technology”, Microsystem Technologies, Vol. 19, pp. 439-443, 2013.

[10] J.H. Lee, H. Lee, B. Lee, W. Chol, H. Chol, and J. Yoon, “Simple liquid crystal display backlight unit comprising only a single-sheet micropatterned polydimethylsiloxane

130

(PDMS) light-guide plate”, Optics Letters, Vol. 32, pp. 2665-2667, 2007.

[11] C.H. Chien, C.T. Pan, C.C. Hsieh, C.M. Yang, and K.L. Sher, “A study of the geometry of microball lens arrays using the novel batch-fabrication technique”, Sensors and Actuators A: Physical, Vol. 122, pp. 55-63, 2005.

[12] T. Kobayashi, H. Masuda, C. Kitsumoto, M. Haruta, M. Motoyama, Y. Ohta, T. Noda, K. Sasagawa, T. Tokuda, S. Shiosaka, and J. Ohta,“Functional brain fluorescence plurimetry in rat by implantable concatenated CMOS imaging system”, Biosensors and Bioelectronics, Vol. 53, pp. 31-36, 2014.

[13] X. Li, T. Abe, and M. Esashi, “Deep reactive ion etching of pyrex glass using SF6

plasma”, Sensors and Actuators A: Physical, Vol. 87, pp. 139-145, 2001.

[14] K.A. Khan and I. Adesida, “High rate etching of SiC using inductively coupled plasma reactive ion etching in SF6-based gas mixtures”, Applied Physics Letters, Vol. 75, pp.

2268-2270, 1999.

[15] C. Sun, P. Jiang, and B. Jiang, “Broadband moth-eye antireflection coatings on silicon”, Applied Physics Letters, Vol. 92, pp. 061112_1-061112_1, 2008.

[16] S. Fang, H. Shang, P.F. Jao, K. Kim, J.H. Yoon, K. Cho, A.J. Katz, and Y. Yoon,

“Mechano-active tissue scaffold system based on a magnetic nanoparticle embedded nanofibrous membrane”, Electrophoresis, Vol. 21, pp. 27-40, 2000.

[17] E. Calabrese, A. Badea, C.L. Coe, G.R. Lubach, Y. Shi, M.A. Styner, and G.A. Johnson,

“A diffusion tensor MRI atlas of the postmortem rhesus macaque brain”, NeuroImage, Vol. 117, pp. 408-416, 2015.

[18] R. Belaich, S. Boujraf, A. Housni, M. Maaroufi, F. Batta, R. Magoul, T. Sqalli, M.

Errasfa, and S. Tizniti, “Assessment of hemodialysis impact by polysulfone membrane on brain plasticity using Bold-FMRI”, Neuroscience, Vol. 288, pp. 94-104, 2015.

[19] A.A. Willette, C.L. Coe, R.J. Colman, B.B. Bendlin, E.K. Kastman, A.S. Field, A.L.

Alexander, D.B. Allison, R.H. Weindruch, and S.C. Johnson, “Calorie restriction reduces psychological stress reactivity and its association with brain volume and microstructure in aged rhesus monkeys”, Psychoneuroendocrinology, Vol. 37, pp. 903-916, 2012.

[20] R.L. Savoy, “Evolution and current challenges in the teaching of functional MRI and functional brain imaging”, NeuroImage, Vol. 62, pp. 1201-1207, 2012.

131

[21] I.N. Christie, J.A. Wells, P. Southem, N. Marina, S. Kasparov, A.V. Gourine, and M.F.

Lythgoe, “fMRI response to blue light delivery in the naïve brain: implications for combined optogenetic fMRI studies”, NeuroImage, Vol. 66, pp. 634-641, 2013.

[22] S.J. Short, G.R. Lubach, A.I. Karasin, C.W. Olsen, M. Styner, R.C. Knickmeyer, J.H.

Gilmore, and C.L. Coe, “Maternal influenza infection during pregnancy impacts postnatal brain development in the rhesus monkey”, Biological Psychiatry, Vol. 67, pp.

965-973, 2010.

[23] G. Ruffini, M.D. Fox, O. Ripolles, P.C. Miranda, and A. Pascual-Leone, “Optimization of multifocal transcranial current stimulation for weighted cortical pattern targeting from realistic modeling of electric fields”, NeuroImage, Vol. 89, pp. 216-225, 2014.

[24] K. Deisseroth, “Optogenetics”, Nature Methods, Vol. 8, pp. 26-29, 2011.

[25] Y. Juri, S. Komai, A. Okonogi, M. Ohoka, K. Tatsumi, H. Shintaku, R. Yokoyama, and H. Kotera, “Micro-device for light-induced stimulation on cells via light-responsive proteins”, The Japan society of Mechanical Engineering, Vol. 12, pp. J161043_1- J161043_3, 2012.

[26] K. Kwon, H. Lee, M. Ghovanloo, A. Weber, and W. Li, “Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application”, Frontiers in Systems Neuroscience, Vol. 9, pp. 60_1-60_12, 2015.

[27] B. Fan and W. Li, “Miniaturized optogenetic neural implants: a review”, Lab-on-a-Chip, Vol. 19, pp. 3838-3855, 2015.

[28] A. Vaziri and V. Emiliani, “Reshaping the optical dimension in optogenetics”, Current Opinion in Neurobiology, Vol. 22, pp, 128-137, 2012.

[29] A. Tagawa, H. Minami, M. Mitani, T. Noda, K. Sasagawa, T. Tokuda, H. Tamura, Y.

Hatanaka, Y. Ishikawa, S. Shiosaka, and J. Ohta, “Multimodal complementary metal–

oxide–semiconductor sensor device for imaging of fluorescence and electrical potential in deep brain of mouse”, Japanese Journal of Applied Physics, Vol. 49, pp. 01AG02_1-01AG02_5, 2010.

[30] F. Wu, E. Stark, M. Im, I.J. Cho, E.S. Yoon, G. Buzsaki, K.D. Wise, and E. Yoon, “An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications”, Journal of Neural Engineering, Vol.

10, pp. 056012_1-056012_18, 2013.

132

[31] M. Im, I.J. Cho, F. Wu, K.D. Wise, and E. Yoon, “Neural probes integrated with optical mixer/splitter waveguides and multiple stimulation sites”, Proceedings of the IEEE International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS) 2011, pp.

1051-1054, 2011.

[32] Y. Lu, Y. Li, J. Pan, P. Wei, N. Liu, B. Wu, J. Cheng, C. Lu, and L. Wang, “Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)/poly(styrenesulfonate)-poly(vinyl alcohol)/ poly(acrylic acid) interpenetrating polymer networks for improving optrode-neural tissue interface in optogenetics”, Biomaterials, Vol. 33, pp. 378-394, 2012.

[33] M.R. Warden, J.A. Cardin, and K. Deisseroth, “Optical neural interfaces”, Biomedical Engineering, Vol. 16, pp. 103-129, 2014.

[34] J. El-Ali, P. K. Sorger, and K.F. Jensen, “Cells on chips”, Nature, Vol. 442, pp. 403-411, 2006.

[35] M.B. Esch, J.H. Sung, J. Yang, C. Yu, J. Yu, J.C. March, and M.L. Shuler, “On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic ‘body-on-a-chip’ devices”, Biomedical Microdevices, Vol. 14, pp. 895-906, 2012.

[36] D. Huh, D.C. Leslie, B.D. Matthews, J.P. Fraser, S. Jurek, G.A. Hamilton, K.S.

Thorneloe, M.A. McAlexander, and D.E. Ingber, “Human disease model of drug toxicity–induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice”, Bioengineering, Vol. 4, pp. 147-159, 2012.

[37] J.H. Tsui, W. Lee, S.H. Pun, J. Kim, and D. Kim, “Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production”, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 65, pp. 1575-1588, 2013.

[38] S.N. Bhatia and D.E. Ingber, “Microfluidic organs-on-chips”, Nature Biotechnology, Vol. 32, pp. 760-772, 2014.

[39] D. Huh, B.D. Matthews, A. Mammoto, M. Montoya-Zavala, H.Y. Hsin, and D.E. Ingber,

“Reconstituting organ-level lung functions on a chip”, Science, Vol. 328, pp. 1662-1667, 2010.

[40] M. Ashraf, C. Gupta, F. Chollet, S.V. Springham, and R.S. Rawat, “Geometrical characterization techniques for microlens made by thermal reflow of photoresist cylinder”, Optics and Lasers in Engineering, Vol. 46, pp. 711-720, 2008.

133

[41] E. Roy, B. Voisin, J.F. Gravel, R. Peytavi, D. Boudreau, and T. Veres, “Microlens array fabrication by enhanced thermal reflow process: towards efficient collection of fluorescence light from microarrays”, Microelectronic Engineering, Vol. 86, pp. 2255-2261, 2009.

[42] Z. Lian, S. Hung, M. Shen, and H. Yang, ”Rapid fabrication of semiellipsoid microlens using thermal reflow with two different photoresists”, Microelectronic Engineering, Vol.

115, pp. 46-50, 2014.

[43] J. Yang, Y. Liao, and C. Chen, “Fabrication of long hexagonal micro-lens array by applying gray-scale lithography in micro-replication process”, Optics Communications, Vol. 270, pp. 433-440, 2007.

[44] H. Oh, G. Kim, H. Seo, Y. Song, K. Lee, and S.S. Yang, “Fabrication of micro-lens array using quartz wet etching and polymer”, Sensors and Actuators A: Physical, Vol.

164, pp. 161-167, 2010.