多孔メンブレン集積スカフォールド上での

まず、HeLa細胞をスカフォールド側に播種してから24時間後に、HepG2細胞を 多孔メンブレン側に播種し、さらに、2日間共培養を行った際の多孔メンブレン集 積スカフォールド表面の蛍光画像を図3-11に示す。多孔メンブレン側のHepG2細

胞を図3-11(a)に、スカフォールド側のHeLa細胞を図3-11(b)に示す。いずれの画像

においてもそれぞれの細胞から発せられる蛍光がみられた。細胞を播種した多孔メ ンブレン集積スカフォールドを細断し断面を観察した蛍光画像を図 3-12 に示す。

多孔メンブレン側には赤色蛍光、スカフォールド側には緑色蛍光が主に見られた。

ここで、細胞を播種した多孔メンブレン集積スカフォールドは、観察の直前に培地 や PBS 内で流体力学的な外力を受けているので、構造に接着していない細胞は滑 落していると考えられる。HepG2細胞から発せられている赤色蛍光は、多孔メンブ レン集積スカフォールドの多孔メンブレン側で見られ、HeLa 細胞から発せられる 緑色蛍光はスカフォールド側から見られる。よって、2種の細胞は多孔メンブレン スカフォールドの構造両面の表面上に接着しているといえる。また、HeLa 細胞の 緑色蛍光は断面画像内のスカフォールドの表面には見られるが、スカフォールドの 内部には見られないので、HeLa 細胞は播種された後の数日間の培養では、スカフ ォールドの表面にしか接着せず、スカフォールド内部をHeLa細胞で満たして3次 元の細胞構造を再現するには、共培養前に、長期間のHeLa細胞を培養する必要が あることがわかった。

そこで、多孔メンブレンのスカフォールド側にHeLa細胞を播種した後、HeLa細 胞のみを長期間培養した結果として、多孔メンブレン側とスカフォールド側のそれ ぞれの蛍光画像を図3-13と図3-14に示す。播種後3日目においては、細胞からの 蛍光はスカフォールド側にしか見られない。播種後 12 日目以降では、細胞からの 蛍光は多孔メンブレン下にも見られる。播種後 19 日目に、多孔メンブレン集積ス カフォールドを切断し、その断面を観察した。観察結果を図3-15に示す。HeLa細 胞は、スカフォールド内部を満たし、多孔メンブレン直下まで達しており、3次元

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的な細胞構造を構築できていることがわかった。

最後に、3 次元的な細胞構造をスカフォールド内に構築できる培養条件で HeLa 細胞を培養し、その後、その多孔メンブレン集積スカフォールドの多孔メンブレン

側にHepG2細胞を播種し、5日間培養した実験の結果について、培養後の蛍光画像

を図 3-16 に示す。多孔メンブレン側に赤色蛍光が見られ、スカフォールド側に緑 色蛍光が見られる。さらに、多孔メンブレン集積スカフォールドを切断した断面の 蛍光画像を図 3-17 に示す。多孔メンブレン上にはシート状の赤色蛍光、スカフォ ールド側には厚さがある緑色蛍光が見られる。両方の細胞からの蛍光が見られるこ とから、5日間の共培養後においても、それぞれの細胞が多孔メンブレン表面とス カフォールド内部に接着しており、多孔メンブレン集積スカフォールド内で増殖し た HeLa 細胞と多孔メンブレン表面に接着した HepG2 細胞は共培養できることが わかった。

今後、接着した細胞の代謝能保持評価として、他の種類の細胞、特に初代培養細 胞など株化していない細胞における細胞組織の構築について検討する必要がある。

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(a) HepG2細胞を播種した多孔メンブレ

ン側

(b) HeLa細胞を播種したスカフォールド

側

図3-11 HeLa細胞播種3日後、HepG2細胞播種2日後の多孔メンブレン集積スカフ

ォールドの表面の蛍光画像

図3-12 HeLa細胞播種3日後、HepG2細胞播種2日後の多孔メンブレン集積スカフ

ォールドの断面蛍光画像

300 m 300 m

100 m HeLa cell

HepG2 cell

Alvetex Scaffold

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(a) 播種後3日後 (b) 播種後12日目 (c) 播種後19日目

図3-13 HeLa細胞をスカフォールド側に播種した多孔メンブレン集積スカフォー

ルドの多孔メンブレン側の時系列観察蛍光画像

(a) 播種後3日後 (b) 播種後12日目 (c) 播種後19日目

図3-14 HeLa細胞をスカフォールド側に播種した多孔メンブレン集積スカフォー

ルドのスカフォールド側の時系列観察蛍光画像

図3-15 HeLa細胞をスカフォールド側に播種した多孔メンブレン集積スカフォー

ルドの断面蛍光画像

100 m 100 m

100 m

Alvetex Scaffold HeLa cell

100 m 100 m

100 m 100 m

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(a) 共培養5日目の多孔メンブレン集 積スカフォールドの多孔メンブレン側 の蛍光画像

(b) 共培養5日目の多孔メンブレン集 積スカフォールドのスカフォールド側 の蛍光画像

図3-16 共培養5日目の蛍光画像

図3-17 共培養5日目の多孔メンブレン集積スカフォールドの断面の蛍光画

像

100 m Alvetex scaffold内の

HeLa Cell

SU-8多孔メンブレン上の HepG2 Cell

300 m 300 m

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