第 4 章 ：オプトジェネティクスへの応用
4.6 神経細胞培養用の基板表面材料評価
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(a)マイクロレンズ→電極(Au残存) (b)電極→マイクロレンズ(良好)
図4-11 異なる手順で作製したマイクロレンズの画像
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件でPEBを行い、1 hリラクゼーションする。現像液（SU-8 developer、Microchem）
に2 min浸して現像し、2-プロパノール（EL 2-プロパノール、関東化学）を用いて
2 minリンスする。各現像、エッチングおよび洗浄後には500 mLのテフロンカップ
に満たした純水により、リンスを3回行う。120 °C 1 hハードベークを行う。ガラ ス基板にガラスリングを、PDMS を用いて接着し、細胞培養用のチャンバとする。
チャンバ内に白金電解液（DEFB2004、平沼産業）を充填させ、電解めっきにより 電極パッド上へ40000 mA/cm2、10 minの条件で白金をめっきする。めっき後、0.1
mol/Lの硫酸をチャンバ内に充填し、陽極と陰極を反転させ、それぞれ 3 min間ず
つめっき時と同じ条件で通電を行う。本操作により、白金上の残留塩素を除去する。
(a)Au配線形成
(b)SU-8保護膜成膜
(c)ガラスリング接着
(d)白金成膜
図4-12 神経細胞ネットワーク構築性評価用チップ作製断面模式図
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4.6.2 評価チップ作製結果
作製したチップの画像を図 4-13 に示す。電極パッドはチップの中心に作製され ている。電極パッド表面は白金でめっきされている。その他の領域は SU-8 により コーティングされている。チップ表面の状態より、神経細胞に接触する材料は白金 あるいはSU-8のいずれかとなる。
図4-13 神経細胞培養評価用チップの画像
4.6.3 評価実験の流れ
神経細胞ネットワークの構築性評価実験は、底面材料の状態を考慮して実施した。
まず、200 °Cのハードベーク処理を行わない状態のチップと、ポリスチレンチップ
を比較して神経細胞の状態を観察した。2回目の試行では、神経細胞同士は軸索を 伸ばし他の神経細胞と結合する。その際、神経細胞の密度が適切でないと、細胞は 自身でアポトーシスを起こすなど適切に培養されないので、神経細胞の密度を変化 させて実験を行った。3回目の試行では、チップに対して200 °Cのハードベーク処 理を行い、神経細胞の様子を観察した。
4.6.4 実験結果と考察
まず、底面材料による、神経細胞の構築性評価を目的に、ポリスチレンのディッ シュと作製したチップ上に神経細胞を培養した。神経細胞にはマウス胎児脳から取 得した神経細胞を利用した。ポリスチレンディッシュと作製したチップ上での神経
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細胞の様子を図 4-14 に示す。ポリスチレンのチップ上においては、神経細胞ネッ トワークが形成されている様子が観察できた。一方、作製したチップ上では、神経 細胞間のネットワークとなる軸索の伸展が、ポリスチレンチップと比較して劣って いることがわかった。
(a)ポリスチレンディッシュ (b)作製チップ
図4-14 各基板上で培養した神経細胞の画像
次に、神経細胞の密度による神経細胞ネットワークの構築性を評価した。細胞密 度向上を目的に、チップ中心にシリコーンチューブ（内径6 mm/外径10 mm/高さ5
～6 mm）を配置した。このチップに神経細胞ネットワークを構築した結果を図 4-15に示す。シリコーンチューブを用い、播種範囲を縮小することで、神経細胞密度 は向上しているが、ネットワークとなる軸索の本数はあまり変化していない。また、
中心部から離れていない部分においてもネットワークが形成されていないので、電 極パッド上の白金の影響ではなく、SU-8 からの影響が神経細胞の接着を阻害して いると考えられる。
200 m 200 m
神経細胞の軸索
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(a)チップ中心 (b)チップ中心外 図4-15細胞密度を変化させて各基板上で培養した神経細胞の画像
SU-8 は、加熱により未架橋部分を完全に架橋させることができるので、これま でのチップでは、ハードベークを 120 °Cで行ってきた。しかし、120 °Cでは十分 に未架橋部分を架橋できていなかったと考え、ハードベーク温度を 200 °C に変更 してチップを再作製した。作製条件を変更したチップ上での神経細胞のネットワー ク構築性の評価結果を図 4-16 に示す。条件変更後は、作製したチップにおいても ポリスチレンチップと同等の神経細胞ネットワークが形成されている様子が見ら れた。ハードベークにより、SU-8の未架橋部分が向上した結果、神経細胞への影響 が軽減されたと考えられる。
(a)ポリスチレンチップ (b) SU-8のハードベーク条件を変更
したチップ
図4-16各基板上で培養した神経細胞の画像
200 m 200 m
200 m 200 m
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