材料と方法

(1)岩石試料採取および試料からの DNA 抽出

東立坑の掘削に伴い得られる岩石ブロック (20～30cm角)を採取し、酸素による酸化を防止 するために直ちにラッピングを行い難透気性樹 脂バックに封入し、冷蔵輸送した。岩石試料を 嫌気チャンバー内で滅菌済み機器を用いて破砕 し、外気と未接触であるブロック内部を取り出 し、さらに滅菌済み乳鉢にて粉砕し、砂状にし たものを微生物解析用試料とした。

粉砕試料 10g を供し市販 DNA 抽出キット (UltraClean Soil DNA Purification kit, MO Bio Laboratories)を用いて堆積岩中のDNAを抽出し た 。DNA 抽 出 過 程 に お い て 、 試 料 粉 砕 装 置 (FastPrep FP100A, MP-Biochemicals)を用いて 超粉砕を行った。得られた DNA 抽出溶液 1ml はグリコーゲンを共沈剤として用いエタノール 沈殿により 100l に濃縮し、以下の実験に用い る DNA 試 料 と し た 。DNA 試 料 は 吸 光 度 計 (Bio-Rad)を用いて 260nm および 280nm の吸光 度測定を行い、DNA濃度および純度を決定した。

(2)PCR 法

¹⁾

特 異 的 に 微 生 物 遺 伝 子 を 増 幅 す る た め PCR(Polymerase Chain Reaction)反応を行った。微 生物種の推定のため微生物16S rRNA V3-5領域を ターゲットとし、バクテリア(真正細菌)16S rRNA、

アーキア(古細菌)²⁾16S rRNA、および、嫌気環境

1) 定量PCR法：特定の遺伝子の存在量（コピー数）

をPCR反応を用いて定量する方法

2) アーキア（古細菌）：生物分類上の一つのドメイン

（界）。生物は、生化学的性質などから、真核生物、バ クテリアおよびアーキアの３つに分類される。一般的 に、アーキアには、メタン菌、好塩菌、好熱菌などの 極限環境生物が分類される。

における微生物反応例として、メタン代謝反応に 関 わ る 微 生 物 種 の 検 出 の た め に methyl coenzyme-M reductase (mcrA)、硫酸還元反応に関 わ る 微 生 物 種 の 検 出 の た め に dissimilatory sulfite reductase (dsrAB)、これらの遺伝子を標的 にした PCR 増幅を行った。PCR 反応条件、使 用したプライマーセットを表 3.7-1、3.7-2 に示 した(Hales et al. 1996, Karkhoff- Schweizer et al.

1995)。PCR 1反応にはDNA試料2lを供した。

反応終了後 PCR産物2lを0.8%または2.0%ア ガロースゲル電気泳動に供し目的断片の増幅、

サイズを確認した。

(3)定量 PCR 法

堆積岩中の微生物量を推定するために定量 PCR法を用い、バクテリア16S rRNA遺伝子お よびアーキア16S rRNA遺伝子の定量化を行っ

た。定量PCR試薬(LightCycler® TaqMan® Master, Roche)お よ び 定 量 PCR 装 置(LightCycler®

1.5(ST300), Roche)を用い、TaqMan法(5’-nuclease

assay)によりDNA試料中の微生物遺伝子の定量

解析を行った。定量PCR反応条件、使用したプ ライマーおよびプローブセットを表3.7-3，3.7-4 に示した。定量PCR 1反応には、DNA試料2l を供し、プライマーおよびプローブの濃度はそ れぞれ0.5 M、0.1 Mであった。

(4)微生物活性測定

嫌気性グローブボックス内にて粉砕した岩石 試料1gを秤量し、5mlの硫酸還元菌用培地およ びメタン菌用培地(表3.7-5)に添加した。添加後、

直ちにブチルゴムおよびアルミキャップで密栓 し、嫌気性グローブボックス内にて30℃恒温振 とうした。

表 3.7-1 PCR 反応条件

表 3.7-2 PCR 反応に用いたプライマー配列

Target gene Bacterial 16S Archaeal 16S mcrA dsrAB

Cycle 1 96C, 2min. 96C, 2min. 96C, 2min. 96C, 2min.

Cycle 2 (x 30) (x 30) (x 35) (x 35)

Step 1 96C, 20sec. 96C, 20sec. 96C, 20sec. 96C, 20sec.

Step 2 50C, 20sec. 50C, 30sec. 40C, 1min. 45C, 1min.

Step 3 72C, 1min. 72C, 1min. 72C, 1min. 72C, 2min.

Cycle 3 4C, ∞ 4C, ∞ 4C, ∞ 4C, ∞

Enzyme HS^a) HS^a) GXL^b) GXL^b)

Target gene Bacterial 16S Archaeal 16S mcrA dsrAB

Cycle 1 96C, 2min. 96C, 2min. 96C, 2min. 96C, 2min.

Cycle 2 (x 30) (x 30) (x 35) (x 35)

Step 1 96C, 20sec. 96C, 20sec. 96C, 20sec. 96C, 20sec.

Step 2 50C, 20sec. 50C, 30sec. 40C, 1min. 45C, 1min.

Step 3 72C, 1min. 72C, 1min. 72C, 1min. 72C, 2min.

Cycle 3 4C, ∞ 4C, ∞ 4C, ∞ 4C, ∞

Enzyme HS^a) HS^a) GXL^b) GXL^b)

a) HS; PrimeSTAR HS polymerase (Takara Bio), b) GXL; PrimeSTAR GXL polymerase.

Primers Sequences (5’-3’) Target gene Amplicon size Ref.

B341f CCT ACG GGA GGC AGC AG

B954r CCA CAT GCT CCA CCG CTT GTG C Bacterial 16S 約600bp A109f ACK GCT CAG TAA CAC GT

A915r GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT Archaeal 16S 約800bp

ME1f GCM ATG CAR ATH GGW ATG TC

ME2r TCA TKG CRT AGT TDG GRT AGT mcrA 約770bp Hales et al. 1996

DSR1F ACS CAC TGG AAG CAC G Karkhoff-Schweizer

DSR4R GTG TAG CAG TTA CCG CA dsrAB 約1900bp et al. 1995

Primers Sequences (5’-3’) Target gene Amplicon size Ref.

B341f CCT ACG GGA GGC AGC AG

B954r CCA CAT GCT CCA CCG CTT GTG C Bacterial 16S 約600bp A109f ACK GCT CAG TAA CAC GT

A915r GTG CTC CCC CGC CAA TTC CT Archaeal 16S 約800bp

ME1f GCM ATG CAR ATH GGW ATG TC

ME2r TCA TKG CRT AGT TDG GRT AGT mcrA 約770bp Hales et al. 1996

DSR1F ACS CAC TGG AAG CAC G Karkhoff-Schweizer

DSR4R GTG TAG CAG TTA CCG CA dsrAB 約1900bp et al. 1995

表 3.7-3 定量 PCR 反応条件

表 3.7-4 定量 PCR 反応に用いたプライマーおよびプローブ配列 (Suzuki et. al., 2000)

表 3.7-5 微生物活性測定に用いた培地組成

Primers Sequences (5’-3’) Target gene

B1369F CGG TGA ATA CGT TCY CGG Bacterial 16S (forward) A1369F CGG TGA ATA YGY CCC TGC Archaeal 16S (forward) U1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Universal^a)16S (reverse)

Probe Sequences (5’-3’) Target gene

TM1389F CTT GTA CAC ACC GCC CGT C^b) Universal^a)16S

Primers Sequences (5’-3’) Target gene

B1369F CGG TGA ATA CGT TCY CGG Bacterial 16S (forward) A1369F CGG TGA ATA YGY CCC TGC Archaeal 16S (forward) U1492R GGT TAC CTT GTT ACG ACT T Universal^a)16S (reverse)

Probe Sequences (5’-3’) Target gene

TM1389F CTT GTA CAC ACC GCC CGT C^b) Universal^a)16S a) bacteriaおよびarchaea 16Sに適応可能なプライマーまたはプローブである。

b) 5’-をFAM (6'-carboxy-fluorescein、レポーター色素)、 3’-をTAMRA (6 carboxy-tetra-methylrhodamine、クエンチャー)でそれぞれ修飾。

Target gene Bacterial 16S Archaeal 16S

Cycle 1 95℃, 10min 95℃, 10min

Cycle 2 (x 45) (x 45)

Step 1 95C, 10sec. 95C, 10sec.

Step 2 57C, 20sec. 59C, 20sec.

Cycle 3 40C, 30min. 40C, 30min.

Target gene Bacterial 16S Archaeal 16S

Cycle 1 95℃, 10min 95℃, 10min

Cycle 2 (x 45) (x 45)

Step 1 95C, 10sec. 95C, 10sec.

Step 2 57C, 20sec. 59C, 20sec.

Cycle 3 40C, 30min. 40C, 30min.

硫酸還元菌用培地組成 メタン菌用培地組成 *Vitamin solution

Component g/l Component g/l Component mg/l

Na₂SO₄ 2.5 Na-formate 2 Biotin 2

Na-acetate 0.82 Na-acetate 2 Folic acid 2

35% Na-lactate 4ml/l KH2PO4 0.23 Pyridoxin･HCl 10

KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.35 Thiamine･HCl 5

NH4Cl 1 NH4Cl 0.5 Riboflavin 5

CaCl₂･2H₂O 0.02 MgSO₄･7H₂O 0.5 Nicotinic acid 5

MgCl2･6H2O 2 CaCl2･2H2O 0.25 Calcium pantothenate 5

NaHCO3 2.6 NaCl 2.25 Vitamin B12 0.1

FeSO4･7H2O 0.5 NaHCO3 0.85 p-Aminobenzoin acid 5

Yeast Extract 0.05 FeSO4･7H2O 0.002 Lipoic acid 5

Vitamin solution* 10 ml/l Yeast Extract 2

Trace metal solution** 10 ml/l Casitone 2 **Trace metal solution

pH7.2 L-CysteineHCl･H2O 0.3 Component g/l

Na2S･H2O 0.3 NTA, pH6 with NaOH 0.2

H2gas (100%) 2ml/vial CoCl2･6H2O 0.2

Vitamin solution* 10 ml/l ZnCl2 0.09

Trace metal solution** 10 ml/l CuCl₂･2H₂O 0.02

pH7.2 NiCl2 0.011

Na2MoO4･2H2O 0.02

Na2SeO4 0.02

Na₂WO₄･2H₂O 0.022

硫酸還元菌用培地組成 メタン菌用培地組成 *Vitamin solution

Component g/l Component g/l Component mg/l

Na₂SO₄ 2.5 Na-formate 2 Biotin 2

Na-acetate 0.82 Na-acetate 2 Folic acid 2

35% Na-lactate 4ml/l KH2PO4 0.23 Pyridoxin･HCl 10

KH2PO4 0.5 K2HPO4 0.35 Thiamine･HCl 5

NH4Cl 1 NH4Cl 0.5 Riboflavin 5

CaCl₂･2H₂O 0.02 MgSO₄･7H₂O 0.5 Nicotinic acid 5

MgCl2･6H2O 2 CaCl2･2H2O 0.25 Calcium pantothenate 5

NaHCO3 2.6 NaCl 2.25 Vitamin B12 0.1

FeSO4･7H2O 0.5 NaHCO3 0.85 p-Aminobenzoin acid 5

Yeast Extract 0.05 FeSO4･7H2O 0.002 Lipoic acid 5

Vitamin solution* 10 ml/l Yeast Extract 2

Trace metal solution** 10 ml/l Casitone 2 **Trace metal solution

pH7.2 L-CysteineHCl･H2O 0.3 Component g/l

Na2S･H2O 0.3 NTA, pH6 with NaOH 0.2

H2gas (100%) 2ml/vial CoCl2･6H2O 0.2

Vitamin solution* 10 ml/l ZnCl2 0.09

Trace metal solution** 10 ml/l CuCl₂･2H₂O 0.02

pH7.2 NiCl2 0.011

Na2MoO4･2H2O 0.02

Na2SeO4 0.02

Na₂WO₄･2H₂O 0.022

硫酸還元活性の有無の判定は、硫酸還元反応 により生成する黒色沈殿(硫化鉄)の有無を経時 的に確認することにより行った。メタン生成活 性に関しては、バイアルのヘッドスペースガス をガスクロマトグラフ(TCD 検出器、CP-4500、

Varian製)により、メタンガス濃度を測定するこ

とにより行った。なお、培養期間は、硫酸還元 活性およびメタン生成活性ともに最長3ヶ月と した。

(5)微生物群集解析(ランダムクローニ ング)

³⁾

目 的 断 片 の 増 幅 が 確 認 さ れ た PCR 産 物 は RECOCHIP (Takara Bio)により回収、精製した。

精製されたPCR増幅断片を制限酵素HincIIで切 断し、末端を脱リン酸化処理したpUC19ベクタ ー に DNA ligation kit (TA-Blunt ligation kit,

Nippongene)を用いて連結した。連結した DNA

を 大 腸 菌 コ ン ピ テ ン ト セ ル(ECOS DH5α,

Nippongene)に形質転換することでクローンラ

イブラリーを構築した。

クローンライブラリーの大腸菌コロニーから 菌体を採取しこれをテンプレートとして、M13 universal primer; M4およびRVをプライマーに、

ExTaq (Takara Bio)を用いてPCR増幅を行った。

反応終了後 PCR産物2lを0.8%または2.0%ア ガロースゲル電気泳動に供し目的断片の増幅、

サ イ ズ ( ク ロ ー ニ ン グ に 用 い た 断 片 サ イ ズ

+123bp)を確認した。増幅された断片はMinElute

PCR purification kit (QIAGEN)を用いて精製した。

精製された増幅断片をテンプレートとして、

dye terminator 法による塩基配列決定を行った。

BigDye termonator kit v3.1を用いてDNAシーケ ンス反応を行い、DNA シーケンサーに供した。

解読されたDNA配列はDNA data bank of Japan

3) ランダムクローニング：多種多様な微生物群から構 成される検体試料から得られたクローンをランダムか つ多数解析することにより、検体試料中の微生物群の 種類と割合を解析する方法。

(DDBJ)の FASTA プログラムを利用して相同性

検索を行った。

ドキュメント内 幌延における堆積岩の特性研究(その２)－電力中央研究所／日本原子力研究開発機構共同研究平成16～20年度成果報告－ (ページ 60-63)