第 4 節 MPS 薄膜の高感度バイオセンサーとしての応用
4.3 タンパク質吸着実験
4.3.1 タンパク質
今回の実験では，以下(a)～(b)に示した2種類のタンパク質を用いた．
(a) Protein A
黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus)の細胞壁成分の 5％を占めるタンパク質であ り，分子量は45,000である．免疫グロブリンG (IgG)のFc部分と特異的に結合する．
この性質を利用して単クーロン抗体の精製や抗体産性細胞の定量または，抗体を結合し た細胞の分離などに用いられる．また，蛍光色素や放射性同位体で標識したのち，抗体 または，抗体と結合した抗原の検出に用いられる．
(b) FITC-IgG
フルオレセインイソチオシアネート (fluorescein isothiocyanate; FITC)は，フルオレセ インの水素原子の一つをイソチオシアネート基で置換した化合物であり，この部位でチ オ尿素結合を形成し，細胞内タンパク質の第一級アミンと結合する．より高い光安定性，
多彩なスペクトル特性・結合特性が要求される化学・生物学用のアプリケーションに利 用されている．
免疫グロブリンG (Immunoglobulin G，IgG)は単量体型の免疫グロブリンで，2つの重 鎖γと2 つの軽鎖からなっている．分子量は，150,000 である．それぞれの複合体は2 つずつの抗原結合部位を持っている．免疫グロブリンの中では最も数の多いものである．
ヒトの血清の免疫グロブリンの75 %を占め，体中の血液，組織液に存在する．
4.3.2 Protein A の吸着測定用検量線の作成
1.5 mLエッペンドルフチューブ中に，10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) を用いてProtein Aを溶解させ，40 g/ 500 L濃度のProtein A溶液を作製した．同様のリン酸緩衝液を 用いて希釈し，様々な濃度のProtein A溶液を調整した．各濃度のProtein A溶液の上清
50 L とタンパク質量測定試薬50 Lを 96 穴プレート上で混合し，2分間振盪させ、
その後室温で30分静置した．その後，蛍光光度計 (
Perkin Elmer 社製, Wallac 1420 ARVO
SX)
により，励起波長355 nm，蛍光波長615 nmで蛍光量を測定した．尚，タン パク質吸着量測定の試薬には FluoroProfileTM タンパク質定量キット (SIGMA 社製) 各 50 L (各試料50 Lに対して) を使用した．2回測定後，平均値を算出し，各タンパ ク質濃度の検量線を作成した．4.3.3 Protein A の吸着
24穴プレートに作製した薄膜を静置し，40 g Protein A/10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0)
500 Lを加え，室温で一晩攪拌した．攪拌後，上清50 L とタンパク質量測定試薬 50
Lを 96 穴プレート上で混合し，4.3.2と同様の手順で蛍光量を測定した． 4.3.2 で得 られた検量線と得られた蛍光量から，薄膜に吸着した の量を算出した．
4.3.4 FITC-IgG の吸着測定用検量線の作成
1.5 mL エッペンドルフチューブ中に，10 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) を用いて
FITC-IgGを溶解させ，10 g/ 500 L濃度のFITC-IgG 溶液を作製した．同様のリン酸緩 衝液を用いて希釈し，様々な濃度のFITC-IgG溶液を調整した．各濃度のFITC-IgG溶液 の上清 100 L を 96 穴プレートに加え，その後，蛍光光度計 (
Perkin Elmer 社製,
Wallac 1420 ARVO
SX)
により，励起波長485 nm，蛍光波長535 nmで蛍光量を測定した．2回測定後，平均値を算出し，各タンパク質濃度の検量線を作成した．
4.3.5 Protein A－IgG 結合
24穴プレートに作製した薄膜を静置し，40 g Protein A/10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500 Lを加え，室温で一晩攪拌した．攪拌後，10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0)で2回洗 浄した．洗浄後，10 g FITC-IgG /10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500 Lを加え，室温で 一晩攪拌した．攪拌後，上清100 Lを 96 穴プレート上で混合し，4.3.4と同様の手順 で蛍光量を測定した． 4.3.4で得られた検量線と得られた蛍光量から，薄膜に吸着した
FITC-IgGの量を算出した．
4.3.6 DFM による Protein A の吸着の確認
4.3.3と同様の手順で作製した薄膜にProtein Aを吸着させた．吸着後、4 ℃で一晩乾
燥し，その後，凍結乾燥を行った．凍結乾燥後，DFMによって薄膜表面を評価した．
4.3.7 DFM による Protein A－IgG 結合の確認
4.3.4と同様の手順で作製した薄膜上で
Protein A－IgG 結合を行った
．反応後、4 ℃で一晩乾燥し，その後，凍結乾燥を行った．凍結乾燥後，DFM によって薄膜表面を評 価した．
4.3.8 BET によるタンパク質吸着の確認
4.1 と同様の組成の P123 を含むゾル溶液からメソポーラスシリカ粒子 (SBA)を作製 した．15mL 遠沈管中に作製したメソポーラスシリカ100 mg及び140 g Protein A/ 10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 3 mLを加え，室温で一晩撹拌し，粒子にタンパク質を吸着 させた．撹拌後、遠心分離 (4 ℃、12,000 r.p.m、10分)をし，洗浄後，凍結乾燥した．
また，別容器中に同様の手順でProtein Aを吸着させた後，40g IgG/ 10 mMリン酸緩 衝液 (pH 7.0) 3 mLを加え，室温で一晩撹拌し，粒子にタンパク質を吸着させた．撹拌 後、遠心分離 (4 ℃、12,000 r.p.m、10分)をし，洗浄後，凍結乾燥した．
SBA，Protein A吸着SBA (Protein A－SBA)及びProtein A－IgG吸着SBA (Protein A－IgG
－SBA)は，BET法によって評価した．
4.4 バイオセンサーへの応用としての ELISA 法
4.4.1 MPS 薄膜上での ELISA 法
24穴プレートに作製した薄膜を加え，40 g Protein A/10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500 Lを加え，室温で6時間攪拌した．攪拌後，抗体洗浄液 (0.1 % Tween20 in リン酸 緩衝液)で3回洗浄した．洗浄後，一次抗体を10 g /10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500 L を加え，室温で一晩攪拌した．攪拌後，抗体洗浄液で3回洗浄した．洗浄後，非特異的 吸着を抑制するために，SuperBlock Blocking Bufferを500L加え，室温で3時間攪拌す
ることでBlockingを行った．攪拌後，抗体洗浄液で3回洗浄した．洗浄後，抗原 (Standard
Human Serum)を3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125，250 /10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500
Lを加え，室温で1時間攪拌した．攪拌後，抗体洗浄液で5回洗浄した．洗浄後，二 次抗体としてHRP-IgG 10 g /10 mMリン酸緩衝液 (pH 7.0) 500 Lを加え，室温で1時 間攪拌した．攪拌後，抗体洗浄液で 5 回洗浄した．洗浄後，テトラメチルベンジジン
(TMB) 500 Lを加え，遮光し室温で30分攪拌することで反応させた．反応後，上澄み
80 Lと1 M 硫酸 20 Lを96穴プレート上で混合し，分光光度計 (Perkin Elmer社製, Wallac 1420 ARVOSX)を用いて波長450 nm で，吸光度を測定した．2回測定後，平均値 を算出した．
4.4.2 DFM による薄膜表面でのタンパク質吸着状態の検討
薄膜の違いによる ELISA 感度への影響を検討するために，薄膜表面に吸着した一次 抗体の状態を検討した．タンパク質吸着状態の薄膜は，4.3.6と同様の手順で作製した．
得られた薄膜は，4 ℃で一晩乾燥し，その後，凍結乾燥を行った．凍結乾燥後，DFM によって薄膜表面を評価した．