プロダクト イノベーション
腸内フローラ解析システム Yakult Intestinal Flora-SCAN （ YIF-SCAN ）の開発と応用
定量的観点から見たヒト腸内フローラ
（株）ヤクルト本社中央研究所基盤研究所
辻 浩和
はじめに
ヒトの大腸内には約1,000種にも及ぶ細菌が糞便1g当 たり1011個レベルで棲息し，極めて複雑な微生物生態系 を形成している．この生態系は，腸内細菌叢や腸内フ ローラと呼ばれ，栄養学的，免疫学的，臨床微生物学的 な意義はもちろんのこと，脳腸関連などヒトの健康の全 般にわたってとても重要な役割を果たしている(1)．した がって，腸内細菌叢を正確に把握することは，ヒトの生 涯にわたる健康を維持・増進するうえで非常に重要と考 えられる．
腸内細菌叢の解析には，長きにわたって培養法が用い られてきたが，この方法には，多大な労力と時間を必要 とする，培養できない菌株が存在する，生物・生化学性 状 を 指 標 と し た 同 定 は，現 在 の16S ribosomal RNA
（rRNA）遺伝子配列を指標とした分類体系とは必ずし も一致しない，といった問題が存在した．この問題を克 服するため，近年，さまざまな分子生物学的方法による 腸内細菌叢の解析手法が開発され，特に最近では次世代 シークエンサー（NGS）による腸内細菌解析技術の進展 が目覚ましい．この手法はNGSを用いた16S rRNA遺 伝子アンプリコン解析とも呼ばれ，未培養な細菌を含む 腸内細菌叢の構成を網羅的に調べるうえで，今や必須な 技術となっている．このNGSを用いた解析は，腸内に 生息する細菌の存在比を大まかに把握するのに適してい るが，一方で定量的な観点に乏しく，定量的な意味で 多い, 少ない や 増えた, 減った と言うことはでき ない．また，対象とする細菌は最優勢に存在するものに 限られ，低菌数だが宿主の健康に重要な意味をもつ細菌 群，たとえば乳酸桿菌（ ），大腸菌群（En- terobacteriaseae），腸球菌（ ），ブドウ球 菌（ ），ウエルシュ菌（
）など，をその検出感度の低さから正確に解析 することは困難である．そこで，われわれは，迅速かつ 操作がシンプルで定量性に優れ，再現性の高い方法であ る定量的PCR法の発展形として，より高感度な定量的 RT（Reverse Transcription） PCR法 を 原 理 と し た Yakult Intestinal Flora-SCAN（YIF-SCAN： イ フ ス キャン）を開発した(2, 3)．本稿では，このYIF-SCANの 原理について解説するとともに，この方法によって得ら れる定量的観点から見たヒト腸内細菌叢，そしてYIF- SCANの臨床応用の可能性について述べたい．
YIF-SCANの原理
YIF-SCANは，定量的PCR法に比べて100〜1,000倍，
1検体あたり数万リードを解読する16S rRNA遺伝子ア ンプリコン解析に比べると1,000〜10,000倍の感度（便 1 g当たり102‒3個の微生物を検出可能）を有し，生きた 菌の菌数を反映した定量値を得ることができる．この感 度は，最適な選択培地を用いた際に得られる培養法の感 度に匹敵する．一般にrRNA遺伝子は数〜十数コピーが 細菌ゲノムにコードされる．定量的PCRやNGSを用い た16S rRNA遺伝子アンプリコン解析などのDNAを標 的とする手法では，この遺伝子を標的としたプライマー を用いて遺伝子を増幅するが，YIF-SCANでは，まず rRNA遺伝子の転写産物であるrRNA分子から細菌グ ループに特異的プライマーと逆転写酵素によりcDNA を合成し，引き続き，同じ特異的プライマーを用いて定 量的PCR法を行う（図1）．rRNA分子は1細胞内に数万 分子存在するため，通常のDNAを標的とする手法と比 べて1細胞当たりの鋳型量が単純に1,000倍以上多くな り，高い検出感度で標的微生物の定量が可能となるので ある．細菌に含有されるrRNAをコードする遺伝子とそ
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図1■YIF-SCANの定量原理
の転写産物であるRNA分子のコピー数の差は，定量的 PCRおよびYIF-SCANによる定量解析の検出感度の差 に反映され，両方法間での測定感度は，理論上1,000倍 は異なる．したがって，定量的PCRの検出感度が糞便 1 g当たり105 cellsなのに対し，YIF-SCANでは原理的に 102 cellsの 細 菌 の 検 出 が 可 能 と な る．さ ら に，YIF- SCANで用いるプライマーは，対象とする細菌グループ に属する細菌種に対して，ほとんど同等の増幅効率とな るように設計・検証されており，また，適切に設定され た標準菌株から抽出したRNAを用いて反応プレートご とに標準曲線を作成して定量されることから，16S rRNA遺伝子アンプリコン解析で認められるようなプラ イマー増幅効率のバイアスはほとんどないと考えて良 い．生きた微生物の定量という観点からも，DNAを標 的とする手法では生菌のみならず死菌をも測定するのに 比べて，rRNA自体がより生菌状態を反映していること から，YIF-SCANが腸内の生菌を定量するために適し た 手 法 で あ る と 言 え る．実 際 に，YIF-SCANで は
培養における細菌の死滅過程を培養法と同様に捉 えることができた(3〜5)．このように優れた点が多いYIF- SCANだが，上述したとおり，対象細菌グループごとに 特異的なプライマーと標準菌株から抽出したRNAを要 するため，単離されていない細菌を対象にできないとい う欠点を有する．現在，約80菌群／属／種に対するプ ライマーがYIF-SCANに対応しているが，全腸内細菌
の約70％のカバー率と見積もられている．今後，新た に腸内細菌の分離が進むことで，この欠点は解消されて いくだろう．
日本人健常者の腸内細菌叢の解析
YIF-SCANは，2007年に発表されて以来，多くの臨 床研究において腸内細菌叢の解析に用いられてきた．わ れわれは，YIF-SCANにより実施された複数の臨床試 験における約1,500人に及ぶ健常日本人の腸内細菌叢 データを統合し，腸内フローラデータベースを作成し た(6)．このデータベースには，生後1日目から102歳ま での約1,500人の健常日本人についての主要なヒト腸内 細菌群／属／種の定量値が収載されている．これまで，
培養法あるいは分子生物学的方法により腸内細菌叢と年 齢の関係について多くの研究が報告されていたが，報告 ごとに解析方法が異なるため，それぞれの研究結果をま とめた大きな母集団について，ヒトの年代による腸内細 菌叢の推移について解析することは不可能であった．
YIF-SCANでは，ヒト腸内細菌を再現性高く測定でき るため，独立した臨床研究で得られたデータを統合した うえで，年齢と腸内細菌叢の関連を詳細に調べることが 可能となったのである．
その結果，生後直後から3歳まで腸内細菌叢の構造は 大きく変化するが3歳以降では，比較的安定に見えた
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図2■健常日本人における主要な腸内細菌の加齢変化 被験者数1,507名（0〜102歳）．
図3■健常日本人成人における主要な腸内細菌の菌数分布 被験者数251名（20〜59歳）．
（図2）．しかし，その菌数の変化を詳細に観察すると，
やEnterobacteriaceae, の菌数は 3歳以降に安定化されることから，準優勢な菌群では腸 内細菌叢構成は推移の過程にあると考えられた．高齢者 で は， が 減 少 し， やEn- terobacteriaceaeが増加することが確認された．さら に，腸内におけるほとんどの腸内細菌群において，それ ぞれの菌数分布はおおむね対数正規分布することが明ら かとなっている（図3）．このことは，健常日本人の標 準範囲を設定できることを示唆しており，この基準値を もって個人の疾病のリスクを予測してより早期の疾病予 防に貢献することも期待される．
病態における腸内菌叢の解析
YIF-SCANにより，大腸がん患者では健常者に比べ て総腸内菌数および最優勢嫌気性菌群（
group, subgroup, group, clus- ter）の菌数が有意に少なく，腸内細菌叢が異常な状態
（dysbiosis）であることが報告されている(7)．また，2型 糖尿病患者においても最優勢嫌気性菌群の一つである groupや clusterの菌数低下な どのdysbiosisが観察されている(8)．近年，腸内細菌叢 と脳機能との関連を示唆する研究が報告されている．大
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うつ病患者と健常対照者について，その腸内細菌叢を YIF-SCANにより解析したところ，大うつ病患者群で は健常者群と比較して が有意に少なく，
の菌数も低い傾向が認められた(9)．さら に，先進国を中心に急増している神経性食欲不振症にお ける腸内細菌叢がYIF-SCANにより解析され，患者群 の総腸内細菌数および複数の最優勢嫌気性菌群の菌数 は，健常群と比較して有意に低値であることが明らかに された(10)．神経疾患の一種であるパーキンソン病患者 およびその健常な同居者の腸内細菌叢がYIF-SCANに より比較解析され，パーキンソン病患者では糞便中の総 腸内菌数ならびに group, sub- group, groupなどの最優勢嫌気性菌が健常同 居者と比較して少ないという結果が報告されている(11)． それらの患者を2年間追跡したところ，2年後に総腸内 細菌数， cluster,
の菌数の有意な低下が見られたばかり で な く，UPDRS 1（Unified Parkinson s Disease Rat- ing Scale 1：パーキンソン病の臨床症状評価指標の一 つ）のスコアの悪化と2年前の総腸内細菌数，
groupの菌数に有意な負の相関が 観察された(12)．すなわち，腸内細菌がパーキンソン病 の臨床症状を規定している可能性が示されたのである．
上述の疾患では共通して最優勢嫌気性菌のいくつかの菌 群や総腸内細菌数の低下が観察されている．これらの疾 患以外にも，炎症性腸疾患患者などにおいても最優勢嫌 気性菌の低下を伴う腸内細菌叢のdysbiosisが報告され ている(13)．総腸内細菌数や最優性嫌気性菌の低下は，
多くの生理活性を有する有機酸の濃度低下につながるこ とが容易に想像される．実際に上述の研究のいくつかで は，疾患において糞便中の総有機酸濃度の低下が観察さ
れている(7, 8, 10)．したがって，総腸内細菌数や最優性嫌
気性菌群の菌数は，宿主の生理状態を表す指標の一つと して重要であると考えられる．極めて最近， 誌 に，NGSによる腸内細菌叢の解析結果はあくまでも相 対的なものであり，宿主‒微生物相互作用の真の特徴づ けを可能にするためには定量的な観点での腸内細菌叢の 解析が必要である，との論文が掲載された(14)．今後，
さらに多くの種類の疾患について定量的な視点から解析 が進むことで，この “dysbiosis” の共通性や特異性が 明確になるだろう．
YIF-SCANの臨床応用
臨床微生物診断では現在でも培養法が主流であるが，
われわれは，YIF-SCANを用いることで病原微生物の 診断精度が高まると考え，腸内常在菌のみならず，臨床 において検出されうるさまざまな病原微生物に対するプ ライマーセットを開発した．たとえば，菌血症で高頻度 に検出される 属細菌や抗生物質誘導下痢 の原因菌であるディフィシル菌（ ）， 真菌症の原因として一般的なカンジダ（ spp．
），食中毒の原因
菌である /
/ ，そして
などである(5, 15〜18)．YIF-SCANが最初に菌血症の臨床 診断の研究に用いられたのは，発熱性好中球減少症の小 児を対象とした研究である(18)．この研究では，23例の 発熱性好中球減少症と診断された患児の末梢血から抽出 されたRNAを対象にYIF-SCAN解析が実施された．こ の結果，患児の67％に腸内細菌を含むさまざまな種類 の細菌が検出された．検出された主な細菌は，腸内に最 優勢に存在する嫌気性菌ならびに通性嫌気性菌であり，
その菌数は血液1 mL当たり数個から数百個のレベルで あった．しかも同一患者から複数菌種が検出される場合 がほとんであった．一方，同時に採取された血液の通常 臨床検査における培養法では，いくつかの通性嫌気性菌 が検出されたが，その検出率は17％であり，YIF-SCAN 法に比べて有意に低値であった．藤森らは，敗血症の新 生児39例の末梢血を調べ，通常の培養法による細菌の 検出率が15％であったのに対して，YIF-SCAN法によ る検出率は39％と有意に高いことを報告している(19)． 培 養 法 で はEnterobacteriaceae, と い っ た通性好気性が主な検出菌であったが，YIF-SCANで はこれらに加えて腸内最優勢嫌気性菌群も検出された．
これらの知見は，通性嫌気性菌や好気性菌のみならず通 常の培養法では培養困難な腸由来の嫌気性菌も菌血症に 関連することを示している．また，培養法による感染症 起因菌の同定には少なくとも数日間を要するが，YIF- SCANでは5〜6時間で結果が得られることから，より 迅速な患者への対処も可能となる．特に生体防御能の減 弱が認められる患者においては，敗血症の起因菌を早期 に同定することは治療上大きな意義があると考えられ，
YIF-SCANによる診断は的確な治療薬選択への重要な 情報を提供することが期待できる．さらに，虚血性脳卒 中患者においてもYIF-SCANによる解析で菌血症の存 在が明らかとなっている(20)．こうした事実は，さまざ まな疾患の発症や進展において潜在的な菌血症の関与を 示唆するものである．
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おわりに
YIF-SCANは，細菌のrRNAを標的することにより，
既存の分子生物学的な腸内細菌叢解析技術の中で際立っ て高い感度と精度を有しており，極めてダイナミックレ ンジの広い腸内細菌叢を定量的に解析することが可能に なった．われわれは，この技術的特徴により，日本人健 常人の腸内細菌叢の詳細な定量的な加齢変化や，主な腸 内細菌の菌数はおおむね対数正規分布することを見いだ すことができた．今後，この技術を用いることで，さま ざまな集団における腸内細菌叢の特徴の解明や異常の検 出が期待できる．これにより，腸内細菌叢の意義のより 深い理解が進むとともに，人為的な腸内細菌叢の調節に よるヒトの健康増進への新しい道筋が見えてくるに違い ない．
文献
1) V. Tremaroli & F. Bäckhed: , 489, 242 (2012).
2) K. Matsuda, H. Tsuji, T. Asahara, K. Matsumoto, T.
Takada & K. Nomoto: , 75, 1961
(2009).
3) K. Matsuda, H. Tsuji, T. Asahara, Y. Kado & K. Nomoto:
, 73, 32 (2007).
4) H. Kubota, H. Tsuji, K. Matsuda, T. Kurakawa, T. Asahara
& K. Nomoto: , 76, 5440 (2010).
5) T. Kurakawa, H. Kubota, H. Tsuji, K. Matsuda, T. Asa- hara, T. Takahashi, T. Ramamurthy, T. Hamabata, E.
Takahashi, S. Miyoshi : , 56, 10
(2012).
6) 野本康二，辻 浩和，松田一乗：腸内細菌学雑誌，29, 9 (2015)
7) S. Ohigashi, K. Sudo, D. Kobayashi, O. Takahashi, T.
Takahashi, T. Asahara, K. Nomoto & H. Onodera:
, 58, 1717 (2013).
8) J. Sato, A. Kanazawa, F. Ikeda, T. Yoshihara, H. Goto, H.
Abe, K. Komiya, M. Kawaguchi, T. Shimizu, T. Ogihara : , 37, 2343 (2014).
9) E. Aizawa, H. Tsuji, T. Asahara, T. Takahashi, T. Tera- ishi, S. Yoshida, M. Ota, N. Koga, K. Hattori & H. Kunugi:
, 202, 254 (2016).
10) C. Morita, H. Tsuji, T. Hata, M. Gondo, S. Takakura, K.
Kawai, K. Yoshihara, K. Ogata, K. Nomoto, K. Miyazaki : , 10, e0145274 (2015).
11) S. Hasegawa, S. Goto, H. Tsuji, T. Okuno, T. Asahara, K.
Nomoto, A. Shibata, Y. Fujisawa, T. Minato, A. Okamoto : , 10, e0142164 (2015).
12) T. Minato, T. Maeda, Y. Fujisawa, H. Tsuji, K. Nomoto, K. Ohno & M. Hirayama: , 12, e0187307 (2017).
13) K. Takeshita, S. Mizuno, Y. Mikami, T. Sujino, K. Saigusa, K. Matsuoka, M. Naganuma, T. Sato, T. Takada, H. Tsuji
: , 22, 2802 (2016).
14) D. Vandeputte, G. Kathagen, K. D hoe, S. Vieira-Silva, M. Valles-Colomer, J. Sabino, J. Wang, R. Y. Tito, L. De Commer, Y. Darzi : , 551, 507 (2017).
15) K. Matsuda, H. Tsuji, T. Asahara, T. Takahashi, H.
Kubota, S. Nagata, Y. Yamashiro & K. Nomoto:
, 78, 5111 (2012).
16) K. Ogata, K. Matsuda, H. Tsuji & K. Nomoto:
, 117, 128 (2015).
17) T. Kurakawa, H. Kubota, H. Tsuji, K. Matsuda, T. Taka- hashi, T. Ramamurthy, G. B. Nair, Y. Takeda & K. No-
moto: , 92, 213 (2013).
18) S. Sakaguchi, M. Saito, H. Tsuji, T. Asahara, O. Takata, J.
Fujimura, S. Nagata, K. Nomoto & T. Shimizu:
, 48, 1624 (2010).
19) M. Fujimori, K. Hisata, S. Nagata, N. Matsunaga, M.
Komatsu, H. Shoji, H. Sato, Y. Yamashiro, T. Asahara, K.
Nomoto : , 10, 53 (2010).
20) K. Yamashiro, R. Tanaka, T. Urabe, Y. Ueno, Y. Yama- shiro, K. Nomoto, T. Takahashi, H. Tsuji, T. Asahara &
N. Hattori: , 12, e0171521 (2017).
プロフィール
辻 浩 和（Hirokazu TSUJI）
＜略歴＞1992年東京農業大学農学研究科 修了／同年㈱ヤクルト本社入社中央研究所 勤務／2010年医学博士（筑波大学）／2013 年中央研究所基盤研究所フローラ機能研究 室長／2016年順天堂大学大学院客員准教 授，現在に至る＜研究テーマと抱負＞腸内 細菌叢の研究，腸内細菌による大豆イソフ ラボンの代謝＜趣味＞酒，麻雀，ゴルフ
Copyright © 2018 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.56.371
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