今日の話題
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化学と生物 Vol. 52, No. 9, 2014
ニホンウナギから世界初のビリルビンセンサーを発見
ニホンウナギ由来緑色蛍光タンパク質 UnaG の蛍光機序の解明とその医学的応用
蛍光タンパク質は現代のバイオイメージングにおける 必須のツールとして活躍している．既報の蛍光タンパク 質（野生型）は主に刺胞動物からその遺伝子がクローニ ングされており，オワンクラゲ由来のGFPとサンゴ，
イソギンチャク由来のGFP様タンパク質に分類される．
刺胞動物以外にも，節足動物（カイアシ類）や頭索動物
（ナメクジウオ）からいくつかのGFP様タンパク質の遺 伝子がクローニングされている．刺胞動物やカイアシ類 やナメクジウオの生態における蛍光タンパク質の役割は 実はよくわかっていないが，水の中は蛍光タンパク質の 宝庫と言える．水棲動物をより広く探索すれば新奇の蛍 光タンパク質に出会う可能性がいくらでもありそうだ．
ニホンウナギは，日本や中国，韓国など東アジアに分 布する回遊魚である．河川を遡上して成長し，産卵のた めに再び海に戻る．産卵はフィリピン海溝付近で行われ ると推定されていたが，2006年に東京大学の研究チーム が，マリアナ海嶺で，ふ化後間もない仔魚の採取に成 功，産卵場所はほぼピンポイントで特定された（1）．ニホ ンウナギは謎めく魚である．2009年に，鹿児島大学の 林 征一（当時）らによって，ニホンウナギの筋肉から 緑色蛍光タンパク質の精製が報告されたが（2），その蛍光 の仕組みについては不明のままであった．
われわれは，ニホンウナギの筋肉に見られる緑色蛍光
（図1）の仕組みを解明するにあたって，緑色蛍光タンパ ク質の遺伝子の単離を試みた．ニホンウナギの稚魚（シ ラスウナギ）5匹を材料にして，139個のアミノ酸からな るタンパク質の遺伝子を突き止め「UnaG（ユーナジー）」
と命名した（3）．このタンパク質の構造を調べると，脂肪 酸結合タンパク質（FABP）のファミリーに属すること がわかり，脂溶性（水に溶けにくい）の低分子をリガン ドとして取り込むことが予想された．そこで，大腸菌や 哺乳類培養細胞に遺伝子を導入してUnaGを作りその蛍 光を調べたところ，面白いことに，大腸菌では光らず，
哺乳類培養細胞では光ることがわかった．UnaGが蛍光 を出すためには何らかのリガンドが結合することが必要 で，そのリガンドは大腸菌にはなく哺乳類培養細胞にあ ると考えられた．そこで，①哺乳類培養細胞で作らせた 蛍光性UnaG（ホロUnaG）からリガンドを抽出し解析
する，②混合実験を行って，大腸菌で作らせた無蛍光性 UnaG（アポUnaG）を蛍光性に変える生体サンプルを 探す，という2つのアプローチでリガンド探索を行った．
その結果，ビリルビンがリガンドとして同定された．
実際にアポUnaGにビリルビンを添加すると，一瞬にし て緑色の蛍光が出現するのが観察された（図2（A））．ホ ロUnaGを使った結晶構造解析を行ったところ，1.2オ ングストロームの高い分解能で構造を決定することがで きた（図2（B））．ビリルビンはUnaGタンパク質内部の ポケットに完全にはまり込んでおり，ビリルビンを構成 する4つのピロール環（A, B, C, D）のうち，蛍光発生 に関与すると考えられるA/B環もしくはC/D環がそれ ぞれ一つの平面上に配置する様子が明らかになった（3）． この構造から，UnaGにおけるビリルビン結合が非常に 強く特異的であり，抱合型ビリルビンなどほかのビリル ビン誘導体は結合できないことが示唆された．実際にこ うした特性は別の分光学的あるいは生化学的実験で証明 されている（ d＝98 pM）（3）．
赤血球の崩壊（溶血）に伴い，ヘモグロビンはヘムと
図1■シラスウナギ全身の蛍光像
緑色蛍光は全身の筋肉にわたって検出される．
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グロビンに分離し，ヘムはさらに酵素の働きによって，
ビリベルジン（緑色），ビリルビン（黄色）へと変化す る．ビリルビンは水に溶けにくく，主に血液中のアルブ ミンに結合した状態で肝臓へ運搬される．肝臓ではグル クロン酸抱合を受けて水に溶けやすい抱合型ビリルビン に変化し胆汁へ排出される．血液中のビリルビン量は，
溶血が盛んになったり肝臓の働きが弱まったりすると増 加し，異常に増加するとビリルビンが血管外の組織に沈 着して黄疸症状が表れる．新生児は，胎生期に使った余 分な赤血球を壊すため黄疸（新生児黄疸）になりやすく，
その程度がひどくなると，ビリルビンが大脳基底核など に沈着して後遺症が残る可能性がある（核黄疸，ビリル ビン脳症）．このように過剰量のビリルビンは体に悪い 影響を与える傾向にある．一方，ビリルビンは容易に酸 化してビリベルジンに変化する性質を有しており，その 顕著な抗酸化作用が注目されてきた（4）．実際に，軽度に 血清ビリルビン濃度が高いと，心筋梗塞・狭心症など酸 化ストレスに関連する疾患が発症しにくい傾向がある（4）．
現在，世界中で実施されているビリルビン測定法はい ずれも比色法であり，非常に複雑な工程を経てなされて いる．ビリルビンより抱合型ビリルビンのほうが反応
（酸化やジアゾ化）しやすいため，反応促進剤による反 応前後でそれぞれ抱合ビリルビン量と総ビリルビン量を
測定し，後者から前者を差し引いてビリルビン量を計算 している．このため，現行のビリルビン測定は，煩雑で 時間がかかる，感度が悪い，さまざまな因子に影響され やすい，などの問題が指摘されている（5）．
われわれは，UnaGをビリルビンセンサーとして利用 してヒト血清ビリルビン濃度の蛍光測定法を開発した
（図3）．UnaGとビリルビンとの結合力が極端に強いの 図2■UnaGの蛍光発生に必要な外 因性リガンド，ビリルビン
（A）無蛍光性アポUnaG（大腸菌に 作らせたUnaG） とビリルビンとの混 合実験．混合の瞬間に緑色蛍光活性 が生まれる．（B）蛍光性ホロUnaG
（哺乳類細胞で作らせたUnaG）の結 晶構造．ビリルビンはUnaGタンパ ク質が作るポケットの中に，奥から
（図 で は 下 か ら）D環，C環，B環，
A環の順にはまり込んでいる．A環 とB環，C環とD環がそれぞれ同一 平面上に配置されている．ビリルビ ンはB環とC環の間で大きくねじれ ている．
図3■アポUnaGを用いた血清ビリルビン定量の原理
アポUnaGがビリルビンに結合しホロUnaGとなり強い緑色蛍光を 発するので，直接的なビリルビン検出が可能となる．アポUnaGは アルブミンよりも1,000倍ほど強くビリルビンに結合するので，ア ルブミンとの結合にかかわらず血清中のすべてビリルビンを検出 できる．さらに，抱合型ビリルビンには結合しないためビリルビ ンを特異的に検出する．
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で，サンプル中に存在するビリルビンを，そのアルブミ ン結合にかかわらずすべて検出することができる．従来 法のような煩雑な工程や計算は一切必要ない．蛍光法な ので検出感度を著しく向上させることができ，より少量 のサンプルで測定が可能になる．従来法と比べて3桁以 上の感度向上を達成しており，（超）低出生体重児の採血 時の負荷を軽減できると期待できる．血液サンプルの溶 血などの影響を受けないことも大きな利点である．われ われは，UnaGの凍結乾燥試料がその活性を100%保持 することを確認している．輸送や保管に冷凍・冷蔵の必 要がないので，当蛍光試薬が発展途上国や辺地での医療 をサポートすることが期待される．また，血清ビリルビ ン濃度の高精度測定を持続的に行うことや測定を血液以 外のサンプルに広げることにより，ヒト体内のビリルビ ン動態についての理解を深めることができる．量に応じ て薬にも毒にもなりえるビリルビンを健康・疾病バイオ マーカーとして多角的に測定する技術の確立が期待され る．
1） K. Tsukamoto : , 439, 929 （2006）.
2） S. Hayashi & Y. Toda : , 75, 1461 （2009）.
3） A. Kumagai : , 153, 1602 （2013）.
4） T. W. Sedlak & S. H. Snyder : , 113, 1776 （2004）.
5） S. F. Lo & B. T. Doumas : , 35, 141
（2011）.
（熊谷安希子，宮脇敦史，理化学研究所脳科学総合 研究センター）
プロフィル
熊谷安希子（Akiko KUMAGAI）
＜略歴＞2002年鹿児島大学水産学部水産 学科卒業／2004年同大学大学院水産学研 究科修士課程修了／2007年同大学大学院 連合農学研究科博士課程修了（水産学）／
2008年バイオテクノロジー開発技術研究 組合契約研究員．国立感染症研究所ウイル ス第二部勤務／2010年科学技術振興機構博 士研究員．ERATO宮脇生命時空間情報プ ロジェクト勤務／2012年理化学研究所基 礎科学特別研究員．脳科学総合研究セン ター細胞機能探索技術開発チーム勤務，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞UnaGを医 療，特に小児医療のために役立てたい．謎 に満ちたウナギの面白さをUnaGを通して 伝えていきたい＜趣味＞ヨガ，筋肉トレー ニング，晩酌
宮脇 敦史（Atsushi MIYAWAKI）
＜略歴＞1991年大阪大学医学部大学院医 学研究科博士課程修了／同年日本学術振 興会特別研究員／1993年〜 1998年東京大 学医科学研究所助手／1995年HFSP long- term fellowship, University of California San Diego, Dept. of Pharmacology／1997 年Research Pharmacologist, University of California San Diego, Dept. of Pharmacol- ogy／1999年理化学研究所脳科学総合研究 センター先端技術開発グループ細胞機能 探索技術開発チーム・チームリーダー／
2004年同研究所脳科学総合研究センター 先端技術開発グループ・グループディレク ター／2005年東京大学分子細胞生物学研 究所細胞機能情報研究センタープロテオー ム研究分野客員教授／2006年自然科学研 究機構基礎生物学研究所発生ダイナミクス 研究部門客員教授／同年科学技術振興機 構ERATO「生命時空間情報」プロジェク ト研究総括／2007年早稲田大学理工学術 院分子神経科学研究客員教授／2008年理 化学研究所脳科学総合研究センター副セン ター長／2009年慶應義塾大学医学部客員 教授／2010年東邦大学理学部客員教授／
2012年横浜市立大学生命ナノシステム科 学研究科客員教授＜趣味＞階段
