Title
Apoptotic myocytes in infarct area in rabbit hearts may be oncotic
myocytes with DNA fragmentation. Analysis by immunogold
electron microscopy combined with in situ nick end-labeling.( 内
容の要旨(Summary) )
Author(s)
大野, 道也
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）乙 第1182号
Issue Date
1999-01-20
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/15090
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氏名 (本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 大 野 道 也(岐阜県) 博
士(医学)
乙第 1182 号 平成11年1 月 20 日･ 学位規則第4条第2項該当 〝Apoptotic"myocytesininfarctareainrabbitheartsmaybeoncotic myocyteswith DNAfragmentation･AnalysisbyimmunogoldeIectron microscopycombinedwithin situ nickend-labeling･(主査)教授 藤 原 久 義 (副査)教授 野 澤 義 則 教授 土 肥 修 司 論 文 内 容 の 要 旨 細胞死のプロセスは超徴形態の特徴およびDNAfragmentationの有軌こより･アポトーシスとネクローシス (オンコーシス)に分類される｡これまでオンコーシスの代表とされていた梗塞心筋細胞にアポトシスの存在 が近年多数報告されているが,その根拠はいずれも光学顕微鏡レベル(LM)のTUNEL法(insituterminal deoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickend-1abeling)とDNAladderによるDNAfragmentation の存在に基づいている｡しかし,現在まで,超徴形態的にはアポトシス心筋細胞は捕えられていない0上記矛 盾を解明するために,超徴形態とDNAfragmentationを同一心筋細胞で同時に評価できる電子顕微鏡レベル (EM)でのTUNEL法を我々は開発し,ウサギ梗塞モデル心で･DNAfragmentationを有する心筋細胞の超微 形態がアポトーシスであるかオンコーシスであるかを検討した0 【対象および方法】 日本白色種ウサギ30羽でshamoperation.30分虚血及び30分虚血後の30分･2･4時間再涯流の計5群(各々6 羽)を作製した｡その後直ちに虚血領域(riskarea)及び非虚血領域(non-riskarea)より光顕及び電顕レベ ルのTUNEL用切片を作製し,DNA抽出用サンプルも採取した｡ EM-TUNELの方法論的妥当性は去勢48時間後のウサギ前立腺組織で評価した0正常前立腺細胞ではimmunogold particlesの集積はわずか(slight)しかみられなかったが･超徽形態で典型的なアポトシス前立腺細胞では半 月上にcondensationした核クロマチンにDNAfragmentationを示すimmunogold particlesが密集していた (significant)｡集積の程度はslightとsignificantに分類し･SlightをEM-TUNEL陰性とし,SignificantをEM-T UNEL陽性とした｡ 【結果】 1)DNA GelElectrophoresis non-riskareaから抽出したDNAの電気泳動では全群DNAladderがみられなかったoriskareaから抽出した DNAの電気泳動でshamoperation群,30分虚血のみの群,30分虚血30分丙種流群ではDNAladderがみられな かったが,2時間再濯流群で6例中5例,4時間再港流群では6例全例にDNAladderがみられた0 2)LM-TUNEL DNAladderと同様にshamoperation乱30分虚血のみの乳30分虚血30分再潜流群ではTUNEL陽性心筋細 胞はみられず,2,4時間再港流群においてinfarctedareaにそれぞれ6･11%の頻度でTUNEL陽性心筋細胞がみ られた｡ 3)EM-TUNEIJ 超徴形態的に不可逆性オンコーシス心筋細胞はすでに30分虚血及び30分再濯流群のriskareaでみられたが･ これらはすべてTUNEL陰性であった｡一方,2,4時間両港流群のriskareaでは不可逆性オンコpシスの超徴形 態を示す心筋細胞はTUNEL陽性と陰性に分かれたoTUNEL陽性心筋細胞の頻度は2時間再蔵流群で41%･4時
-95-間再港流群で83%であった｡しかし,超微形態からみたアポトーシス心筋細胞は全群において全くみられなかっ
た｡nOn risk areaの心筋細胞はTUNEL陰性であった｡
【考察】 虚血･再港流における心筋細胞の超微形態からみたオンコーシスとアポトーシスについて 虚血･再湾流における心筋細胞の超微形態はriskareaの外層はsalvagedareaであり,可逆性オンコーシス･L､ 筋細胞がみられた｡一方,riskareaの中･内層のinfarctedareaでは不可逆性オンコーシス心筋細胞が30分虚血 群,30分虚血後の30分,2時間,4時間再漕流各群でみられた｡DNAfragmentationは不可逆性オンコーシス心 筋細胞がすでにみられた30分虚血30分虚血後の30分再潜流群においてはみられず,2時間以後の再潜流群でみ られた｡しかし,超微形態学的アポトーシス心筋細胞は全群において全くみられなかった○ 以上より,虚血再潜流において心筋細胞にはまず可逆性のオンコーシスの変化が生じそれが進行して不可逆 性オンコーシスとなる｡しかし,この時点ではまだDNA fragmentationは生じていない｡それ以後DNA fragmentationを持っ心筋細胞と持たない心筋細胞に分かれる0 【結論】 1.虚血･再港流では心筋細胞のオンコーシスの変化が進行し,不可逆性障害になった後で.DNAfragmentation が生ずる｡ 2.心筋梗塞組織でみられるTUNEL陽性心筋細胞やDNAladder,すなわち,いわゆる"アポトーシス心筋細貯 は,DNAfragmentationを伴ったオンコーシス心筋細胞であり･アポトーシスとは異なる範噂に属する0 論文審査の結果の要旨 申請者 大野道也は近年報告されている心筋梗塞組織でみられるいわゆる`アポトーシス心筋細肘が超微形 態的にアポトーシスとは異なる範疇に属することを明らかにした｡ この新知見は循環器内科学の進歩に少なからず寄与するものと認める｡ [主論文公表誌] ･･Apoptotic･myocytesininfarctareainrabbitheartsmaybeoncoticmyocyteswithDNA fragmentation. Analysisbyimmunogoldelectronmicroscopy combinedwithinsitunickend-1abeling･ 1998年 Circulation 98:1422∼1430
