Title イヌのSOD1関連変性性脊髄症の疾患スペクトラムと脊髄中ミスフォールド蛋白の局在に関する研究( 要約版(Digest) ) Author(s) 小畠, 結 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第487号 Issue Date 2017-03-13 Type 博士論文 Version none URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/56201 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
学 位 論 文 要 約
氏 名小畠 結
題 目 イヌの SOD1 関連変性性脊髄症の疾患スペクトラムと 脊髄中ミスフォールド蛋白の局在に関する研究 イヌの変性性脊髄症（DM）は脊髄に認められる慢性進行性かつ致死性の神経変性疾患で ある。DM 症例にはスーパーオキシドジスムターゼ 1（SOD1）遺伝子の変異が認められるこ とから, 変異型 SOD1 蛋白が DM の病態に深く関与していると考えられている。しかし, 現 在までに DM の詳細な病態発生メカニズムは明らかになっておらず, 治療法も確立されて いない。DM は予後不良の疾患であるため, 欧米では疾患経過の途中で安楽殺が選択される ことが多い。そのため, 現在までに DM の末期臨床像を詳細に記載した報告はなく, 疾患末 期の脊髄病理組織像を示した報告も少ない。今後 DM の病態解明を目指した基礎及び臨床研 究を発展させるためには，全病期にわたる DM の詳細な臨床像を把握する必要がある。また， DM の病態発生に密接に関係していると考えられている変異型 SOD1 蛋白の生化学的特性と 脊髄における局在解析は，DM 症例の脊髄変性病変の発生メカニズムを解明する上で極めて 重要である。DM の疾患スペクトラムを明らかにし，脊髄組織に対する変異型 SOD1 蛋白の 傷害メカニズムを解明することは，究極的な目的である DM の新規治療法の開発へとつなが る。 第 1 章では DM 症例の全病期にわたる臨床像と自然死症例の脊髄病理組織像を明らかにし た。全症例において歩行機能障害は後肢から出現し，前肢へと進行した。歩行機能障害の 出現順序は全症例で一致していたが，発現時期は症例間において顕著な差が認められた。 臨床症状の進行速度の差は，最終的に死亡時期にも影響し，生存期間にも大きな差が認め られた。これらの結果は，SOD１遺伝子変異以外の要因（他の遺伝的要因や環境要因）が臨 床症状の進行速度に影響を及ぼしている可能性を示唆している。排泄の制御，特に排尿障 害は多くの症例で出現する症状であったが，歩行機能障害と同様に出現時期は症例間で顕 著に異なった。呼吸障害は DM の直接的な死因であると考えられているが，その発生頻度と 発生時期の詳細は知られていない。本研究では，84.2%の症例に呼吸機能障害を示唆する臨 床上の変化が認められ，多くの症例では疾患末期に出現した。また，長期生存した症例で は嚥下困難, 発声障害, および舌の攣縮を示したことから, DM の末期においては脊髄だけ でなく延髄の障害による症状も出現すると考えられた。DM 自然死症例の脊髄の病理組織学 的解析では，頸髄または胸髄の運動神経細胞数や運動神経細胞サイズは，DM 症例間で顕著 な差があった。しかし，神経細胞の減少が認められた症例においても脱落する神経細胞の サイズには一定の傾向がなかった。また，頸髄と胸髄のいずれの領域においても，神経細 胞数と臨床症状の発現時期との間に関連性は認められなかった。以上の結果は，DM の臨床 症状は脱落した脊髄の運動神経細胞数とは直接関連しないことを示唆する。一方で，DM 群 の全ての症例において神経細胞内に SOD1 蛋白の凝集体が蓄積していることが明らかにな った。神経細胞への変異型 SOD1 蛋白凝集体の蓄積が脊髄運動神経細胞の機能的な変化をも たらし，DM の様々な臨床症状を引き起こしている可能性があると考えられた。第2章では, 変異型SOD1遺伝子ヘテロ接合体（ヘテロ接合体）の脊髄組織の病理組織学的 解析を行なった。ヘテロ接合体は変異型SOD1蛋白を発現するが，DMを発症しない。変異型 SOD1蛋白を発現しているヘテロ接合体においてDMが発症しない理由は明らかになっていな いが，ヘテロ接合体の脊髄組織には変異型SOD1蛋白により引き起こされた軽度な病理学的 変化が存在し，DMの発症前の病態を反映すると仮説を立てた。ヘテロ接合体の脊髄を病理 組織学的に解析したところ，脊髄側索に軽度な変性病変が認められ，病変の分布はDM症例 と類似していた。次に変異型SOD1蛋白特異的抗体を作製し，ヘテロ接合体の脊髄における ミスフォールド変異型SOD1蛋白の局在を免疫組織化学的に解析した。免疫組織化学の結果 から, ヘテロ接合体の脊髄にはミスフォールドSOD1蛋白が高度に蓄積した活性型アストロ サイトが集族していることが明らかになった。したがって，ミスフォールドSOD1蛋白が蓄 積した活性型アストロサイトはDMの病態初期において重要な役割を果たすと考えられた。 本研究の結果は, DM の疾患スペクトラムを示すものであり，臨床獣医学上，重要な情報 である。また，全病期にわたる詳細な臨床経過と脊髄の末期病理組織像に関する情報は， 今後 DM 症例に対して計画される治療研究の基礎データとして必須である。DM の病態初期 に起こる活性型アストロサイトへのミスフォールド SOD1 蛋白の蓄積は，脊髄全域を壊滅的 に障害する DM の病態メカニズムにおいて重要な現象である可能性があり，新規治療戦略の 標的となり得る。
学 位 論 文 要 約 氏 名 Kobatake, Yui
題 目 Studies on Disease spectrum and the localization of misfolded mutant SOD1 protein in the spinal cords of SOD1-related canine degenerative myelopathy
（イヌの SOD1 関連変性性脊髄症の疾患スペクトラムと脊髄 中ミスフォールド蛋白の局在に関する研究）
Canine degenerative myelopathy (DM) is an adult- onset progressive
neurodegenerative disorder. Spontaneous mutations in the SOD1 gene have recently been identified in dogs with DM. Two types of single nucleotide mutations (c.118G >A, c.52A >T) have been specified to date, both of which lead to alterations in a single amino acid of SOD1 (E40K and T18S, respectively). Homozygosity for these mutations is known to cause clinically apparent progressive paralysis and generalized muscle atrophy, which eventually lead to respiratory failure and death. Because a recent study demonstrated full enzymatic activity of canine mutant SOD1, neural degeneration may be caused by a gain of toxic function of mutant SOD1. The pathophysiological mechanisms underlying DM remain largely unknown, and treatments with long-term efficacy are not currently available. Due to its poor prognosis, many dogs affected with DM are elected for euthanasia. Therefore, the later clinical course and pathological features of affected spinal cords have not been documented in detail. In order to design clinical trials in DM, understanding of the natural progression of this condition becomes crucial for the evaluation of the prospective treatment candidates. Furthermore, analysis of biochemical characteristics of mutant SOD1 protein and localization of mutant SOD1 protein in the spinal cord are important to reveal the underlying pathogenesis of DM. Investigation of the disease spectrum and pathophysiological mechanisms of DM could ultimately lead to development of new treatments for DM.
In chapter 1, information regarding clinical signs was obtained from the owners of DM dogs or their family veterinarians in order to reveal the long-term clinical course of DM. Progressive ambulatory dysfunctions were the most prevalent clinical signs in DM dogs. All affected dogs followed the identical sequence of ambulatory dysfunction. However, the rate of progression of ambulatory dysfunction varied significantly among cases. Similarly, dysuria manifested as urinary incontinence in most cases was common in DM dogs with a wide range of progression rate. Respiratory failure is thought to be the direct cause of death in DM. As suspected respiratory
dysfunction was found in the majority of DM cases during the later clinical course. The survival time varied significantly among dogs, the difference was as long as 34 months. These results suggested that the presence of additional genetic factors or environmental factors influence on the disease progression. Long- term survival cases showed clinical signs suggestive of brainstem dysfunction such as dysphagia, dysphonia, and tongue spasm. These findings suggest that DM is regarded as not only a spinal cord disorder but also a brainstem disorder in the end stage. The spinal neurons of symptomatic cases of E40K homozygotes contained accumulation of the SOD1 protein and formation of cytoplasmic aggregates without changes in their number or size. Therefore, the mutant SOD1 aggregates most likely play important roles in DM pathogenesis. Results of chapter 1 revealed the later clinical course and
histopathological characteristics of DM spinal cord in detail, and provided clinically useful information. They also provided detailed clinical picture of natural progression of DM which serves as a baseline data for future clinical trials. In chapter 2, I performed immunohistochemistry of the spinal cords of mutant SOD1 heterozygotes, which rarely develop clinical signs of DM despite the presence of toxic mutant SOD1. It remains unclear why mutant SOD1 heterozygotes do not develop DM during their lifetime. I hypothesized that spinal cords of mutant SOD1-bearing asymptomatic heterozygotes represent the subclinical state of DM, and therefore display early pathological key events in response to mutant SOD1. In dogs with mutant SOD1 heterozygotes, the spinal cords displayed white matter degeneration, the severity of which was markedly less than that in E40K-homozygotes. I analyzed the distribution of misfolded mutant SOD1 protein in the spinal cords of mutant SOD1 heterozygotes by immunohistochemistry. The results suggested that misfolded mutant SOD1 protein accumulated predominantly in reactive astrocytes of E40K heterozygotes. The astrocytic dysfunctions that developed in the early course of DM may be an important contributor driving disease progression. These results suggested that misfolded mutant SOD1 proteins accumulate in reactive astrocytes during the early phase of DM pathology, which may contribute to subclinical neurodegeneration.
In conclusion, results obtained in a series of my doctoral study clarified a long-term clinical manifestation and histopathological features of DM, and promote future research for therapy development. Misfolded mutant SOD1 proteins accumulate in reactive astrocytes during the early phase of DM pathology; therefore, early involvement of reactive astrocytes in the pathogenesis of DM is strongly suspected and could be the therapeutic targets in future clinical trials.
