骨 補 填 材 と し て の 焼 成 温 度 の 違 い に よ る
炭 酸 含 有 ア パ タ イ ト の 臨 床 的 有 用 性 の 検 討
門 中 貴 義
本 論 文 の 要 旨 は ，第 1 4 8 回 朝 日 大 学 歯 学 研 究 発 表 会（ 平 成 2 5 年 1 0 月 2 5 日 ， 岐 阜 ） に お い て 発 表 し た ． 本 論 文 の 一 部 は ， 第 4 3 回 日 本 口 腔 イ ン プ ラ ン ト 学 会 総 会 （ 平 成 2 5 年 9 月 1 5 日 ， 博 多 ） に お い て 発 表 し た ．
1 緒 言 歯 科 イ ン プ ラ ン ト 治 療 は オ ッ セ オ イ ン テ グ レ ー シ ョ ン タ イ プ の イ ン プ ラ ン ト シ ス テ ム の 確 立 に よ っ て ， 咬 合 回 復 を 目 的 と す る 治 療 効 果 の 予 知 性 が 高 ま り ， 盛 ん に 臨 床 応 用 が 行 わ れ て い る ． 一 方 で 高 齢 社 会 を 迎 え た 日 本 で は ， 歯 科 イ ン プ ラ ン ト 治 療 対 象 患 者 の 高 齢 化 も 進 み , 加 齢 や 歯 周 病 に よ る 骨 吸 収 や 外 傷 に よ る 骨 欠 損 を 伴 っ た 症 例 に 遭 遇 す る こ と も 少 な く な い ． こ の よ う な 骨 吸 収 や 骨 欠 損 に 対 し ， 骨 再 生 療 法 に は 自 家 骨 を 用 い た 処 置 が 最 も 有 用 で あ る と さ れ て き た が １ ， ２ ） 自 家 骨 採 取 の た め の 処 置 が 必 要 な た め ，手 術 侵 襲 の 増 大 や ， 手 術 時 間 の 延 長 な ど ， 様 々 な 問 題 が 残 さ れ て い る ． そ こ で ， 自 家 骨 に か わ る 人 工 骨 補 填 材 料 を 用 い た 骨 増 生 処 置 が 臨 床 応 用 さ れ て い る ３ ）． 人 工 骨 補 填 材 の 骨 欠 損 部 へ の 臨 床 応 用 に あ た り ， 材 料 に 具 備 さ れ る 条 件 に は ， 生 体 親 和 性 と 材 料 吸 収 性 が あ る ４ ）． こ れ ま で 臨 床 で は ， ハ イ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト （ H A ） や - T r i c a l c i u m P h o s p h a t e （ - T C P ） 等 の リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 系 材 料 が 応 用 さ れ て き た ５ ） ． し か し ， H A は 生 体 親 和 性 に 優 れ る が 材 料 吸 収 性 で は な い た め , 生 体 内 に 残 存 す る ６ ）． - T C P は 生 体 内 で 吸 収 さ れ ， 骨 と 置 換 す る 材 料 で あ る が ７ ～ ９ ） ， 含 有 さ れ て い る 成 分 の 中 に は 生 体 に は 存 在 し な い 物 質 が 含 ま れ て い る た め ， 異
2 物 反 応 を 示 し た と い う 報 告 も あ り 1 0 ），生 体 親 和 性 に お い て 問 題 が あ る ． さ ら に - T C P は , 最 終 的 に 骨 に 置 換 す る と さ れ て い る が ， 生 体 へ 填 入 さ れ た 後 ， ６ ～ ９ か 月 で 2 7 ～ 3 9 ％ が 残 留 す る と い う 報 告 も あ り 1 1 ）， 完 全 に 吸 収 さ れ る ま で に は 長 期 間 を 要 す る こ と か ら ， イ ン プ ラ ン ト 体 を 埋 入 し て 正 常 な オ ッ セ オ イ ン テ グ レ ー シ ョ ン を 得 る に は 早 期 の 骨 へ の 置 換 が 求 め ら れ る ． こ の よ う な 問 題 点 を 改 善 す べ く , D o i ら と E l l i e s は 生 体 親 和 性 に 優 れ , 吸 収 性 材 料 で あ る 炭 酸 含 有 ア パ タ イ ト （ C a r b o n a t e d A p a t i t e , C A ） を 開 発 し た 1 2 ～ 1 3 ） ． そ し て ， そ の 優 れ た 特 性 を 活 か し た 生 体 応 用 研 究 が こ れ ま で に 報 告 さ れ て き た 1 4 ）． 本 研 究 で は , C A の 臨 床 応 用 の 可 能 性 と ， そ の 人 工 骨 補 填 材 と し て の 有 用 性 を 検 討 す る 目 的 に ラ ッ ト 大 腿 骨 を 用 い た 動 物 実 験 モ デ ル に お い て 焼 成 温 度 の 異 な る （ 7 0 0 ℃ / 5 0 0 ℃ ） C A 顆 粒 を 人 工 骨 補 填 材 料 と し て 填 入 し ， 組 織 学 的 に 評 価 し ， さ ら に ， 吸 着 徐 放 性 の 検 討 も 併 せ て 行 っ た ． 使 用 し た C A は 渡 辺 ら の 報 告 を も と に 5 0 0 ℃ お よ び 7 0 0 ℃ の 温 度 で 焼 成 し た ５ ）．
3 材 料 お よ び 方 法 １ ． 実 験 動 物 実 験 動 物 は ８ 週 齢 近 交 系 W i s t a r / S l c 雄 性 ラ ッ ト（ 平 均 体 重 1 9 0 . 0 ± 2 0 . 0 g 中 部 科 学 資 材 , 名 古 屋 ）6 4 匹 を 室 温 2 2 ± 2 ℃ , 湿 度 5 5 ± 5 ％ , 1 2 時 間 の 照 明 サ イ ク ル で ， 各 ケ ー ジ は 自 由 運 動 可 能 な 環 境 と し , 固 形 飼 料 （ M F® , オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 , 日 本 ） や 飲 用 水 を 自 由 摂 取 で き る 飼 育 環 境 と し た ．な お , 動 物 実 験 は , 朝 日 大 学 歯 学 部 動 物 実 験 倫 理 委 員 会 （ 承 認 番 号 1 2 － 0 0 4 ） の 指 針 に 基 づ い て 行 い , 実 験 操 作 に 用 い る 器 具 は 高 圧 蒸 気 滅 菌 処 理 後 に 使 用 し た ． ２ ． C A （ C a r b o n a t e A p a t i t e ） 顆 粒 の 作 製 実 験 に 際 し ， C A 顆 粒 は 土 井 ら の 方 法 に 準 じ て 1 3 ） ， ６ M の 炭 酸 二 ナ ト リ ウ ム を 含 む 1 . 2 M の リ ン 酸 二 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 ４ ℓ 中 に ２ M の 硝 酸 カ ル シ ウ ム 水 溶 液 １ ℓ を ２ 時 間 に わ た り 滴 下 し ， ㏗ 9 . 0 ± 0 . 1 を 1 0 0 ℃ （ 沸 騰 状 態 ） で ３ 日 間 維 持 し な が ら 合 成 し た ． 合 成 後 の 試 料 は 沈 殿 , 水 洗 を 1 0 回 以 上 繰 り 返 し , 一 昼 夜 乾 燥 さ せ た ． そ の 後 ， 炭 酸 ガ ス 量 を 熱 重 量 測 定 （ T G ）（ T h e r m o p l u s , T M A - 8 1 2 0 ， R i g a k u ） で , 炭 酸 イ オ ン 含 有 率 が 約 1 2 . 5 w t ％ の 試 料 を 予 備 加 熱 し た 後 ， 5 0 0 ℃ と 7 0 0 ℃ で １ 時 間 焼 成 処 理 し た ． 焼 成 後 , 各 試 料 を 乳 棒 と 乳 鉢 で 粉
4 砕 し , メ ッ シ ュ サ イ ズ 3 0 0 ～ 5 0 0 ㎛ の 篩 に か け , 5 0 0 ℃ 焼 成 C A （ C A 5 0 0 ） あ る い は 7 0 0 ℃ 焼 成 C A（ C A 7 0 0 ） の C A 顆 粒 標 品 と し た （ 図 １ ）． ３ ． F i b r o b l a s t G r o w t h F a c t o r ２ （ F G F 2 ） の 添 加 F G F 2 を C A 5 0 0 と C A 7 0 0 に そ れ ぞ れ 含 有 さ せ た C A 顆 粒 を 作 製 し た ．H u m a n F G F - b a s i c（ P e p r o T e c h , R o c k y H i l l , N J , U S ） 5 0 ㎍ 粉 末 を 滅 菌 生 理 食 塩 水 １ ㎖ に 溶 解 し , 濃 度 5 0 ㎍ / ㎖ の F G F 2 溶 液 1 0 ㎕ を C A 2 0 ㎎ に 滴 下 し , 氷 上 で １ 時 間 浸 漬 さ せ て そ れ ぞ れ C A 5 0 0 F G F , C A 7 0 0 F G F と し た （ 図 ２ ）． 図 ２ C A 顆 粒 へ の F G F 2 の 吸 着 操 作 a ： 焼 成 後 の 精 製 さ れ た C A b ： 粉 砕 後 ， 3 0 0 ～ 5 0 0 ㎛ 顆 粒 に 整 粒 さ れ た C A さ 整 粒 さ れ た C A
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図 １ C A 実 験 材 料5 ４ ． C A 顆 粒 の 填 入 処 置 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル （ ソ ム ノ ペ ン チ ル ® ， 共 立 製 薬 ， 東 京 ） を 腹 腔 内 （ 1 ㎖ / k g ） へ 投 与 し ， 全 身 麻 酔 下 で ， 両 側 大 腿 部 を 除 毛 後 ， ク ロ ル ヘ キ シ ジ ン で 消 毒 し ， 大 腿 部 皮 膚 に 切 開 を 加 え ， 筋 組 織 を 避 け な が ら 大 腿 骨 を 露 出 さ せ た ． 骨 膜 を 剝 離 し た 後 ， 大 腿 骨 近 位 骨 幹 部 で 直 径 2 . 4 ㎜ の 歯 科 イ ン プ ラ ン ト 用 ト レ フ ィ ン バ ー （ ㈱ デ ン テ ッ ク ， 東 京 ） で 熱 を 加 え な い よ う 注 水 下 で 骨 髄 腔 に 達 す る 骨 欠 損 を 形 成 し た （ 図 ３ － A ）． 鋭 匙 鉗 子 で 骨 髄 を 掻 爬 し ， 止 血 確 認 後 ， ア マ ル ガ ム 充 填 器 を 用 い て 各 種 実 験 材 料 を ， そ れ ぞ れ ， C A 群 な ら び に F G F 群 の 各 個 体 に 加 圧 填 入 し た （ 図 ３ － B ）． C A 顆 粒 填 入 後 ， 速 や か に 筋 組 織 お よ び 皮 膚 を 4 － 0 ナ イ ロ ン 糸 で 縫 合 し ， 表 面 を ヨ ー ド で 消 毒 し た 後 ， デ ン タ ル エ ッ ク ス 線 写 真 で C A 顆 粒 の 填 入 を 確 認 後 ，抗 菌 薬 （ セ フ ァ ゾ リ ン 注 ® 明 治 製 薬 ， ５ ㎍ / ㎖ ） の 筋 注 投 与 を ３ 日 間 行 っ た ． b ： C A 顆 粒 填 入 後 の 状 態 a ： ト レ フ ィ ン バ ー に て 形 成 し た 骨 欠 損 図 ３ ラ ッ ト 大 腿 骨 C A 顆 粒 填 入 処 置
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6 ５ ． 標 本 採 取 填 入 処 置 後 １ ， ２ な ら び に ４ 週 経 過 ま で を 実 験 期 間 と し て ， そ れ ぞ れ の 実 験 期 間 後 の ラ ッ ト を 全 身 麻 酔 下 で 1 0 ％ ホ ル マ リ ン に よ る 灌 流 固 定 を 行 い ， 大 腿 骨 を 摘 出 し ，同 固 定 液 に ４ ℃ で １ 晩 浸 漬 し て 採 取 試 料 と し た ． ６ ． 観 察 方 法 １ ) マ イ ク ロ C T （ µ C T ） に よ る 材 料 吸 収 性 骨 欠 損 部 に 填 入 し た C A 顆 粒 の 経 時 的 材 料 吸 収 性 を 評 価 す る た め ， C A 5 0 0 群 と C A 7 0 0 群 の 填 入 処 置 直 後 を 含 め た 各 実 験 期 間 経 過 後 の 摘 出 し た 大 腿 骨 を パ ラ フ ィ ル ム （ 富 士 理 科 工 業 ， 大 阪 ） で 覆 い ， 乾 燥 を 防 止 し な が ら ， 管 電 圧 9 0 . 5 k V ， 管 電 流 8 7 . 5 ㎂ ， 幾 何 学 的 拡 大 率 9 . 0 0 倍 ， 解 像 度 1 1 . 1 ㎛ / p i x e l で µ C T （ S c a n m a t e - R B 0 9 0 S S 1 5 0 ， コ ム ス キ ャ ン テ ク ノ ， 横 浜 ） 断 層 撮 影 を 行 っ た ． な お ， 骨 塩 量 計 測 フ ァ ン ト ム も 同 一 条 件 の も と 撮 影 を 行 っ た ． 骨 欠 損 部 の C A 体 積 は 三 次 元 画 像 解 析 ソ フ ト ウ ェ ア （ T R I / 3 D - B O N E R A T O C S y s t e m E n g i n e e r i n g ， 東 京 ） を 使 用 し ，骨 塩 量 計 測 フ ァ ン ト ム と 大 腿 骨 試 料 の C T 値 か ら 大 腿 骨 試 料 の 骨 密 度 （ B M D 値 ） を 算 出 し ， B M D 画 像 を 作 成 し た ． な お ， 骨 塩 量 計 測 フ ァ ン ト ム は 合 成 ア パ タ イ ト / 合 成 樹 脂 の 複 合 物 ： 2 0 0 ～ 8 0 0 ㎎ H A / ㎤ ， ア ル ミ 箔 ： 2 4 3 7 ㎎ H A / ㎤ ， ヒ ト エ ナ メ ル 質 ： 3 1 0 0 ㎎ H A / ㎤ を
7 標 準 物 質 と し た ． 画 像 解 析 は B M D 画 像 上 に お け る 骨 欠 損 部 の C A ， 新 生 骨 を 含 む 領 域 を 計 測 領 域 と し ， 計 測 領 域 の マ ニ ュ ア ル ト レ ー ス を 行 い ， C A ， 新 生 骨 を 含 む 全 組 織 量 （ 計 測 組 織 量 ， T V ） を 抽 出 し た ． T V の 中 で B M D 値 が 4 4 5 以 上 9 4 3 ㎎ / ㎤ 未 満 の 部 位 を 新 生 骨 と み な し ， T V か ら 新 生 骨 を 差 し 引 い た B M D 値 9 4 3 ㎎ / ㎤ 以 上 の も の を C A と み な し ， C A 群 の 填 入 処 置 直 後 か ら 各 実 験 期 間 経 過 時 点 ま で の 残 存 C A の 体 積 を 算 出 し た ． な お ， C A 5 0 0 群 と C A 7 0 0 群 に お け る 経 時 的 減 少 率 の 有 意 差 は S t u d e n t t t e s t （ P < 0 . 0 5 ） で 評 価 し た ． ２ ) 組 織 標 本 の 作 製 と 観 察 固 定 後 の 大 腿 骨 試 料 は 1 0 % E D T A で 4 週 間 中 性 脱 灰 し ， 通 法 に 従 い ， ア ル コ ー ル 上 昇 系 列 に て 脱 水 後 ， キ シ レ ン で 置 換 ， パ ラ フ ィ ン 包 埋 後 ， ４ ㎛ の 連 続 切 片 を 作 製 し た ． ３ ) H E 染 色 に よ る 観 察 C A 填 入 後 の 骨 欠 損 部 の 修 復 過 程 を 経 時 的 に 観 察 す る た め ， 各 実 験 群 の 実 験 期 間 の パ ラ フ ィ ン 切 片 を 通 法 に 従 っ て H E 染 色 後 ， 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た ．
8 ４ ) T R A P 染 色 に よ る 観 察 脱 パ ラ フ ィ ン し た 薄 切 切 片 を ， 下 降 ア ル コ ー ル で 水 和 し ， 1 0 m M P B S で １ 時 間 洗 浄 し た ． 続 い て 0 . 1 M 酢 酸 緩 衝 液 ㏗ 5 . 0 に 浸 漬 し た 後 ， T a r t r a t e - R e s i s t a n t A c i d P h o s p h a t a s e ，（ T R A P ） 溶 液 を 滴 下 し て 常 温 １ ～ ２ 時 間 の 発 色 反 応 後 ， 0 . 0 1 N 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 で 反 応 を 停 止 さ せ ， 水 洗 後 ， ヘ マ ト キ シ リ ン に よ る 対 比 染 色 を 行 っ た ． ５ ) 免 疫 組 織 学 的 検 索 脱 パ ラ フ ィ ン 後 に 下 降 ア ル コ ー ル で 水 和 し ， P B S で 洗 浄 し た 切 片 を ，0 . 3 ％ 過 酸 化 水 素 水 に て 組 織 中 の 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 除 去 し た ． 次 に １ ％ ウ シ ア ル ブ ミ ン 血 清 で 3 0 分 間 の ブ ロ ッ キ ン グ 後 に ，骨 芽 細 胞 分 化 マ ー カ ー と す る O s t e r i x 抗 体 （ 以 下 O S X 抗 体 , r a b b i t p o l y c l o n a l , 抗 体 濃 度 1 . 8 ㎍ / ㎖ , A b c a m I n c . C a m b r i d g e , U K ） な ら び に 形 成 さ れ た 骨 細 胞 と 骨 小 腔 に 存 在 す る タ ン パ ク を 骨 成 熟 マ ー カ ー と し て D e n t i n M a t r i x P r o t e i n - 1 （ 以 下 D M P - 1 抗 体 , r a b b i t p o l y c l o n a l , 抗 体 濃 度 2 . 0 ㎍ / ㎖ , T A K A R A , O t s u ）を そ れ ぞ れ 室 温 で 2 時 間 反 応 さ せ た ． な お ， D M P - 1 抗 体 反 応 前 に ， 0 . 1 ％ t r y p s i n 処 理 （ 3 7 ℃ , 1 5 分 ） に よ る 抗 原 賦 活 化 を 行 っ た ． 1 次 抗 体 反 応 後 ， P B S 洗 浄 を 行 い ， ヒ ス ト フ ァ イ ン シ ン プ ル ス テ イ ン M A X - P O® （ ニ チ レ イ バ
9 イ オ サ イ エ ン ス ， 東 京 ） を H R P 標 識 ２ 次 抗 体 と し て 常 温 で 3 0 分 間 反 応 さ せ た ． P B S 洗 浄 後 ， 0 . 0 3 % 過 酸 化 水 素 水 を 活 性 化 剤 と し て 含 ま せ た 濃 度 0 . 0 5 ％ の 3 , 3 ’ - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h l o r i d e （ D a k o ， 東 京 ） を 発 色 基 質 と し て ５ 分 間 基 質 発 色 さ せ ， ヘ マ ト キ シ リ ン に よ る 対 比 染 色 を 行 い ， 光 学 顕 微 鏡 で 組 織 を 観 察 し た ． さ ら に ， O S X に つ い て は O S X 抗 体 陽 性 細 胞 数 を 高 倍 率 ３ 視 野 で 計 測 し ， C A 5 0 0 群 と C A 7 0 0 群 ， C A 5 0 0 F G F 群 と C A 7 0 0 F G F 群 に お け る O S X 抗 体 陽 性 細 胞 の 有 意 差 を S t u d e n t t t e s t （ P < 0 . 0 5 ） で 評 価 し た ．
10 結 果 １ . µ C T に よ る C A 顆 粒 の 経 時 的 材 料 吸 収 性 C A 5 0 0 と C A 7 0 0 を 填 入 直 後 か ら ４ 週 ま で の 各 実 験 期 間 に お け る 骨 欠 損 部 の 一 定 範 囲 単 位 面 積 当 た り の C A 量 を 填 入 直 後 の C A 体 積 量 を 1 0 0 ％ と し て 算 出 し ， そ の 経 時 的 減 少 率 を 求 め た （ 図 ４ ）． C A 5 0 0 群 で は 填 入 直 後 か ら ４ 週 ま で ほ ぼ 一 定 の 割 合 で C A 顆 粒 が 吸 収 さ れ ， ４ 週 で は 6 0 ％ の 吸 収 （ 残 存 C A 体 積 4 0 ％ ） を 示 し た ． 一 方 ， C A 7 0 0 群 で は C A 5 0 0 群 よ り も 緩 徐 な C A 顆 粒 吸 収 を 示 し ， ２ 週 以 降 ， わ ず か に 吸 収 量 増 加 を 認 め た が ， ４ 週 で は 2 8 ％ の 吸 収 （ 残 存 C A 体 積 7 2 ％ ） で あ っ た ． 図 ４ C A の 経 時 的 吸 収 率 （ ※ P < 0 . 0 5 s t u d e n t t t e s t ） 棒 線 は 値 の 偏 差 を 示 す 残 存 体 積 C A 実 験 週 齢 ※ ※ ※
11 ２ . H E 染 色 の 組 織 像 １ ） C A 群 填 入 処 置 後 1 週 で は ， C A 5 0 0 群 ， C A 7 0 0 群 の 両 群 で C A 顆 粒 が 線 維 芽 細 胞 を 主 と す る 肉 芽 組 織 に よ っ て 被 包 さ れ て お り ， こ の C A 顆 粒 周 囲 の 肉 芽 組 織 と C A 顆 粒 と の 間 隙 に 紡 錘 形 ， 多 角 形 あ る い は 多 核 を 示 す 巨 細 胞 の 集 族 を 認 め た （ 図 5 c , d ）． 黒 矢 印 ： 肉 芽 組 織 図 ５ 填 入 処 置 後 1 週 の 組 織 像 像
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a ： C A 5 0 0 の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 の 強 拡 大12 填 入 処 置 後 ， ２ 週 で は ， C A 顆 粒 の 吸 収 に 伴 い ， C A 顆 粒 周 囲 な ら び に 間 隙 に 増 生 し 始 め た 肉 芽 組 織 に 接 す る C A 表 面 に 未 熟 な 新 生 骨 の 形 成 を 認 め た（ 図 ６ c , d ）． C A 顆 粒 の 吸 収 は C A 5 0 0 群 で 大 き く ， 一 方 ， 新 生 骨 の 骨 梁 は C A 7 0 0 群 で 太 く ，C A 表 面 に お け る 骨 芽 細 胞 の 分 化 も 旺 盛 で あ っ た （ 図 ６ d ）． N B ： 新 生 骨 図 ６ 填 入 処 置 後 ２ 週 の 組 織 像 像 N B N B
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a ： C A 5 0 0 の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 の 強 拡 大13 填 入 処 置 後 ４ 週 を 経 過 す る と ， C A 顆 粒 は 填 入 処 置 時 と 比 べ ， 明 ら か な C A 顆 粒 の 吸 収 を 認 め ， そ の 傾 向 は C A 5 0 0 群 で 顕 著 で あ っ た ，（ 図 ７ a , b ）． 一 方 ， C A 5 0 0 群 ， C A 7 0 0 群 の 両 群 で ， 成 熟 骨 の 特 徴 で あ る 骨 層 板 や 骨 細 胞 を 容 れ た 骨 小 腔 を 認 め た ． 図 ７ 填 入 処 置 後 ４ 週 の 組 織 像
像
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黒 矢 印 ： 骨 小 腔 a ： C A 5 0 0 の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 の 強 拡 大14 ２ ） F G F 群 填 入 処 置 後 １ 週 に お け る F G F 群 で は C A 群 と 同 様 に C A 顆 粒 の 肉 芽 組 織 の よ る 被 包 や 紡 錘 形 ， 多 角 形 あ る い は 多 核 を 示 す 巨 細 胞 の 集 族 を 認 め た が ， １ 週 に お け る C A 群 と F G F 群 間 に そ の 細 胞 数 や 形 態 に 特 異 な 差 は み ら れ な か っ た （ 図 ８ c , d ）． 図 ８ F G F 群 填 入 処 置 後 １ 週 の 組 織 像 像
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黒 矢 印 ： 多 核 巨 細 胞 を 示 す a ： C A 5 0 0 F G F の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 F G F の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大15 填 入 処 置 後 ２ 週 で は C A 群 と 同 様 に C A 顆 粒 周 囲 お よ び そ の 間 隙 に 未 熟 な 骨 形 成 が み ら れ た が ， そ の 骨 梁 は C A 群 に 比 較 し て 太 く ， 骨 小 腔 も 多 い 傾 向 を 示 し た ． し か し ， C A 5 0 0 F G F と C A 7 0 0 F G F 間 に は そ の 差 は 認 め な か っ た （ 図 ９ c , d ）． 図 ９ F G F 群 填 入 処 置 後 ２ 週 の 組 織 像 像
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N B N B N B ： 新 生 骨 a ： C A 5 0 0 F G F の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 F G F の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大16 填 入 処 置 後 ４ 週 を 経 過 す る と ， 明 ら か な 骨 層 板 や 多 数 の 骨 小 腔 が 観 察 さ れ ，そ れ ら は C A 群 よ り も 多 く み ら れ た （ 図 1 0 b , d ）． さ ら に ， C A 7 0 0 F G F で は 骨 の リ モ デ リ ン グ に お け る 改 造 線 も み ら れ た （ 図 1 0 d ）． 図 1 0 F G F 群 填 入 処 置 後 ４ 週 の 組 織 像
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黒 矢 印 ： 改 造 線 を 示 す a ： C A 5 0 0 F G F の 弱 拡 大 b ： C A 7 0 0 F G F の 弱 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大17 ３ . T R A P 染 色 の 組 織 像 µ C T 解 析 結 果 か ら C A 5 0 0 で 吸 収 傾 向 が 強 く ，さ ら に ， 填 入 処 置 後 １ 週 の H E 染 色 所 見 に お い て C A 顆 粒 と 肉 芽 組 織 と の 境 界 部 に 多 核 を 示 す 破 骨 細 胞 様 細 胞 の 集 族 を 認 め た た め ，こ れ を T R A P 染 色 で 確 認 し た 結 果（ 図 1 1 ）， 多 核 の 細 胞 は T R A P 陽 性 を 示 し ， C A 5 0 0 群 な ら び に C A 5 0 0 F G F（ 図 1 1 a , c で そ の 数 は 多 く ， C A 5 0 0 F G F 群 （ 図 1 1 a ） で そ の 傾 向 は 顕 著 で あ っ た ． 図 1 1 填 入 処 置 後 １ 週 の T R A P 染 色 組 織 像
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a ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 強 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大18 ４ ． 免 疫 染 色 の 病 理 組 織 像 １ ) O S X の 発 現 と 解 析 填 入 処 置 後 ２ 週 の C A 表 面 に お け る 肉 芽 組 織 か ら の 骨 芽 細 胞 へ の 分 化 を O S X 抗 体 免 疫 染 色 で 検 索 し た ． C A 群 ， F G F 群 と も に 焼 成 温 度 5 0 0 ℃ よ り も 7 0 0 ℃ で C A 顆 粒 周 囲 の 細 胞 核 に 陽 性 を 示 し ， F G F 群 で 多 く の 陽 性 細 胞 を 認 め た （ 図 1 2 ）． C A 5 0 0 C A 5 0 0 F G F 図 1 2 填 入 処 置 後 ２ 週 の O S X 免 疫 染 色 組 織 像
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a ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 強 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大19 O S X 抗 体 陽 性 細 胞 数 を 高 倍 率 ３ 視 野 で 計 測 し た と こ ろ ， C A 7 0 0 群 が C A 5 0 0 群 よ り も ， ま た ， F G F 2 群 が C A 群 よ り も 有 意 に そ の 発 現 を 認 め た ． し か し ， F G F 2 群 で は C A 5 0 0 と C A 7 0 0 間 に 有 意 な 差 は 認 め な か っ た（ 図 1 3 ）． 図 1 3 各 種 材 料 の O S X 陽 性 細 胞 数 （ t h r e e h i g h p o w e r f i e l d s ） （ ※ P < 0 . 0 5 s t u d e n t t t e s t ） 棒 線 は 値 の 偏 差 を 示 す 陽 性 細 胞 数
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２ ) D M P - 1 の 発 現
成 熟 し た 骨 細 胞 ， 骨 小 腔 や 骨 基 質 に 発 現 を 示 す D M P - 1 は C A 5 0 0 群 よ り も C A 7 0 0 群 で 免 疫 染 色 に よ る タ ン パ ク の 高 発 現 を 認 め た ． ま た ， F G F 群 に お い て も 7 0 0 ℃ で 陽 性 発 現 が 多 く ， C A 7 0 0 F G F 群 で 最 も 多 い 陽 性 細 胞 を 認 め た （ 図 1 4 ）． 図 1 4 填 入 処 置 後 ４ 週 の D M P - 1 免 疫 染 色 組 織 像a
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d
a ： C A 5 0 0 の 強 拡 大 b ： C A 7 0 0 の 強 拡 大 c ： C A 5 0 0 F G F の 強 拡 大 d ： C A 7 0 0 F G F の 強 拡 大21 考 察 骨 再 生 に よ る 骨 欠 損 部 の 創 傷 治 癒 に は ， 一 般 的 な 組 織 の 再 生 要 素 と 同 様 ， ス キ ャ フ ォ ー ル ド ， 成 長 因 子 な ら び に 幹 細 胞 と い う ３ 要 素 が 必 要 と さ れ て い る 1 5 , 1 6 ）． こ の 場 合 の ス キ ャ フ ォ ー ル ド と な る 人 工 骨 補 填 材 に は 良 好 な 骨 伝 導 能 と と も に 生 体 親 和 性 , さ ら に は 臨 床 的 操 作 性 と 材 料 吸 収 性 を 有 し て い る こ と が 求 め ら れ る 9 ）． 現 在 ， 臨 床 に お い て は H A や - T C P 等 の リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 系 材 料 が 応 用 さ れ て い る が 5 ） ， 上 記 の よ う な 人 工 骨 補 填 材 料 に 求 め ら れ る す べ て の 要 件 を 具 備 し て い る も の は 少 な い ． 土 井 ら は , こ れ ら の 要 件 を 可 能 な 限 り 満 た す こ と を 目 的 に C A を 開 発 し て き た 1 3 ） ． C A は ， そ の 構 成 要 素 に 炭 酸 基 （ C O 32 -） を 含 有 し た リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 結 晶 で あ り ，単 純 な リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 構 造 を 有 す る H A よ り も そ の 構 造 は 生 体 の 骨 ア パ タ イ ト の リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 結 晶 に 類 似 し て い る 1 7 ）．ま た ，H A の 作 製 に は 大 気 圧 で 1 1 0 0 ～ 1 2 0 0 ℃ の 焼 成 が 必 要 で 1 8 , 1 9 ），こ の 条 件 で 焼 成 さ れ た ア パ タ イ ト は 骨 ア パ タ イ ト よ り も 高 結 晶 と な り 生 体 で は ほ と ん ど 吸 収 さ れ な く な る ． 一 方 ， 炭 酸 基 イ オ ン 含 有 量 約 ９ w t ％ 以 上 の C A は 結 晶 が 極 め て 微 細 と な る た め 従 来 の ア パ タ イ ト に 比 べ て 5 0 0 ～ 7 0 0 ℃ の 温 度 で 焼 成 が 可 能 で あ り 1 9 ） ， ま た ， 焼 成 処 理 温 度 に よ り 炭 酸 含
22 有 量 が 変 化 す る こ と も 分 か っ て い る ． 今 回 使 用 し た 焼 成 温 度 5 0 0 ℃ と 7 0 0 ℃ の C A で は 約 ６ w t ％ で 1 9 ），生 体 の 骨 ア パ タ イ ト と 近 似 し , 生 体 親 和 性 と 材 料 吸 収 性 を 兼 ね 備 え る と い え る ． ま た C A に 関 す る 研 究 報 告 に よ り ， こ れ ら の 条 件 を 具 備 す る だ け で な く , 骨 伝 導 能 も 有 す る C A の 人 工 骨 補 填 材 と し て の 臨 床 的 有 用 性 を , 材 料 の 焼 成 温 度 の 違 い に よ る 材 料 吸 収 性 ， な ら び に 骨 形 成 能 で 比 較 し ， 臨 床 応 用 へ の 可 能 性 を 探 っ た ． さ ら に ， C A は タ ン パ ク 吸 着 性 に も 優 れ る こ と か ら ， 成 長 因 子 の 徐 放 性 基 材 と し て の 有 用 性 も 検 討 し た ． 本 研 究 で は 血 管 新 生 や 創 傷 治 癒 な ど に 関 与 し ， 骨 芽 細 胞 に 対 し て 増 殖 と 分 化 を 制 御 す る こ と が 示 さ れ て い る 2 0 ） F G F 2 を 成 長 因 子 と し , 骨 形 成 促 進 を 目 的 に C A と の 併 用 を 試 み た ． 最 近 の 研 究 で は コ ラ ー ゲ ン を 基 材 と し て 局 所 投 与 し た F G F 2 が ウ サ ギ の 骨 折 治 癒 を 促 進 し た と 報 告 さ れ 2 1 ） ，F G F 2 は 骨 再 生 を 促 進 さ せ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る 2 1 ） ． 填 入 処 置 後 の 材 料 吸 収 性 に つ い て は ４ 週 ま で の 実 験 期 間 で C A 5 0 0 と C A 7 0 0 の 材 料 填 入 部 に お け る 経 時 的 材 料 吸 収 性 を 填 入 直 後 を 1 0 0 ％ と し て 追 跡 し た と こ ろ ， C A 7 0 0 で は ２ 週 以 降 で や や 材 料 吸 収 が 増 加 し た も の の ， 全 体 で は 比 較 的 緩 や か な 材 料 吸 収 を 示 し た の に 対 し ，4 週 経 過 時 の C A 5 0 0 で は 填 入 直 後 か ら C A 7 0 0 を 上 回 る 材 料 吸 収 性 を 示 し ， 吸 収 率 で は ４ 週 で そ れ ぞ れ 6 0 ％ と
23 2 8 ％ で ，逆 に C A 残 存 率 は そ れ ぞ れ C A 5 0 0 で 4 0 ％ ，C A 7 0 0 で 7 2 ％ と な っ た ． 生 体 内 で の リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 系 基 材 の 吸 収 は , 2 つ の 異 な る 機 序 が 考 え ら れ て お り ， 組 織 液 に よ る 溶 解 や 崩 壊 と 細 胞 に よ る も の で あ る ． 今 回 使 用 し た C A 5 0 0 と C A 7 0 0 の 生 体 内 で の 吸 収 動 態 の 違 い は 上 記 の 材 料 吸 収 性 の 違 い が 反 映 し て い る も の と 思 わ れ る ． す な わ ち C A 5 0 0 は C A 7 0 0 よ り も 物 理 的 に 非 常 に 脆 く ， 僅 か な 外 力 が 加 わ る こ と で 崩 れ て し ま う ． ま た ， 焼 成 温 度 が C A 7 0 0 よ り も 低 く ， 結 晶 度 も 低 い た め に C A 5 0 0 は 生 体 内 で 崩 壊 性 を 示 し ， そ の 結 晶 性 も ま た 破 骨 細 胞 に よ る 吸 収 を 受 け や す い た め ， 材 料 の 吸 収 性 が 進 ん だ と 考 え ら れ る ． さ ら に ， １ 週 に お い て 材 料 の 吸 収 に 関 す る 検 索 で T R A P 染 色 を 行 っ た が ， C A 5 0 0 群 で C A 7 0 0 群 よ り も 多 く ， C A 周 囲 の 多 核 の 巨 細 胞 に 陽 性 を 示 し た ． こ れ は 溶 解 に よ る 材 料 吸 収 に 加 え ， 細 か く 崩 壊 し た 材 料 が 細 胞 に よ り 吸 収 さ れ る こ と を 裏 付 け て お り ， そ の 性 質 が 焼 成 温 度 条 件 に よ り 最 終 的 な 材 料 吸 収 状 態 を 示 し た 本 研 究 結 果 を 反 映 す る も の で あ っ た 2 2 , 2 3 ）． 骨 補 填 材 と し て の 骨 形 成 を 目 的 と す る 骨 伝 導 能 に つ い て ， 一 般 的 な 骨 形 成 の 概 念 を 基 に 考 察 を 加 え た ． 一 般 に 骨 の 形 成 は 間 葉 系 幹 細 胞 か ら 前 駆 細 胞 ， 前 骨 芽 細 胞 ， 骨 芽 細 胞 へ と 分 化 し た 後 ， 最 終 的 に 骨 細 胞 へ と 変 化 す る と 考 え ら れ て い る 2 4 , 2 5 ） ．間 葉 系 幹 細 胞 か ら 骨 芽
24 細 胞 へ の 分 化 過 程 は , B M P シ グ ナ ル や W n t シ グ ナ ル が 重 要 な 役 割 を 果 た し て お り ， こ れ ま で に B M P に よ っ て 発 現 誘 導 が 認 め ら れ る 転 写 因 子 と し て の 遺 伝 子 に は R u n x 2 ， O S X が 報 告 さ れ て い る 2 6 , 2 7 ）． R u n x 2 は 骨 芽 細 胞 分 化 に 必 須 の 転 写 因 子 で あ る が ， 骨 芽 細 胞 分 化 の 初 期 で は 促 進 的 に ， 一 方 で 後 期 に は 抑 制 的 に 作 用 す る と 報 告 さ れ て い る 2 8 , 2 9 ） ． O S X は N a k a s h i m a ら に よ っ て 同 定 さ れ た Z i n c - f i n g e r タ ン パ ク フ ァ ミ リ ー に 属 す る 転 写 因 子 で あ り 3 0 ）， 骨 芽 細 胞 分 化 の 比 較 的 初 期 に 発 現 し ， R u n x 2 と 同 様 に 骨 形 成 に 必 須 の 転 写 因 子 で あ る と 考 え ら れ て い る が , O S X ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス で ， 頭 蓋 骨 形 成 予 定 部 位 と 長 管 骨 の 一 次 石 灰 化 軟 骨 周 囲 の 間 葉 系 細 胞 に ， R u n x 2 遺 伝 子 の 発 現 を 認 め ， 一 方 , R u n x 2 ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス で は O S X の 発 現 が 認 め な か っ た こ と か ら , O S X は R u n x 2 の 下 流 で 発 現 す る こ と が 示 さ れ て い る ． 本 研 究 で は ， ２ 週 に お け る 骨 形 成 状 態 お よ び 骨 芽 細 胞 へ の 分 化 の 評 価 を 行 う た め ， O S X の 免 疫 染 色 を 行 っ た と こ ろ , 新 生 骨 と 材 料 周 囲 と の 境 界 部 で み ら れ た O S X 陽 性 細 胞 は , C A 群 で は C A 5 0 0 群 よ り も C A 7 0 0 群 で 有 意 に そ の 発 現 を 認 め た ． 今 回 用 い た 人 工 骨 補 填 材 周 囲 で の 骨 形 成 で は 材 料 が ス キ ャ フ ォ ー ル ド と し て の 役 割 を 果 た し ， 細 胞 が 定 着 し ， 分 化 ， 増 殖 す る 必 要 が あ る ． C A 5 0 0 は 顆 粒 の 結 晶 が 生 体 内 で 崩 壊 す る こ と で 細 胞 の 定 着 が C A 7 0 0 と 比 較
25 し て 悪 い こ と か ら ， 細 胞 の 分 化 ， 増 殖 も 遅 れ る と 考 え れ ば ， O S X 陽 性 細 胞 は 少 な く , 逆 に ， C A 7 0 0 で は 安 定 し た 場 と し て の 材 料 環 境 の た め ， O S X 陽 性 細 胞 が 数 多 く 観 察 さ れ た と 考 え ら れ た ． 本 研 究 に お け る 形 成 さ れ た 骨 の 成 熟 に つ い て は ， そ の 指 標 に 骨 細 胞 や 骨 小 腔 内 内 面 ， あ る い は 骨 基 質 に 沈 着 す る D M P - 1 に 着 目 し た . 歯 の 象 牙 質 や 骨 の 非 コ ラ ー ゲ ン 性 タ ン パ ク で あ る D M P - 1 は ， G e o r g e ら に よ っ て ラ ッ ト 象 牙 質 か ら 分 離 さ れ た リ ン タ ン パ ク で ， そ の 後 ， 骨 基 質 に も 存 在 す る こ と が 知 ら れ て い る 3 1 ） ． ま た ， 分 化 し た 骨 細 胞 で も 産 生 さ れ ， 骨 基 質 に 沈 着 す る こ と か ら カ ル シ ウ ム イ オ ン 結 合 を 介 し て 骨 の 石 灰 化 に 関 与 す る 3 2 ～ 3 4 ） ． H E 染 色 に よ る 観 察 で は ， 処 置 後 ４ 週 を 経 過 す る と , す べ て の 群 で 新 生 骨 部 に 骨 成 熟 の 指 標 と な る ハ バ ー ス 管 や ， 骨 層 板 が 認 め ら れ た ． そ こ で ， ４ 週 の 標 本 で D M P - 1 に よ る 免 疫 染 色 を 観 察 し た 結 果 ， 材 料 周 囲 の 新 生 骨 部 で 発 現 を 認 め た が ， そ の 数 は C A 5 0 0 群 よ り も C A 7 0 0 群 で 多 か っ た ． こ の 結 果 は O S X の 各 群 発 現 状 況 と 近 似 し て お り ， 骨 芽 細 胞 分 化 が 早 期 に 起 こ れ ば 骨 細 胞 へ の 分 化 も 速 や か と な り ， 骨 成 熟 も 進 ん だ と 考 え ら れ た ． さ ら に 本 研 究 で は C A が 人 工 骨 補 填 材 と し て 優 れ た 成 長 因 子 の ス キ ャ フ ォ ー ル ド で も あ る こ と を 検 討 し た ． C A は タ ン パ ク 吸 着 性 が 良 い と 報 告 さ れ て い る こ と か
26 ら F G F 2 に 浸 漬 し た C A を 用 い て ， 填 入 部 に お け る 骨 再 生 の 動 態 を C A 群 と 同 様 に 比 較 検 討 し た と こ ろ ，塡 入 １ 週 後 の T R A P 染 色 で は , C A 群 と 同 様 ， C A 5 0 0 F G F 群 が C A 7 0 0 F G F 群 よ り も 陽 性 細 胞 を 数 多 く 認 め た ．F G F 2 の 添 加 の 有 無 に よ る T R A P 陽 性 細 胞 数 の 差 は C A 5 0 0 群 と C A 7 0 0 群 間 で み ら れ な か っ た た め ， F G F 2 は 破 骨 細 胞 活 性 に は 影 響 を 及 ぼ さ な い こ と が 考 え ら れ た ． 一 方 ， 塡 入 後 ２ 週 に お け る O S X 陽 性 細 胞 数 と ４ 週 に お け る D M P - 1 陽 性 細 胞 数 を C A 群 と F G F 群 で 比 較 し た と こ ろ , C A 5 0 0 群 よ り も C A 7 0 0 群 で 陽 性 発 現 を 数 多 く 認 め た が ， C A 5 0 0 F G F 群 と C A 7 0 0 F G F 群 の 間 に は 有 意 な 差 を 認 め な か っ た ．こ れ は C A の 焼 成 温 度 条 件 の 影 響 を 受 け る よ り も ， F G F 2 と の 併 用 が 骨 形 成 な ら び に 骨 成 熟 に 促 進 的 に 働 い て い る こ と が 示 唆 さ れ た ．
27 結 論 5 0 0 ℃ 焼 成 と 7 0 0 ℃ 焼 成 の C A の 臨 床 応 用 を 考 慮 す る と ， 5 0 0 ℃ で は 生 体 に お け る 材 料 吸 収 性 が 良 い 反 面 ， 骨 形 成 開 始 や 骨 成 熟 に 至 る 期 間 や C A 顆 粒 の 臨 床 的 操 作 性 に お い て は 7 0 0 ℃ の 方 が 良 好 で あ っ た ． 以 上 の 結 果 か ら 臨 床 応 用 に は 7 0 0 ℃ 焼 成 の C A 顆 粒 に ， 骨 吸 収 や 骨 欠 損 部 に 対 す る 人 工 骨 補 填 材 料 と し て の 期 待 が で き る ． ま た ， C A 顆 粒 と F G F 2 の 併 用 は 今 後 ， 至 適 濃 度 等 の 検 討 が 必 要 で は あ る が ， 骨 形 成 や 骨 成 熟 を 促 進 さ せ る こ と が 示 さ れ た こ と か ら ， 同 様 に 他 の 成 長 因 子 の 併 用 に よ る 有 用 性 も 期 待 さ れ る ．
28 引 用 文 献 1 ) 篠 原 正 徳 ， 白 砂 兼 光 編 ． 口 腔 外 科 学 ． 第 ３ 版 ． 東 京 : 医 歯 薬 出 版 ； 2 0 1 1 ： 5 5 2 - 5 6 3 ． 2 ） 山 下 善 弘 ， 山 本 哲 彰 ， 山 内 健 介 ． 下 顎 辺 縁 切 除 後 ， イ ン プ ラ ン ト に よ る 咬 合 再 建 の た め に 腸 骨 海 綿 骨 移 植 と チ タ ン メ ッ シ ュ ト レ ー に よ り 骨 造 成 を 行 っ た １ 例 ． 顎 顔 面 イ ン プ ラ ン ト 誌 ． 2 0 1 0 ； 9 ： 5 5 - 5 8 ． 3 ） 真 鍋 真 人 ． 歯 槽 骨 造 成 法 の 現 在 と 未 来 ． 昭 歯 誌 ． 2 0 0 7 ; 2 7 : 2 9 7 - 3 0 3 ． 4 ） H e n c h L L ． B i o c e r a m i c s f r o m c o n c e p t t o c l i n i c ． J . A m . C e r a m . S o c ． 1 9 9 1 ; 7 4 : 1 4 8 7 - 1 5 1 0 ． 5 ） O z a w a M , T a n a k a K , M o r i k a w a S , C h a z o n o M a n d F u j i k i K . C l i n i c a l s t u d y o f t h e p u r e β - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e - r e p o r t s o f 1 6 7 c a s e s . J E a s t J p n O r t h o p T r a u m a t a l ． 2 0 0 0 ; 2 : 4 0 9 - 4 1 3 . 6 ） K w o n g C H , B u r n s W B a n d C h e u n g H S . S o l u b i l i z a t i o n o f h y d r o x y a p a t i t i c c r y s t a l s b y m u r i n e b o n e c e l l s , m a c r o p h a g e s a n d f i b r o b l a s t s . B i o m a t e r i a l s . 1 9 8 9 ; 1 0 : 5 7 9 - 5 8 4 . 7 ） L e G e r o s R Z . P r o p e t i e s o f o s t e o c o n d u c t i v e b i o m a t e r i a l s : c a l c i u m p h o s p h a t e s . C l i n O r t h o p R e l a t R e s ． 2 0 0 2 ; 3 9 5 : 8 1 - 9 8 . 8 ） S t a v r o p o u l o s A , W i n d i s c h P , S z e n d r ӧ i - k i s s D ,
29 P e t e r R , G e r a I a n d S c u l e a n A . C l i n i c a l a n d h i s t o l o g i c e v a l u a t i o n o f g r a n u l a r b e t a - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e f o r t h e t r e a t m e n t o f h u m a n I n t r a b o n y p e r i o d o n t a l d e f e c t s : A r e p o r t o n f i v e c a s e s . J P e r i o d o n t o l . 2 0 1 0 ; 8 1 : 3 2 5 - 3 3 4 . 9 ) 渡 邉 岳 ， 坂 野 美 栄 ， 永 山 元 彦 ， 堀 田 正 人 ， 竹 内 宏 ． リ ン 酸 カ ル シ ム 基 材 に よ っ て 形 成 さ れ た 伝 導 性 骨 の 改 造 現 象 と そ の リ ン 酸 カ ル シ ウ ム 基 材 の 吸 収 ．岐 歯 学 歯 ． 2 0 1 0 ; 3 7 : 2 0 - 3 2 ． 1 0 ） N a g a y a m a M , T a k e u c h i H a n d D o i Y . C o m p a r i s o n o f c a r b o n a t e a p a t i t e a n d β - t r i c a l c i u m p h o s o h a t e （ R e s o r b a b l e c a l c i u m p h o s p h a t e s ） i m p l a n t e d s u b c u t a n e o u s l y i n t o t h e b a c k o f r a t s . D e n t M a t e r J ． 2 0 0 6 ; 2 5 : 2 1 9 - 2 2 5 . 1 1 ） S i m u n e k A , K o p e c k a D , S o m a n a t h a n R V , P i l a t h a d k a S a n d B r a z d a T . D e p r o t e i n i z e d b o v i n e b o n e v e r s u s b e t a - t r i c a l c i u m p h o s p h a t e i n i n s i n u s a u g m e n t a t i o n s u r g e r y : a c o m p a r a t i v e h i s t o l o g i c a n d h i s t o m o r p h o m e t r i c s t u d y .I n t J O r a l M a x i l l o f a c I m p l a n t s ． 2 0 0 8 ; 3 5 : 9 3 5 - 9 4 2 . 1 2 ） E l l i e s L G , N e l s o n D G A a n d F e a t h e r s o n e J D B . C r y s t a l l o g r a p h i c s t r u c t u r e a n d s u r f a c e m o r p h o l o g y o f s i n t e r e d c a r b o m a t e a p a t i t e s . J B i o m e d M a t e r R e s ． 1 9 8 8 ; 2 2 : 5 4 1 - 5 5 3 .
30 1 3 ） D o i Y , K o d a T , W a k a m a t s u N , G o t o T , K a m e m i z u H , M o r i w a k i Y , A d a c h i M a n d S u w a Y . I n f l u e n c e o f c a r b o n a t e o n s i n t e r i n g o f a p a t i t e s . J D e n t R e s ． 1 9 9 3 ; 7 2 : 1 2 7 9 - 1 2 8 4 . 1 4 ） D o i Y , S h i b u t a n i T , M o r i w a k i Y , K a j i m o t o T a n d I w a y a m a Y . S h i n t e r e d c a r b o n a t e a p a t i t e s a s b i o r e s o r b a b l e b o n e s u b s t i t u t e . J B i o m e d M a t e r R e s ． 1 9 9 8 ; 3 9 : 1 3 9 - 1 4 3 . 1 5 ) 鈴 江 懐 ， 小 林 忠 義 編 ． 病 理 学 総 論 ． 第 2 版 ． 東 京 ． 医 学 書 院 ； 1 9 7 5 : 4 2 6 - 4 3 8 ． 1 6 ) 中 村 敏 一 編 ． 再 生 医 学 か ら 再 生 医 療 へ ， 幹 細 胞 シ ス テ ム の 解 明 と 臨 床 応 用 へ の 可 能 性 へ 迫 る ． 1 版 ， 東 京 ． 羊 土 社 ； 2 0 0 0 : 2 1 - 4 5 . 1 7 ） A o k i H . S c i e n c e o f m e d i c a l a p p l i c a t i o n s o f h y d r o x y a p a t i t e T a k a y a m a P r e s s S y s t e m c e n t e r C o . , I n c . , 1 9 9 1 : 9 9 - 1 0 6 . 1 8 ） 土 井 豊 ， 森 脇 豊 ． ハ イ ド ロ キ シ ア パ タ イ ト ． 歯 科 ジ ャ ー ナ ル . 1 9 9 2 ; 3 6 ： 3 5 5 - 3 7 0 ． 1 9 ） 土 井 豊 ， 幸 田 起 英 ， 足 立 正 徳 ． 炭 酸 含 有 ア パ タ イ ト の 焼 成 ． 歯 材 器 ． 1 9 9 5 ； 1 4 ： 3 1 3 - 3 2 0 ． 2 0 ） G o s p o d a r o w i c z D . L o c a l i z a t i o n o f a f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r a n d i t s e f f e c t a l o n e a n d w i t h h y d r o c o r t i s o n e o n 3 T 3 c e l l g r o w t h . N a t u r e ． 1 9 7 4 ; 2 4 9 : 1 2 3 - 1 2 7 .
31 2 1 ） I n u i K , M a e d a M , S a n o A , F u j i o k a K , Y u t a n i Y , S a k a w a A , Y a m a n o Y , K a t o Y , K o i k e T . L o c a l a p p l i c a t i o n o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r m i n i p e l l e t i n d u c e t h e h e a l i n g o f s e g m e n t a l b o n y d e f e c t s i n r a b b i t . C a l i f T i s s u e I n t . 1 9 9 8 ; 6 3 : 4 9 0 - 4 9 5 . 2 2 ） B r i a n K H . B o n e s a n d c a r t i l a g e . i l l u t r a t e d e d i t i o n . A m s t e r d a m : E l s e v i e r A c a d e m i c P r e s s . 2 0 0 5 ; 1 9 7 - 2 1 3 . 2 3 ） 幸 田 起 英 ， 土 井 豊 ， 志 水 雄 一 郎 ， 若 松 宣 一 ， 足 立 正 徳 ， 後 藤 隆 康 ， 亀 水 秀 男 ， 森 脇 豊 ． 炭 酸 含 有 ア パ タ イ ト の 焼 成 ‐ 弱 酸 中 で の 焼 成 体 の 溶 解 挙 動 - ． 歯 材 器 ． 1 9 9 7 ； 1 6 : 1 0 7 - 1 1 3 ． 2 4 ） S a k a g u c h i Y , S e k i y a I , Y a g i s h i t a K a n d M u n e t a T . C o m p a r i s o n o f h u m a n s t e m c e l l s d e r i v e d f r o m v a r i o u s m e s e n c h y m a l t i s s u e s . A m e r i c a n C o l l a g e o f R h e u m a t o l o g y ． 2 0 0 5 ; 5 2 : 2 5 2 1 - 2 5 2 9 . 2 5 ） 山 田 志 津 香 ， 林 善 彦 ． 骨 芽 細 胞 分 化 と 骨 形 成 に 関 す る 転 写 因 子 と シ グ ナ ル 伝 達 機 構 ． 生 体 医 工 学 ． 2 0 0 6 ； 4 4 ： 4 9 0 - 4 9 5 . 2 6 ） 松 本 俊 夫 ． 骨 ・ 軟 骨 代 謝 と 注 目 の 骨 疾 患 ． １ 版 ， 東 京 ． 羊 土 社 ； 2 0 0 2 ： 4 2 - 4 7 ． 2 7 ） 小 守 壽 文 ， 福 本 誠 二 編 ， 転 写 因 子 に よ る 骨 芽 細 胞 分 化 抑 制 と 骨 の 成 熟 ． R u n x 2 は 骨 形 成 に お い て オ
32 ー ル マ イ テ ィ な 因 子 か ？ 1 版 ． 東 京 ： 医 歯 薬 出 版 ; 2 0 0 8 : 5 3 - 5 6 . 2 8 ） L i u W . T o y o s a w a S , F u r u i c h i T , K a n a t a n i N , Y o s h i d a C , L i u Y , H i m e n o M , N a r a i S , Y a m a g u c h i A a n d K o m o r i T . O v e r e x p r e s s i o n o f C b f a 1 i n o s t e o b l a s t s i n h i b i t s o s t e o b l a s t m a t u r a t i o n a n d c a u s e s o s t e o p e n i a w i t h m u l t i p l e f r a c t u r e s . J C e l l B i o l . 2 0 0 1 ; 1 5 5 : 1 5 7 - 1 6 6 . 2 9 ） Y o s h i d a C A , F u r u i c h i T , F u j i t a T , F u k u y a m a R , K a n a t a n i N , K o b a y a s h i S , S a t a k e M , T a k a d a K a n d K o m o r i T . C o r e - b i n d i n g f a c t o r β i n t e r a c t s w i t h R u n x 2 a n d i s r e q u i r e d f o r s k e l e t a l d e v e l o p m e n t . N a t u r e G e n e t . 2 0 0 2 ; 3 2 : 6 3 3 - 6 3 8 . 3 0 ） N a k a s h i m a K , Z h o u X , K u n k e l G , Z h a n g Z , D e n g J M , B e h r i n g e r R R a n d C r o m b r u g g h e B . T h e n o v e l z i n c f i n g e r - c o n t a i n i n g t r a n s c r i p t i o n f a c t o r o s t e r i x i s r e q u i r e d f o r o s t e o b l a s t s d i f f e r e n t i a t i o n a n d b o n e f o r m a t i o n .C e l l . 2 0 0 2 ; 1 0 8 : 1 7 - 2 9 . 3 1 ） G e o r g e A , S a b s a y B , P h i l i p A L S a n d V e i s A . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l d e n t i n m a t r i x a c i d i c p h o s p h o p r o t e i n . B i o l C h e m ． 1 9 9 3 ; 2 6 8 : 1 2 6 2 4 - 1 2 6 3 0 . 3 2 ) T o y o s a w a S , O y a K , S a t o S a n d I s h i d a K . O s t e o c y t e
33 a n d D M P 1 . C l i n c a l C a l c i u m ． 2 0 1 2 ； 2 2 ： 7 1 3 - 7 2 0 ． 3 3 ） T o y o s a w a S , S h i n t a n i S , F u j i w a r a T , O o s h i m a T , S a t o A , I j u h i n N a n d K o m o r i T . D e n t i n m a t r i x p r o t e i n 1 i s p r e d o m i n a n t l y e x p r e s s e d i n c h i c k e n a n d r a t o s t e o c y t e s b u t n o t i n o s t e o b l a s t s . J B o n e M i n e r R e s . 2 0 0 1 ; 1 6 : 2 0 1 7 - 2 0 2 6 . 3 4 ） N a r a y a n a n K , S r i n i v a s R , R a m a c h a n d r a n A , H a o J , Q u i n n B a n d G e o r g e A . D i f f e r e n t i a t i o n o f e m b r y o n i c m e s e n c h y m a l c e l l s t o o d o n t o b l a s t - l i k e c e l l s b y o v e r e x p r e s s i o n o f d e n t i n m a t r i x p r o t e i n 1 . P r o c N a t l A c a d S c i U S A ． 2 0 0 1 ; 9 8 : 4 5 1 6 - 4 5 2 1 .
