研究科分 麻布大学雑誌 第17・18巻・2008年
細菌抗原に対する免疫担当細胞の機能解析
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池田輝雄
麻布大学獣医免疫学研究室
Teruo IKEDA
Laboratory of Veterinarian Immunology， Azabu University
（背景と目的）
近年，自然免疫および適応免疫におけるマスト細 胞の機能が注目されている。我々はマスト細胞の免 疫担当細胞としての機能に注目し感染局所において は，マスト細胞の増殖因子として知られるIL−9がマ ウス骨髄由来培養マスト細胞（BMMC）に対して LPS刺激によりIL−9 mRNAの発現を強く誘導するこ
とを見出した。また，IL−9はBMMCの細胞増殖を単 独では誘導しないが，IL−3およびSCFとの共培養で 相加的に促進させることを示し，LPS存在下でのIL−
9産生によるマスト細胞のオートクライン増殖の可 能性を示唆し，グラム陰性菌感染局所でのマスト細 胞の役割を考察した。そこで今年度は，LPS刺激に よるBMMCからのIL−9の産生をELISAを用いてタ ンパクレベルで検討し，IL−9産生によるオートクラ インの検証を試みた。
（材料と方法）
マスト細胞の培養
マスト細胞はBALB／cマウスから調整した骨髄由 来培養マスト細胞bone marrow drived mast cells
（BMMCs）を用いた。
LPSでの刺激
α・mediumにIL−3（2 ng／ml）とSCF（10 ng／ml）を
添加した培地にBMMCs lx106個月mlを100μ1プレー トにまき，E∫c11εrfc1加col∫B4：0H1由来のLPS
（Sigma）でそれぞれ実験により時間（12h24 h 48 h），
濃度（10ng／ml 100 ng／ml lOOO ng／ml）を変化させ刺 激した。
サイトカインの定量
刺激したサンプルの上清をサンドイッチELISA法 を用いて測定した。本法は下記に示した。
リアルタイムPCR
マスト細胞からのTotal RNAの調整は， ISOGEN
（ニッポンジーン）を使用した。cDNAの合成は
SUPERSCRIPT H RT（lnvitrogen）を用いた。
サイトカインのmRNA発現レベルは， Applied
Biosystems 7300 real．time pCR systemを用いて，
TaqManアッセイおよびSYBR Greenアッセイで測定 した。サイトカインのRNA発現はGAPDHに対する RNA発現値として示した。
サンドイッチELISAによるIL−9の定量
IL−9を測定するためにサンドイッチELISA法を用 いた。方法はU字マイクロプレート（greiner社製）
細菌抗原に対する免疫担当細胞の機能解析 113
にCapture抗体（PEPROTECH社の500−P5g）を
Coating Buffer pH95（BD社）で1mg／mlに調整し，
100ml／wellずつ入れ，4℃でovernightして固相化し た。PBS−tween−20で洗浄後，1％BSAのPBSで1時 間室温でブロッキングし，洗浄後，スタンダードあ るいはサンプルを100μ1／well入れ，3時間室温で反 応させる。洗浄後，Detection抗体（PEPROTECH社
の500−P59Bt）0，5 mg／mlを100μ1／well入れ，2時間室 温で反応させて，洗浄後，streptavidinで30分感作し，
洗浄後，アビジンービオチン液を加え，吸光度405nm で測定した。検量線からサンプルの濃度を検出した。
結 果
1．LPS刺激により誘導されるマスト細胞IL−9mRNA およびIL−9レセプターmRNA
マスト細胞でのIL−9mRNA発現はLPSでの刺激に よって増加した。この発現はLPS濃度依存的に増加 し，刺激後4時間でピークを示した。一方，IL−gレ セプターのmRNAの発現でのLPS濃度依存性は認め
られなかったが，恒常的に強い発現を示していた。
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3．LPS刺激による経時的なIL−9産生の変化
LPS刺激によりBMMCからのIL−9産生が見られた ことから，次にLPS刺激によるIL−9産生の経時的変 化を調べた。その結果，少なくとも48時間までは時 間経過にしたがってIL−9の産生量が増加しているこ とが見られたことから，LPSによるBMMCからの IL−9産生は一過性のものではなく比較的長期にわた
って，継続することが示唆された。
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2．LPS濃度依存的に誘導されるマスト細胞IL−9 LPS刺激によりBMMCは1レ9 mRNAを強く発現 することから，次にタンパクレベルでの1レ9分泌定 量を検討した。すると，LPS刺激に対しBMMCが
IL−9の産生が見られ，それはLPS濃度100 ng／ml以上 で濃度依存的にIL−9産生量の増加が見られた。この ことからBMMCはmRNA発現を伴ってIL−9を産生 することから，オートクラインによる増殖が可能で あることが強く示唆された。
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4．LPSおよびサイトカイン共刺激によるIL−9産生 能への影響
LPS刺激によりBMMCは濃度及び時間依存的に IL−9産生を増加することがわかったので，次にマス ト細胞の増殖に必須であるIL−3及びSCFがIL−9産生 に及ぼす影響を検討した。IL−3とLPSの共刺激によ りIL−9の産生量は増加した。 SCFとLPSの共刺激に よるIL−9産生への影響は認められなかった。この結 果から，LPS刺激でのBMMCから産生されるIL−9に よるオートクライン誘導マスト細胞増殖にはIL−3の 存在が必須であることが示唆された。
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まとめ
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・BMMCにおいてLPS刺激で， mRNAレベルでの
IL−9が発現していることがわかった。
・BMMCにおいてLPS刺激で，タンパクレベルで の1レ9が発現していることがわかった。
．BMMCにおいてIL−9はmRNAレベルでもタンパ クレベルでもLPS濃度依存的に発現していることが
わかった。
・BMMCにおいてIL−9の産生にはIL−3が必須であ ることがわかった。
（考察）
前回の成績から推察されたようにBMMCはグラム 陰性菌由来LPS刺激に対して， IL−gをmRNAレベル でもタンパクレベルでも産生することから，IL−gは マスト細胞のグラム陰性菌感染の免疫応答に強く関 与していると考えられる。現在，より詳細なIL−9産 生機序とin vivoでこの免疫応答を証明するための W／wvでの実験を検討中である。
