薬物代謝に関与する

博 士 （ 薬 学 ） 橋 爪 孝 典 学 位 論 文 題 名

     薬物代謝に関与する

新 規 ヒ ト 小 腸 チ ト ク ロ ー ム P 450 の 研 究 一抗ヒスタミン薬エノヾスチンをプロープ薬として―

学位論文内容の要旨

は じめに

  チ ト ク ロ ー ムP450 (P450)は ， 医 薬 品な ど の 代 謝 に 重 要な 役 割 捌 塑 っ て い る酵 素 で あ る ． 特 に， 肝 臓 に は P450が 最 も 多 く 存 藍 す るこ と か ら ， 肝 臓 が薬 物 代 謝 の 主 た る場 と 考 え ら れ て きた ．しかLぬが ら， 近年， 薬物 代 謝 に 小 腸 に 存 在 す るP450が 関 与 し ， 医 薬 品 の 体 内 動 態 に 影 響 を 与 え ， 薬 効 の 増 強 や 減 弱 ， 副 作 用 の 発 現 な ど を 引 き 起 こ す 例 が 報 告 さ れ て き た ． ヒト 小 腸 に 存 荏 す るP450の うち ， 臨 床 で 薬 物 代 謝へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る 分 子 種 はCYP3A4の み で あ り ， 体 内 動 態 に お け る 小 腸P450の 役 割 に 関 す る 知 見 は 極 め て 少ない ．

  抗 ヒ ス タ ミ ン 知 く ス チ ン の 代 謝 に は ， 不活 性 代 謝 物 を 生 成す る 脱 ア ル キ ル イヒ と 薬 理 活 性 本 体 カレ バ ス チ ン に 至 る 代 謝 中 聞 体 を 生 成 す る 水 酸 化 の2経 路 が 知 ら れ て い る， ラ ッ ト に 経 口 投与 さ れ た エ パ ス チ ンは 主 に/J鳰昜 で 代 翁 搭れ ′カ レバス チン に変換 され ること ，ま た，経 口投 与後の 動物 および ヒト 血漿中 には エバス チ ン は ほ と んど 認 め ら れ ず ， 主 代謝 物 と し て カ レ バス チ ン が存 在する こと より， エバ スチン は， 動物種 にか か わ らず， 主に ノJ.Jjjでfも射 を受 けるも のと 推察さ れる．また，著者らはヒト舸ミクロゾームを用いた由vitro実験 で ，CYP3A4以 外 の 未 知P450が エ バ ス チ ン 水 酸 化 に 関 与 し て い る こ と を 証 明 し た． し た が っ て ， エパ ス チ ン は′J岨Fでも 未知 のP450で 代謝さ れる 可能性 が高 いと推 察さ れる．

  本 研 究 は ， エ バ ス チ ン を プ ロ ー ブ 薬 と して ， ヒ ト 小 腸 に おい て 薬 物 代 謝 に 関与 す るP450を 明 ら か に す る こ とを目 的と した．

1． ヒ ト ′Jヽ 腸 ミ ク ロ ゾー ム に よ る エ バ スチ ン の 代 謝

  エバ ス チ ン は ヒ ト ル 燃ク ロ ゾ ー ム に よ り代 議 搭 れ ， 脱 アル キル イ匕体 およ び水酸 化体 が生成 した ．その 代謝 酵 素 を 同 定 す る た め ， ヒ トP450． 発 現 系 に よ る 代 翁 屯P450阻 害 剤 に よ る 阻 害 およ び 抗P450抗 体 に よ る 阻 害 を 調 べ た ． 12種 のP450発 現 系(CYPIA1，1A2，2A6，286，2C8，2C9，2C18，2C19，2D6，2E1，3A4， 4AIDを 用 い て エ ′ く ス チ ン の 代 謝を 調 べ た 結 果 ， 両活 性 はCYP3A4の み に 存 荏し た ， し か し ， ヒト 小 腸 ミ ク ロ ゾ ー ム に お け る 脱 ア ル キ ル 化 は ケ ト コ ナ ゾ ー ル や 抗CYP3A抗 体 に よ り 完 全 に 阻 害 さ れ た の に 対 し ， 水 酸f匕 は 検 〓 寸 し た す べて のP450阻き ． 剤 お よ び 抗P450抗 体 によ っ て 影 響 を 受 け なか っ た ． し た が って ， エ バ ス チ ンの 水 酸 化 は 今 回 検 討し た 以 外 のP450に よ り 触 鸚は れ る こ と が 判 明 し， ヒ ト 小 腸 ミ ク ロゾ ー ムに は薬 物 代 謝 に関 与 す る 未 知 のP450が 存i至 尹 る こ とが 示 唆 さ れ た ．

2． ニCJく ス チ ン の 水醐 匕 を 角 蝶 す る サノ レ ノ 亅 丶 腸P450の 精 製

  ヒ ト 小 腸 にお い て エ バ ス チ ン の水 酸 化 に 関 わ る 酵素 に 関 す る 情 報 を得 る た め に ，P450の アミノ 酸配 列がヒ

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ト に 最 も近 い サ ル の 小 腸 か らエ バ ス チ ン 水 酸 化を 触 媒 す る 酵素 を精製 し， アミノ 酸配 列を調 べた ．その 結果 ， 2種 のP450 (P450M卜2，P450Mト3冫 が 得 ら れ ， そ の 活 性 はP450M卜2がP450MI―3に 比 ベ 顕 著 に 高 か っ た ． ア ミ ノ 酸 配 列 を 検 索 し た 結 果 ，P4501Vfl‑2はCYP4F，P450MIー3はCYP3Aに属 す る こ と が 判 明 した ． さ ら に ， サ ル 小 腸 の エ バ ス チ ン 水 酸 化 酵 素 活 性 は ， 抗CYP4F抗 体 に よ り 阻 害 さ れ た （ 約70％ ） が ， 抗 CYP3A抗 体 に よ る 阻 害 は 認 め ら れ な か っ た ． し た が っ て ，CYP4Fが サ ル 小 腸 に おい て 主 と し て エ バス チ ン 水 酸 化 を 触 媒 す る 酵 素で あ る こ と が 明 らか と な り ，CYP4Fが は じ め て 薬 物 代謝 に 関 与 す る こ と が判 明 し た ，

3． ヒ ト 小 腸 で の エ パス チ ン 水 酸 化 に おけ るCYP4Fの 役 割

  CYP4Fは 肝 臓 や 自 血 球 に 存 在 し ， ロ イ コ ト リ エ ンB4や ア ラ キ ド ン 酸 の 甜 一 水 酸 化酵 素 と し て 知 ら れる が ， ヒ ト 小 腸 で の 存 在 や 薬 物 代 謝 へ の 寄 与は 不 明 で あ る ． そこ で ， ヒ ト 小 腸 で のCYP4Fの 存 在 を 調べ ， 次 に ヒ ト 小 腸 で の エ バ ス チ ン 水 酸 化 に お け るCYP4：Fの 寄 与 を 検 討 し た ， サ ルP450MI−2と 最 も ア ミ ノ酸 配 列 の 相 同 性 が 高 い ヒ トCYP4F2の 遺 伝 子 配 列 を 基 に フpラ イ マ ー を 作 製 し ， ヒ ト 小 腸cDNAラ イ ブ ラ リ ー か らPCRを 行 つ た と こ ろ ，CYP4F2と と も に 新 規CYP4F (CYP4F12)の 存 荏 が 明 ら か と な っ た， そ れ ぞ れ を 酵 母内 に 発 現 さ せ ， エ バ ス チ ン 水 酸 化 酵 素 活 性 を 測 定 し た結 果 ，CYP4F12が エ バ ス チ ン 水酸 化 を 触 媒 す る こ とが 判 明 し た ． 一 方，

CYP4F2に は ほ と ん ど 活 性 は 認 め ら れ な か っ た ． ま た ， 抗CYP4F抗 体 お よ び17−ODYAに よ ル ヒ ト 小 腸 ミ ク ロ ゾ ー ム に よる エ バ ス チ ン 水 酸化 は 阻 害 さ れ た ． しか し ， そ の 阻 害 の程 度はと もに 小さく （約20%)，ヒ トと サル で エ バ ス チ ン 水 酸 化 に お け るC丶tP4Fの 寄 与 に 種 差 が 認め ら れ た ， し た がっ て ， ヒ ト 小 腸 に おけ る エ バ ス チ ン 水 酸 化 に は ，別 の 代 謝 酵 素 が 主に 関 与 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た ．

4． ヒト 小 腸 に お い て エ バス チ ン の 水 酸 化 に関 与 す る 主 代 謝 酵素 の 同 定

  ロ イ コ ト リ エ ンB4や ア ラ キ ド ン 酸 は ，CYP4F以 外 のP450の 基 質 にも な る ． そ こ で ，そ れ ら の ヒ ト 小 腸 ミク ロ ゾ ー ム に よ る エ バス チ ン 水 酸 化 に 及ぽ す 影 響 を 調 べ た 結果 ， 水 酸 化 は ア ラキ ド ン 酸 に よ っ ての み 強 く 阻害 され た ． そ こ で こ れ ま で に 検 討1たP450以 外 で ， 小 腸 に 存 在 し ， ア ラ キ ド ン 酸 代 謝 に 関 与 す る(:YP2J2に 着目 し た ．CYP2J2を 酵 母 内 に 発 現 さ せ ， エ バ スチ ン 水 酸 化 酵 素 活 性を 測 定 し た と こ ろ， 極 め て 高 い 活 性が 認 め ら れ た ． さ ら に 抗c丶Y P2J抗 体 は ， ヒ ト 小 腸 ミク ロ ゾ ー ム の エ バス チン 水酸化 酵素 活性を 強く 阻害し た（ 約70め ．し た が っ て ，CYP2J2は ヒ ト 小 腸 ミ ク ロ ゾ ー ム に お け る エ バ ス チ ン 水 酸 化の 主 代 謝 酵 素 と 考 えら れ ，CYP2Jが 薬 物 代 謝 に 関 与 す るこ と を は じ め て 見出 し た ．

  以 上 ， ヒ ト 小 腸 で 薬 物 代 謝 に 関 与 す る 重 要 な 酵 素 と し てCYP2Jお よ びCYP4Fを 見 出 し た ． 本 研 究 で 得 ら れ た 知 見 は ， ヒ ト 小 腸 に お い てCYP3A4以 外 のP450が 薬 物 代 謝 に 深 く 関 与 す る こ と を 示 唆 する 結 果 で あ り ， ヒ ト 小 腸 の 薬 物 代 謝 研 究 の み な ら ず ， 相 互 作 用 な ど の 薬 物動 態 研 究 の 発 展 にも 貢 献 す る も の と考 え ら れ る ．

ま と め

  抗ヒ ス タ ミ ン 薬 エ バス チ ン を プ ロ ー ブ薬 と し て ， ヒ ト 小 腸に お い て 薬 物 代 翁卦 こ 関 与 す るP450に つ いて検 討 し ， 以 下の 知 見 を 得 た ，

1． ニc/馭 チンは ヒト ノJ嶋ミ クロ ゾームにより脱アノレキ丿レイ匕と水醐匕の2経路で憫擦れ，脱アノレキノレイ匕は，

    CYP3A4によ り触 撚れる こと が明ら かと なった ，

2． サ ル 小 腸 に お い て エ バ ス チ ン の 水 酸 化 を 触 媒 す る 主 代 謝 酵 素 は ，CYP4Fで あ る こ と が 判 明 し （ 寄 与 率     約70%)， はじめ てCYP4Fの薬物 代謝 への関 与が 明らか とな った，

3．  ヒ ト 小 腸 に も 新 規CYP4F (CYP4F12)が 存 臣 し ， 薬 物 代 謝 酵 素 と し て ，エ バ ス チ ン の 水 酸化 を 触 媒 す る     こ と が は じ め て 明 ら かと な っ た （ 約209'o)．ま た ， そ の 寄 与 は サルCYP4Fに 比 べ て小 さ く ， ヒ ト と サル で     種 差が 存在し た．

4． さ ら に ， ヒ ト 小 腸 に お い て 主 と し て エ バ ス チ ン 水 酸 化 を触 媒 す る 代 謝 酵 素に つ い て 検 討 し た結 果 ， 小 腸

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に存在し，アラキドン酸代謝に関与する

が主代謝酵素であることが判明し（約70,0 ，CYP2J が薬物代謝に関与することがはじめて明らかとなった，

以上，ヒト小腸で薬物代謝に関与する重要な酵素として，CYP2J およびCYP4F を見出した

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学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

     薬物代謝に関与する

新 規 ヒ ト 小 腸 チ ト ク ロ ー ム P 450 の 研 究

―抗ヒスタミン薬エバスチンをプローブ薬として―

   近 年、ヒ ト小腸 に存在するチトクロームP450 (P450) が薬物代謝に関与し、医薬品などの体内 動態を変化させ、薬効や副作用の発現に影響を与えることが明らかとなってきた。しかしながら、

臨 床 で 薬 物 代 謝 へ の 関 与 が 報 告 さ れ て い る 小 腸 P450 は CYP3A4 のみ で あ り 、小 腸 P450 に 関する知見は極めて少ない。本研究では、抗ヒスタミン薬エバスチンをプローブ薬として、ヒト小腸 に おいて薬 物代謝 に関与 する新 規のP450 を 発見し た。本 研究は ヒト小 腸の薬 物代謝 、ひい て はヒトにおける薬効や副作用の予測に関して有用な概念を提供するものであり、以下に詳述する ように極めて優れた研究成果であると評価される。

（1 ）ヒト小腸ミクロゾームによるエパスチンの代謝

   エバスチンがヒト小腸ミクロゾームによって代謝されるか否かを調べ、さらにその代謝酵素につ いて検討した。その結果、エバスチンはヒト小腸ミクロゾームにより脱アルキ少化と水酸化を受け、

前 者 はCYP3A4 に よ り触 媒 さ れ るが 、 後 者 は薬 物 代謝に 関与する P450 (CYPIA1 ， 1A2 ，2A6 ユ 286 ，2C8 ，2C9 ，2C18 ， 2C19 ，2D6 ， 2E1 ，3A4 ， 4AIl) とは別 のP450 により触媒されることが明 かと なった 。した がって、 ヒト小 腸に、 エパスチンの水酸化を触媒する未知のP450 が存在する とが示唆された。

(2) エバスチンの水酸化を触媒するサル小腸P450 の精製

   ヒト小腸においてエバスチンの水酸化に関わる酵素に関する情報を得るために、P450 のアミノ

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也

吉

之

史

哲 秀

浩 浩

滝 島

谷 崎

鎌 原

紙 山

授 授

授 授

教 教

教 教

助 助

査 査

査 査

主 副

副 副

酸配列がヒ トに最も近いサルを用いて、その小腸からエバスチン水酸化を触媒する酵素を精製し、

アミノ′酸 配列を調べた。その結果、2 種のP450 (P450MI‑2 ，P450MI‑3) が得られ、その触媒活性 は P450M ト 2 が P450M ト 3 に 比 べ 顕 著 に 高 か っ た 。 ア ミ ノ 酸 配 列 の 解 析 結 果 よ り 、 P450M ト 2 はCYP4F 、P450MI‑3 はCYP3A に属すること が判明した。さらに、サノレ′J ヽ腸のエノ℃くチン水酸 化 酵 素 活 性 は 、 抗 CYP4F 抗 体 に よ り 約 70% 阻 害 さ れ た が 、 抗 CYP3A 抗 体 に よ る 阻 害 は 認 め られなかっ た。したがって、CYP4F がサ ル小腸において主としてエバ スチン水酸化を触媒する酵 素 で あ る こ と が 明 ら か と な り 、 CYP4F が は じ め て 薬 物 代 謝 に 関 与 す る こ と が 判 明 し た 。

(3) ヒト小腸でのエバス チン水酸化におけるCYP4F の 役割

  CYP4F ぬ肝 臓や 白血 球に存在し、ロイコト リエンB4 やアラキドン酸の 0)‑7 酸化酵素として知 られるが、ヒト小腸での 存在や薬物代謝への関与は不明であった。そこで、ヒト小腸cDNA ライブ ラリ ーか らCYP4F 遺伝 子 を検 索し 、小 腸で の 存在 の有 無を 調 べた とこ ろ、CYP4F2 および新規 の CYP4F 遺 伝 子 (CYP4F12) を 見 っ け た 。 酵 母 内 に 発 現 させ 、エ バス チ ン水 酸化 酵素 活性 を 測定した結果、CYP4F12 のみに明らかな触媒活性が認められた。また、ヒ卜小腸ミクロゾームによ るエ パス チン 水 酸化 は抗 CYP4F 抗 体お よぴ 17 −ODYA に より 阻 害さ れた 。しかし、その阻害の 程度 はと もに 小 さく （約20%) 、ヒ卜とサル でエバスチン水酸化における CYP4F の寄与に種差が 認められた。したがって 、ヒ卜小腸におけるエパス チン水酸化には、主としてCYP4F 以外の酵素 が関与していることが示 唆された。

(4) ヒ ト 小 腸 に お い て エ バ ス チ ン の 水 酸 化 に 関 与 す る 主 代 謝 酵 素 の 同 定    ロイコ卜リエンB4 や アラキドン酸は、CYP4F 以外 のP450 の基質にもなる。それらのヒ卜小腸ミ クロゾームによるエバ スチン水酸化におよばす影響を調べた結果、水酸化はアラキドン酸によっ てのみ強く阻害された 。そこでこれまでに検討したP450 以外で、小腸に存在し、アラキドン酸代 謝に 関与 す るCYP2J2 に着 目し た 。CYP2J2 を酵 母内 に 発現 させ 、エ バ スチ ン水 酸化 酵素 活性 を測定したところ、極めて高い活性が認められた。さらに抗CYP2J 抗体は、ヒ卜小腸ミクロゾーム のエパスチン水酸化酵 素活性を強く阻害した（約70%) 。したがって、CYP2J2 はヒト小腸ミクロゾ ーム にお け るエ バスチン水酸化の主代謝 酵素と考えられ、CYP2J が薬 物代謝に関与することを はじめて見出した。

   以 上 、 ヒ 卜 小腸 で薬 物 代謝 に関 与す る 重要 な酵 素と して CYP2J お よ びCYP4F を 発 見し た。

本 研究 で 得ら れた 知見 は、 ヒ ト小 腸に おい てCYP3A4 以 外の P4 50 が 薬物 代謝 に関与するこ と を示唆 する結果であり、ヒト小腸の薬物代謝に関して新しい重要な概念を提案した。本論文『薬物 代 謝に関 与する新規ヒ卜小腸チトク ロームP450 の研究ー抗ヒスタ ミン薬エパスチンをプロー ブ 薬とし て―』に含まれる研究成果は薬学における基礎および応用のいずれにおいても優れており、

博士（ 薬学）の学位を受けるに充分 値するものと認めた。

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