博士（水産学）池内俊貴 学位論文題名
Immunohistochemical studies on gonadotroplnS andthyrotropininSOmeteleOStflSheS ． （数種の硬骨魚類の生殖腺刺激ホルモンおよび甲状腺 刺 激 ホ ル モ ン に 関 す る 免 疫 組 織 化 学 的 研 究 ）
学 位 論 文 内 容 の 要旨
魚類においても他の脊椎動物同様、生殖腺の発達は、脳下垂体から分泌される 生殖腺刺激ホルモン(GTH)によって調節されている。現在、水産増養殖におい て対象魚の繁殖を制御する目的で、魚類の脳下垂体や哺乳類のGTHの投与が広 く行われている。様々な成熟段階にある対象魚へのGTH処理技術を確立するた めに は、 魚類 にお けるGTHの機能の解明が必要である。魚類では、GTHIおよ びGTH IIと名 付け られた2種類のGTHの存 在が 、サ ケ科魚類をはじめ、数種 の硬骨魚で報告されている。しかし、多くの哺乳類でのGTHである濾胞刺激ホ ルモ ンお よび 黄体 形成ホ ルモ ンに 比ベ、GTHIおよ びGTH IIの機能について の研究は少ない。さらに、実際にGTH投与により催熟を行っているニホンウナ ギ(Anguilla japonica)では、卵黄形成は比較的容易に進行するものの卵成熟は 進行し難く、個体間の差も大きいとぃった問題点が指摘されている。これらの問 題点を解決するためには脳下垂体でのGTHの合成の動態を把握し、投与魚自身 のGTHを最大限に利用することが非常に有効であると考えられる。そこで、本 研究では、日本の水産業において重要な位置を占める魚種の中から、自発的に生 殖腺の発達が進行する魚種としてサクラマス(Oncorhynchus masou)を、また、
ホルモン処理が必要な魚種としてニホンウナギを主な材料として選び、脳下垂体 中のGTHの変化を免疫組織化学的に解析した。
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最 初 に 、 解 析 に 必 要 な 特 異 抗 体 の 作 製 を 試 み た 。GTHIお よ びGTH IIに 加 え て 、 甲 状 腺 刺 激 ホ ル モ ン(TSH)は 、 共 通 のQサ ブ ユ ニ ッ ト と ホ ル モ ン 特 異 的 なBサブ ユ ニ ッ ト か ら な り 、 構 造 上 多 く の 類 似点 が存 在す るた め、 その 精製 が 困難 であ り、抗 体は 互い に交 差す ることが予想される。また、ニホンウナギで はGTH含量 が 低 い た め 、 抗 体 作 製 に 必 要 な 量 の 精製 夕ン バク を得 るこ とが 困難 で ある 。従 って、 従来 の方 法で は特 異的な抗体の作製は非常に困難であると考え ら れ る 。 そ こ で 、 配 列 が 不 明 な ニ ホン ウ ナ ギGTHIpを除 き、 ニホ ンウ ナギ およ び サク ラマ スの各 サブ ユニ ット につ いて特異的なアミノ酸配列に相当するべプチ ド を合 成し 、それ を抗 原と した 。作 製した抗体はウェスタンブロット解析および 免 疫 組 織 化 学 的 解 析 に よ り 、 高 い 特 異 性 を 有 す る こ と を 確 認 し た 。 次に、得られた抗体を用いて、サクラマス脳下垂体中における各免疫陽´陸細胞 に つい て画 像解析 を行 い、 一細 胞当 たりの断面積、一切片当たりの細胞数および 脳 下 垂 体 中 に 占 め る 体 積 パ ー セ ン ト を 算 出 し た 。 そ の 結 果 、GTHIBお よ び GTH iip免 疫 陽 性 細 胞 は と も に 生 殖 腺 の 発 達 ま たは 加齢 によ り一 細胞 当た りの 断 面積 およ び一切 片当 たり の細 胞数 の増 加が 認め られ た。 一方 、TSH[3免疫陽性 細胞では増加が見られたのは一細胞当たりの断面積のみであった。このことから、
GTHIお よ びGTHu産 生 細 胞 は 成 熟 に 伴 っ て 肥 大 お よ び 増 数 す る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、TSH産 生 細 胞 は 成 熟 に 伴 っ て 肥 大 す るも のの 増数 はし ない こと が示 唆された。
さ ら に 、 ウ ナ ギ のGTHI産 生 細 胞 を 検 索 す る た め に 、GTH iif3、TSH[3お よ びGTH/TSHaに 対 す る 抗 体 を 用 い 、 天然 で 採 捕 さ れ た 下 ル ニ ホ ン ウ ナ ギ （ 卵 黄 形成初期）およぴ下ルニュージーランドウナギ(A. dieffenbachii；卵黄形成中期）
について、免疫二重染色を行い、各免疫陽性細胞の形態計測を行った。その結果、
ウ ナ ギ の 脳 下 垂 体 主 葉 基 部 に 抗GTH II(3抗 体 お よ び抗TSH[3抗体 で染 色さ れな いGTH/TSHa免 疫 陽 ´f弼 弸 包 （fQ十 細 胞 ） が 観 察さ れた 。こ れら の細 胞は 、卵 黄 形成 の進 行した 群ほ ど面 積、 数お よび体積パーセントにおいて有意に高値を示 ―995−
した 。同 様に シロ サケの 脳下 垂体 におい ては 、pa十細 胞は抗GTHIp免疫陽性 細胞と一致したことから、天然で成熟しているウナギのpI一a十細胞はGTHI産 生細 胞と 考え られ た。一 方、GTH IIt3免 疫陽 性細 胞お よびTSH[3免疫陽性細 胞については生殖腺の発達した群ほど面積、数共に有意に高値を示したが、体 積バーセントにおいて差違は認められなかった。これらの結果から、ウナギでは 少な くと も卵 黄形 成中期 までは、卵黄形成に伴ってGTHI産生細胞は肥大およ び増 数し 、GTH IIおよびTSH産生 細胞 は肥 大す るが増 数はしないものと推察 された。
次に、シロサケ脳下垂体ホモゲネート(sPH)投与した養殖ニホンウナギにつ いて同様に免疫二重染色による形態計測を行った。その結果、卵径およびGSI の増加に従って、GTH II[3免疫陽性細胞の断面積、数およぴ体積バーセントは 著しく増大した。しかし、これらの計測値は投与回数とは必ずしも比例しなかっ た 。 ま た 、 遅 くと も 投 与5回 目 よ り 脳 下 垂 体主 葉端 部(RPD)にGTH I耶免 疫 陽性 細胞 が出 現す ること が観 察さ れた。 これ らのRPDのGTH IIf3免疫陽性細 胞 も 脳 下 垂 体 主葉 基 部(PPD)の も の と 同 様 の変 化を 示し た。PPDおよ びRPD のGTH II[3免疫陽性細胞について、同程度のGSIの天然魚と比較したところ有 意な違いは見られなかった。卵黄形成後期のサクラマスと比較すると同じステー ジの催熟魚は面積および体積バーセントについて著しく高値を示した。また、
TSHp免疫陽´陸細胞も卵径およびGSIの増加に従って、緩やかに断面積が増大 したが、投与回数とは比例しなかった。細胞数および体積バーセントについては、
大きな変化は見られなかった。同程度のGSIの天然魚と比較したところ、ニュ ージーランドウナギで断面積および数において有意に高値を示したが、体積バー セントにおいては有意な違いは見られなかった。一方、p‑Q十細胞は催熟を通し て断面積に変化は見られなかった。しかし、細胞数および体積パーセントiま sPH投与により有意に減少した。これらの細胞は対照群または、投与によって も生殖腺の発達が見られない個体で、投与前の個体と同様に観察された。この投
与前の個体で観察されたpQ十細胞数は、催熟によって急増したGTH IIt3免疫 陽性細胞数とほぼ同等の値を示した。6一IQ十細胞についても同程度のGSIの天 然魚と比較したところ、ニホンウナギでは有意な差は認められなかったが、ニュ ージーランドウナギで断面積、数および体積パーセントにおいて有意に高値を示 した。これらの観察から、GTH II産生細胞は生殖腺の発達に従って肥大および 増数することが示された。また、TSH産生細胞も生殖腺の発達に伴って肥大す ることが示唆された。催熟前の個体で天然魚よりも多く存在するp一Ia十細胞は、
sPH投与の開始後に急増したGTH II[3免疫陽´陸細胞とほぽ等しいことから、投 与前の 個体で見ら れるp‑Q十 細胞のほと んどはpサブユニ ットの合成が低い GTHu産生細 胞と考えら れた。しか し、pa十細胞の 面積は催熟 によって変化 しないことから、GTHI産生細胞と考えられるp乙Q十細胞も脳下垂体中に存在 し、sPH投与によって増数しないことが示された。このことから、ニホンウナ ギの脳下垂体中では、少なくとも催熟中にはGTHIが非常に微量にしか存在し ないことが示唆された。
以上の結果から、サクラマスおよびニホンウナギにおいて、成熟に伴うGTH I、GTHHおよびTSH産生細胞の 変化がほぼ 明らかとな った。特に 、飼育環境 下 のニ ホ ンウ ナ ギの 脳 下垂体 中にはBサブユぅ ットの合成 が低いGTHn産生 細胞が多数存在し、GTHI産生細胞も少ないことが示された。これらの事実は 本種が飼育下では生殖腺が発達しないことと関連があると推察された。さらに、
脳 下垂 体 投与 に よっ てGTHI産生細 胞は活性化 されず、逆 にGTHII産生 細胞 は過剰に肥大することが明らかとなった。
学位論文審査の要旨
主 査 副 査 副 査 副・査 副 査
教授 教授 教授 助教授 助教授
山 内晧 平 山 崎文 雄 原 彰 彦 上 田 宏 足 立伸 次
学位論文題名
Immunohistochemical studies on gonadotropins and thyrotropininsome teleost fishes ．
（ 数 種 の 硬 骨 魚 類 の 生 殖 腺 刺 激 ホ ル モ ン お よ び 甲 状 腺 刺 激 ホ ル モ ン に 関 す る 免 疫 組 織 化 学 的 研 究 ）
硬 骨 魚 類 に お い て も 他 の 脊 椎 動 物 同 様 、 生 殖 腺 の 発 達 は 、 脳 下 垂 体 か ら 分 泌 さ れ る 生 殖 腺 刺 激 ホ ル モ ン(GTH)に よ っ て 調 節 さ れ て い る 。 現 在 、 水 産 増 養 殖 に お い て 対 象 魚 の 繁 殖 を 制 御 す る 目 的 で 、 魚 類 の 脳 下 垂 体 や 哺 乳 類 のGTHの 投 与 が 広 く 行 わ れ て い る 。 様 々 な 成 熟 段 階 に あ る 対 象 魚 へ のGTH処 理 技 術 を 確 立 す る た め に は 、 魚 類 に お け るGTHの 機 能 の 解 明 が 必 要 で あ る 。 魚 類 で は 、GTHI、 GTH IIと 名 付 け ら れ た2種 類 のGTHの 存 在 が 、 サ ケ 科 魚 類 を は じ め 、 数 種 の 硬 骨 魚 で 報 告 さ れ て い る 。 し か し 、 多 く の 喃 乳 類 で のGTHで あ る 濾 胞 刺 激 ホ ル モ ン お よ び 黄 体 形 成 ホ ル モ ン に 比 ベ 、GTHIお よ びGTH IIの 機 能 に つ い て の 研 究 は 少 な い 。 さ ら に 、 実 際 にGTH投 与 に よ り 催 熟 を 行 っ て い る ニ ホ ン ウ ナ ギ で は 、 卵 黄 形 成 は 比 較 的 容 易 に 進 行 す る も の の 卵 成 熟 は 進 行 し 難 く 、 個 体 間 の 差 も 大 き い と ぃ っ た 問 題 点 が 指 摘 さ れ て い る 。 こ れ ら の 問 題 点 を 解 決 す る た め に は 脳 下 垂 体 で のGTHの 合 成 の 動 態 を 把 握 し 、 投 与 魚 自 身 のGTHを 最 大 限 に 利 用 す る こ と が 非 常 に 有 効 で あ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 日 本 の 水 産 業 に お い て 重 要 な 位 置 を 占 め る 魚 種 の 中 か ら 、 自 発 的 に 生 殖 腺 の 発 達 が 進 行 す る 魚 種 と し て サ ク ラ マ ス を 、 ホ ル モ ン 処 理 が 必 要 な 魚 種 と し て ニ ホ ン ウ ナ ギ を 主 な 材 料 と し て 選 び 、 脳 下 垂 体 中 のGTHの 変 化 を 免 疫 組 織 化 学 的 に 解 析 し た 。 得 ら れ た 結 果 は 以 下 の 通 り で あ る 。
最 初 に 、 作 製 が 非 常 に 困 難 で あ る 特 異 抗 体 を 合 成 ベ プ チ ド を 抗 原 に 用 い る こ と
で、各ホルモンのサブユニットについて得た。作製した抗体はウェスタンブロッ ト解析および免疫組織化学的解析により、高い特異性を有することが確認された゜
次に、得られた抗体を用いて、サクラマス脳下垂体中における各免疫陽性細胞 について画像解析を行い、一細胞当たりの断面積、一切片当たりの細胞数および 脳下垂体中に占める体積パーセントを算出した。その結果、GTHIおよび・GTH II産生細胞は成熟に伴って肥大および増数することが示された。また、TSH産 生細 胞 は 成熟 に 伴っ て 肥大 す るも の の増 数 はし な いこ と が示 唆 さ れた。
さ ら に、 ウ ナギ のGTHI産生 細 胞を 検 索す る ため に 、GTHIIp、TSHpおよ びGTH/TSHQに対する抗体を用い、天然で採捕した下ルニホンウナギおよび叩 ルニュージーランドウナギについて、免疫二重染色を行い、各免疫陽性細胞の形 態計測を 行った。その結果、ウナギの脳下垂体主葉基部にGTHI産生細胞と考 え ら れ る 抗GTHIIp抗 体 お よ ぴ 抗TSHp抗 体 で 染 色 さ れ な いGTH/TSHQ免 疫 陽性細胞（p‐−Q十細胞）が観察された。同様にシロサケの脳下垂体においては、
p‐‐Q十細胞は抗GTHIp免疫陽性細胞と一致したことから、天然で成熟している ウナギのp‐−Q十細胞はGTHI産生細胞と考えられた。また、形態計測の結果よ り、ウナ ギでは少なくとも卵黄形成中期までは、卵黄形成に伴ってGTHI産生 細胞 は 肥 大お よ び増 数 し、GTHnお よぴTSH産生細胞は 肥大するが 増数はし ないものと推察された。
次に、シロサケ脳下垂体ホモゲネート（sPH）投与した養殖ニホンウナギにつ いて同様 に免疫二重染色による形態計測を行った。その結果、GTHn産生細胞 は生殖腺の発達に従って肥大および増数することが示された。また、TSH産生 細胞も生殖腺の発達に伴って肥大することが示唆された。催熟前の個体で天然魚 よりも多 く存在するp‐・a十細胞iま、sPH投与の開始後に急増したGTHIIp免 疫陽性細胞とほぼ等しいことから、投与前の個体で見られるp‐‐a十細胞のほと んど は6サブユニッ トの合成が 低いGTHII産 生細胞と考 えられた。 しかし、
pー―Q十細胞の面積は催熟によって変化しないことから、GTHI産生細胞と考え られる6＿−Q十細胞も脳下垂体中に存在し、GTH投与によって増数しないことが 示された。このことから、ニホンウナギの脳下垂体中では、少なくとも催熱中に はGTHIが非常 に微量にしか存在しないことが示めされた。また、飼育環境下 のニ ホ ン ウナ ギ の脳 下 垂体 中 にはpサプユニ ットの合成 が低いGTHn産生細 胞が多数存在することが示唆され、これらが本種の飼育下で生殖腺の発達が進行 しないこ とと関連があると考えられた。さらに、脳下垂体投与によってGTHI 産生細胞は活性化されず、逆にGTHII産生細胞は過剰に肥大することが明らか となった。
上述のように、本研究では、サクラマスおよぴニホンウナギでの自発的なまた
は、 ホルモン投与による生殖腺の発達に伴う脳下垂体中でのGTHIおよぴGTH IIの変化を明らかにした。これらの結果は、硬骨魚類の生殖腺の発達の制御機 構の解明に重要な基礎的知見を提供したものと高く評価され、本論文が博士（水 産 学 ） の 学 位 請 求 論 文 と し て 相 当 の 業 績 で あ る と 評 定 し た 。
