博士（医学）池田 潤 学位論文題名
膠芽腫化学療法感受性における p 53 癌抑制遺伝子の役割に関する研究
学位論文内容の要旨
【 目 的 】 近 年 、 癌 抑 制 遺 伝 子 の ー っ と し て 知 ら れ て い るp53の 変 異 が 、 膠 芽 腫 を 含 め た 多 く の 腫 瘍 に お い て 確 認 さ れ 、 こ のp53が 化 学 療 法 感 受 性 に 影 響 を 与 え る 可 能 性 が 指 摘 さ れ 注 目 を 集 め て い る 。 し た が っ て 、 抗 癌 剤 感 受 性 に お け るp53変 異 の 意 義 解 明 は 、 抗 腫 瘍 効 果 の 向 上 を 図 る た め に も 必 要 不 可 欠 な 問 題 と 考 え ら れ る 。 こ れ ま で の 検 討 の 多 く は 、p53に よ り 引 き 起 こ さ れ る ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 が 抗 腫 瘍 効 果 に と っ て 重 要 で あ る と し 、p53の 変 異 に よ る 機 能 喪 失 の 結 果 、 化 学 療 法 感 受 性 は 低 下 す る と 指摘 し て いる 。 こ れ と は 逆 に 、 ，p53変 異 に よ っ てp53の 持 つDNA修 復 機 能 が 障 害 さ れ 、 抗 癌 剤 に 対 す る 感 受 性 が 増 す と い う 報 告 や 、p53は 感 受 性 に 関 係 し な い と の 報 告 も あ り 、 抗 癌 剤 感 受 性 へ のp53機 能 の 関 わ り に は 一 定 の 見 解 は な い 。 こ れ は 、 検 討 さ れ た 細 胞 の 種 類 や 薬 剤 、 p53機 能 調 節 法 の 違 い に よ る ば か り で な く 、 た と え 同 一 種 の 細 胞 に お け る 検 討 で あ っ て も 、 複 数 の 細 胞 株 を 用 い て 比 較 検 討 し た 場 合 、 各 々 の 細 胞 株 ご と のp53機 能 を 含 め た 遺 伝 子 の 生 物 学 的 特 徴 の 違 い に よ り 、p53機 能 の 役 割 を 純 粋 に 評 価 す る こ と が で き な い こ とが 原 因 と考 え ら れて い る 。 よっ て 、 本研 究 で は、etoposide、paclitaxel、cisplatin、1・
（4 ‑amino‑ 2‑meth yl‑5 ‑py rimidinyl) methyl‑3‑(2‑chloroe thyl)‑3 ‑nitrosourea hy dro chlo ride (ACNU)の4剤 に つ い て 、 同 一 細 胞 株 に お い て 温 度 を 変 化 さ せ る の み で 、p53以 外 の 遺 伝 子 形 質 を 変 え る こ と な くp53機 能 の み を 変 化 さ せ 得 る 、 温 度 感 受 性 変 異p53膠 芽 腫 細 胞 株 を 用 い て 、p53機 能 変 化 に 伴 う 化 学 療 法 感 受 性 変 化 を 、 と く に 細 胞 周 期 の 変 化 に 注 目し検討した。
【 材 料 お よ び 方 法 】 使 用 し た 細 胞 株 は 、 ヒ 卜 膠 芽 腫 細 胞 株 で あ る‑LN 382、U251MGの2 っ と し た 。 ま ず 、 各 細 胞 株 に 対 す る 温 度 に よ る 影 響 を 以 下 の 項 目 に つ い て 確 認 し た 。 温 度 に つ い て は 基 本 的 に 、370Cと340Cに 設 定 し 比 較 し た 。 （1）p53転 写 活 性 能 を 、 酵 母 を 用 い たp53機 能 ア ッ セ イ に よ り 評 価 し た 。 こ の ア ッ セ イ で は 、 得 ら れ た 酵 母 が 野 生 型 p53を 有 す る 場 合 は 白 色 、 変 異 型p53の 場 合 に は 赤 色 を 呈 す る 。(2) p53に よ り 制 御 さ れ る遺伝子の発現の有無を、multiplex reverse tians criptionーpolymerase chain reactionにより、
G3PDHを コ ン ト 口 ー ル と し て 定 量 的 に 比 較 し た 。 （3）370Cと340Cの 培 養 下 の 細 胞 数 を カ ウ ン ト し そ の 平 均 細 胞 数 を 算 出 し 、370Cに 対 す る340Cの 細 胞 数 の 割 合 を 増 殖 抑 制 率 とし て 求 めた 。(4)細 胞周 期は、bromo deox yuridine‑propidium io dide (BrdU ‑PI)二重染 色 法 を 用 い 、 フ □ ー サ イ ト ヌ 卜 リ ー に て 検 討 し た 。(5) p53蛋 白 量 は 、enzyme‑linked immunosorbent assay (ELISA)法 に て 測 定 し た 。 次 に 、 化 学 療 法 感 受 性 を3‑(4，5・ dimethylthiazol‑2‑yl)‑2，5 ‑diphenyl tetrazolium bromide (MIT)アッセイにて検討した。各薬 剤 の 最 高 投 与 濃 度 は 、etoposideが150yM、paclitaxelが50yM、cisplatinが50yM、ACNU
が2000 yMと し た 。 温 度 に よ ら な いp53機 能 調 節 を 目 的 に 、 野 生 型p53遺 伝 子 を 哺 乳 類 発 現 ベ ク タ ー を 用 い てLN 382細 胞 に 導 入 し た 。 遺 伝 子 導 入 に は 、 リ ポ フ ェ ク 卜 ア ミ ン 法 を 用 い た 。 こ の 遺 伝 子 導 入 に よ り 、 通 常 の 培 養 条 件 下 で は 、 野 生 型p53の 発 現 が 一 緒 に導入したlac repressor geneにより抑制され、is opropyl‑B ‑D‑thiogalactop yran oside (IPTG） を 培 養 液 に 加 え る こ と で 、lac repressor geneを 抑 制 し 導 入 さ れ た 野 生型p53の 発 現 が得 ら れ る 。 さ ら に 、etoposideとpaclitaxel投与 に よ る 細胞 周 期 の変 化 を 、etoposide25pLM、 paclitaxel3．1いMを投与し比較した。
【 結 果 】U251MGは 、p53機 能 ア ッ セ イ の 結 果 、10 0a/oが 赤 色 コ □ 二 ー を 示 し 変 異 型p53 を 有 す る こ と が 判 明 し た 。LN 382は 、10 0u/oが ピ ン ク 色 の コ □ 二 ー を 示 し 変 異 型p53を 持 っ と 同 時 に 、 部 分 的 な 転 写 活 性 能 を 有 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ の 細 胞 株 は 温 度 低 下 に よ り 、 以 下 の 実 験 結 果 を 示 し た 。 （1） 酵 母 内 のp53転 写 活 性 が 回復 し た 。(2) p53に よ り 制 御 さ れ る 遺 伝 子 が 誘 導 も し く は 抑 制 さ れ た 。(3)細 胞 増 殖 率 が 低 下 し た 。 （4） 細 胞 周 期 がGl期 停 止 を 示 し た 。(5) p53蛋 自 分 解 が 回 復 し 、p53蛋 白 量 が 減 少 し た 。 こ れ ら の 結 果 に よ り 、 元 来 変 異 型p53を も つ 細 胞 株 で あ るLN 382のp53蛋 白 は 、370Cで は 変 異 型 と し て 、34℃ で は 野 生 型 と し て 振 る 舞 う 温 度 感 受 性 変 異p53で あ る こ と が 判 明 し た 。 こ の 細 胞 株 を34℃ で 培 養 す る と 、etopo sideとpaclitaxelの 感受 性 は 低下 し た 。さ ら に 、 哺 乳 類 発 現 ベ ク タ ー を 使 用 し 作 製 し た 外 因 性 の 野 生 型p53遺 伝 子 の 導 入 細 胞 株 に 対 し て 、IP TGを 加 え 野 生 型p53を 発 現 さ せ て も 、etoposideの 感 受 性 は 低 下 し た 。 薬 剤 投 与 に 伴 う 細 胞 周 期 の 解 析 で は 、34℃ 培 養 で は 細 胞 がG1期 に 集 積 し た が 、37℃ 培 養 で は Gl期 に 留 ま ら ず に 、G2M期 へ の 移 行 を 示 し た 。 一 方 、 変 異 型 p53を も つ U251MG細 胞 の 感 受 性 は 温 度 に 関 わ ら ず 違 い は な か っ た 。 ま た 、cisplatinとACNUの 感 受 性 は 、 両 細胞株ともに温度変化による違いを認めなかった。
【 考 察 】 本 研 究 の 結 果 か ら は 、p53機 能 の回 復 に よりetoposideとpaclitaxelの 感 受 性は 低 下 を 示 し た 。 こ れ は 、 投 与 後 の 細 胞 周 期 の 変 化 の 結 果 よ り 、Gl期 停 止 に 伴 うG2M期 へ の 移 行 阻 害 が 感 受 性 の 低 下 の 原 因 で あ る も の と 推 察 さ れ た 。 こ の 結 果 は 、p53変 異 が あ りGl期 停 止 を 示 さ な い 膠 芽 腫 へ の2剤 の よ い 適 応 を 示 唆 し て い る 。 ま た 、p53機 能 が 正 常 でGl期 停 止 を 示 す 膠 芽 腫 に お い て もGl期 停 止 を 合 め た 細 胞 周 期 の 人 為 的 抑 制 が 感 受 性 の 増 強 に 有 効 で あ る 可 能 性 を 示 唆 し た 。 こ れ に 対 し 、cisplatinとACNUの 感 受 性については、p53機能以外の要素が関与する可能性が示唆された。
【 結 語 】Etopo sideとpaclitaxelに 対 す る膠 芽 腫 細 胞の 感 受 性に は 、p53機 能が 強 く 関与 す る 結 果 が 得 ら れ た 。 一 方 、cisplatin、ACNUの 感 受 性 に お い て はp53機 能 の 関 与 を 示 唆 す る 結 果 を 本 研 究 の 結 果 か ら は 得 ら れ な か っ た 。 今 後 は 、 他 の 経 路 の 関 与 を 合 め た 検 討 が 必 要 で あ る 。 こ の よ う に 、 膠 芽 腫 細 胞 の 化 学 療 法 剤 選 択 の 方 針 決 定 に は 、p53を は じ め と す る 分 子 生 物 学 的 ア プ □ ー チ が 今 後 の 治 療 方 針 を 決 定 す る う え で 重 要 に な る と考えられた。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
膠芽腫化学療法感受性における p 53 癌抑制遺伝子の役割に関する研究
癌 抑 制 遺 伝 子
p53
の 変 異 が 、 膠 芽 腫 を 含 め た 多 く の 腫 瘍 に お い て 確 認 さ れ、 こ のp53
が 化 学 療 法感 受 性 に影 響 を与 え る 可能 性 が指 摘 さ れ注 目 を 集め て いる 。 こ れま で の 抗 癌 剤 感 受性 へ のp53
機 能 の関 わ り には 一 定の 見 解 はな い 。 これ は 、検 討 さ れた 細 胞 の 種 類 や 薬剤 、p53
機能 調 節法 の 違 いば か りで な く 、同 一 種 の細 胞 であ っ て も複 数 の細 胞 株 を用 い た場 合 、 各々 の 細胞株 ごとにp53を 含めた遺 伝子的要 因の違い により、p53
機 能 の 役 割を 純 粋 に評 価 する こ と がで き ない こ と が原 因 と 考え ら れて い る 。そ こ で 、 本 研 究 では 、et oposide
、paclit axel
、ci spl atin
、ACNU
の4
剤に つ いて 、 同 一 細 胞 株 に おい て 温 度を 変 化さ せ る のみ で 、p53以 外 の遺 伝 子 形質 を 変え る こ とな くp53
機 能 の み を変 化 さ せ得 る 、温 度 感 受性 変 異p53
膠 芽 腫細 胞 株 を用 い て、p53
機 能変 化 に 伴 う 化 学 療 法 感 受 性 変 化 を 検 討 し た 。 ヒ ト 膠 芽 腫 細 胞 株 で あ るLN382
、U251MG
を用 い、各 細胞株に 対する温度 による影 響を確認 した。（1
）p5
、3
転写 活性能を 、酵母 を 用 い たp53
機能 ア ッ セイ に より 評 価 した 。 （2
）p53
に よ り制 御 され る 遺 伝子 の 発 現 の 有 無 を 、multi plex RT‑ PCR
に より 検 討 した 。 （3
）37
℃ と34
℃ 培養 下 の細 胞 数 を カウ ン卜し 、細胞増 殖抑制効果 を確認し た。（4）Br dU‑ Pl
二重染色 法を用い たフロ―サイ ト メ トリ ー にて 細 胞 周期 解 析を行 った。（
5
）p53
蛋白量 はELISA法にて 測定した 。 次 に 、 化 学 療 法 感 受 性 をMTT
ア ッ セ イ に て検 討 した 。 野 生型p53
遺伝 子 を 哺乳 類 発 現 ベ ク タ ー を 用い てLN382
細 胞に 導 入 した 。 さ らに 、et oposide
とpaclit axe
｜ 投 与に よ る 細 胞 周 期 の 変 化 を 検 討 し た 。U2 51Mq
ま 、p53
機 能 ア ッ セ イ の 結 果 、100
％ が 赤 色 コ ロ ニ ー を 示 し 、 変 異 型p53
を 有 す る と 判 明 し た 。LN382
は 、100
％が ビ ン ク色 の コロ 二 ― を示 し 、部 分 的 な転 写 活性 能 を 有す る こと が 示 唆さ れた 。この細 胞株は温度60 ‑
弘郎 也
