葯特異的発現遺伝子の解析と雄性不稔性の遺伝子解明

葯特異的発現遺伝子の解析と雄性不稔性の遺伝子解

明

著者

西尾 剛

荷特異的発現遺伝子の解析と雄性不稔性の遺伝子解明

平成14年度∼平成17年度科学研究費補助金

研究成果報告書

(東北大学大学院農学研究科教授)

はしがき 世界人口の増加に伴って今後ますます作物の生産性向上が求められることが 予想されるが､最も確実に生産性を高めることができる育種は､雑種強勢を利 用した一代雑種育種である｡一代雑種育種はトウモロコシや野菜類で利用され､ 作物の生産性向上に実績をあげてきたが､イネやムギ類ではまだ問題点が多く､ 一部で利用されているのみである｡一番大きな問題は､一代雑種品種の採種で ある｡一代雑種品種の採種が確実に効率よく行われない限り､一代雑種育種の 普及による生産性向上は望めない｡ 一代雑種品種の採種においては､確実に他系統と交雑するために雄性不稔性 や自家不和合性が利用されている｡一代雑種育種によく利用されている細胞質 雄性不稔性は､ミトコンドリアの遺伝子と核の稔性回復遺伝子の相互作用によ って決定される複雑な遺伝を示し､これを利用した育種も複雑となる｡一方､ 核遺伝子雄性不稔性は､遺伝が単純であるが､不稔系統として固定できない点 が問題で育種には利用されていない｡これらの遺伝子が解明されれば､そのDNA 情報を利用した育種技術の開発が展望できる｡ 本研究では､イネやシロイヌナズナのゲノム情報を有効に活用し､イネとア ブラナ科植物を材料として､薪特異的発現遺伝子の解析､雄性不稔性変異体の 変異遺伝子の解析､細胞質雄性不稔性の原因遺伝子と稔性回復遺伝子の解明､ 変異遺伝子のDNA情報を利用した育種技術の開発を行った｡イネのBorO型細 胞質雄性不稔性の稔性回復遺伝子やアブラナ科mur型細胞質の細胞質雄性不稔 性原因遺伝子､シロイヌナズナの核遺伝子雄性不稔性の原因遺伝子の解明では 成果が得られ､育種にも利用可能な一塩基多型の簡易分析技術が開発できたこ とから､ DNA情報を利用した一代雑種育種技術の開発に道が開けるのではない かと期待している｡

研究組織 研究代表者:西尾 剛(東北大学大学院農学研究科 教授) 研究分担者:鳥山欽哉(東北大学大学院農学研究科 教授) 岸谷幸枝(東北大学大学院農学研究科 助手) 研究経費 平成14年度19,630千円 平成15年度11,700千円 平成16年度10,400千円 平成17年度10,560千円 計    52,290千円 (うち直接経費15,100千円) (うち直接経費 9,000千円) (うち直接経費 8,000千円) (うち直接経費 8,200千円) (うち直接経費 40,300千円) 研究発表 (1)学会誌等

AriizumiT,Amagai M, Shibata D, Hatakeyama K, Watanabe M, Toriyama K:

Comparative study of promoter activity of three anther-Specific genes encoding

lipid transfer protein, Ⅹyloglucan endotransglucosylase/hydrolase and

polygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana･ Plant Cell Rep･ 21: 901 96 (2002)

Sato Y, Nishio T: Efficient detection of DNA polymorphism in cabbage andrice

cultivars by PCR-RF-SSCP (PRS)･ Plant Cell Rep･ 21: 276-281 (2002)

Kazama T, Toriyama K: Apentatricopeptide repeat-containing gene that promotes the

processlng Of aberrant atp6 RNA of cytoplasmic male-sterilerice･ FEBS Lett･

544: 99-102 (2003)

AmagaiM, Ariizumi T, Endo M, Hatakeyama K, Kuwata C, Shibata D, Toriyama K,

Watanabe M: Identification of anther-specific genes in cruciferous model plant, Arabidopsis thaliana, by uslng a COmbination of ArabidopsIS maCrOamy and

mRNA derived from Brassica oleracea. Sex. Plant Rep. 15: 213-220 (2003)

Ariizumi T, Hatakeyama K, Hinata K, Sato S, Kato T, Tabata S, Toriyama 冗: A novel

male-sterile mutant ofArabidopsis thaliana, faceless pollen-1, produces pollen

with a smooth surface and an acetolysis-sensitive exi血e. Plant Mol. Biol. 53: 107-116 (2003)

Abe F, Todyama K:Alteration of the accumulation of altemative oxidase by introducing sense and antisense OsAOXlainrice. Plant Biotech. 20: 339-341 (2003) Sato Y, Nishio T: Mutation detection inrice waxy mutants by PCR-RF-SSCP. Theor.

Appl. Genet. 107: 560-567 (2003)

FukaiE, Fujimoto R, Nishio T: Genom'lC Organization of the S core region and the S flanking regions Of a class-II S haplotype in Brassica rapa･ Mol･ Genomics Genet. 269: 361-369 (2003)

Sato Y, Fujimoto R, Toriyama K, Nishio T: Commonality of self-recogmition specificity of S haplotypes between Brassica oleracea and Brassica rapa･ Plant MoI Bi01

52: 617-626 (2003)

Fujimoto R, Nishio T: Identification of S haplotyppes in Brassica by dot blot analysis of SPll alleles. Tbeor Appl Genet 106: 1433-1437 (2003)

Ariizumi T, Hatakeyama K, Hinata K, Inatsugi 良, Nishida I〉 Sato S〉 Kato T, Tabata S,

Toriyama K: Disruption of the novel plant protein, NEFl, affects lipid

accumulation in the plastids of the tapetum and exiれe fomation of pollen

resulting in male sterility inArabidopsis thaliana･ Plant J･ 39: 170-181 (2004)

Okuzaki A, Todyama 冗: Chimeric RNA ･ DNA oligonucleotide-directed gene targeting

in rice. Plant Cell Rep. 22: 509-512 (2004)

有泉亨･鳥山欽哉:シロイヌナズナの核遺伝子雄性不稔における研究の現状と

応用への展望 育種学研究6 : 195-203 (2004)

Kazama T, Toriyama K: Genetic evolution of即locus for the fertility resorer gene of

BT-type CMSrice･ in uRice is life: scientific perspectives for the 21st century" Ed. IRRI, pp170-171 (2004)

Shirasawa K, Monna L,Kishitani S, Nishio T: Single nucleotide polymorphisms in

randomly selected genes among japotulcarice (Oryza saliva L･) varieties

identified by PCR-RF-SSCP･ DNA Research ll: 275-283 (2004)

Shirasawa K, Kishitani S, Nishio T: Conversion of AFLP markers to sequence-Specific

markers for closely related lines inrice by use of the rice genome sequence･ Mol. Breed. 14: 283-292 (2004)

Inoue H, Nishio T: Efficiency of PCR-RF-SSCP marker production in Brassica

oleracea using Brassica EST sequences･ Euphytica 137: 233-242 (2004)

(S) haplotypes in different genera, Raphanus and Brassica･ Sex･ Plant Reprod.

17: 33-39 (2004)

Sato Y, Okamoto S, Nishio T: Diversificationand alteration of recognition specificity of

the pollen ligand, SPll/SCR, in self-incompatibility of Brassica and Raphanus.

Plant Cell 16: 323013241 (2004T

Yamasaki S, Konno N,Kishitani S: Overexpression ofmitochondrial genes is caused by

interactions between the nucleus of Brassica rapa and the cytoplasm of

Diplotaxis muralis in the leaves of alloplasmic lines of B. rapa. J. Plant Res.

117: 339-344 (2004)

Ariizumi T, Hatakeyama K, Hinata 冗, Sato, S, Kato, T, Tabata S, Toriyama 冗: The

HM gene, which is identical to the MSl gene of Arabidopsis thaliana, is

essential for prlmeXine formation and exine pattem formation. Sex. Plant

Reprod･ 18: 1-7 (2005)

Fujii Sy Toriyama K: Molecular mapping Of the fertility restorer gene for ms-CW-type cytoplasmic male sterility ofrice･ Theor･ Appl･ Genet･ lil: 696-701 (2005) Shirasawa K,Kishitani S, Nishio T: Dot-blotanalysis for identification of japonica rice

cultivars and genotyping of recombinant inbred lines･ Breed Science 55:

187-192(2005)

Fujimoto R, Sugimura T, Nishio T: Gene conversion from SLG to SK resulting ln

Self-incompatibility in Brassica rapa･ FEBSLett･ 580: 425-430 (2006)

Sato Y, Sato K, Nishio T: Interspecific pairs Of class-II S haplotypes having different recognition specificities between Brassica oleracea and Brassica rapa. Plant

Cell Physiol.47: 340-345 (2006)

Shinada T,Kikuchi Y, Fujimoto R,Kishitani S:Analloplasmic male-sterile line of Brassica oleracea harboring the mitochondria from Dl-plotaxis muralis

expresses a novel open reading frame, orj72･ Plant Cell Physiol. 47.I 549-553

(2006)

Sato Y, Shirasawa K, Takahashi Y, Nishimura M, Nishio T: Mutant selection from

gamma-ray-i汀adiated rice by heteroduplex cleavage･ Breed･ Science in press (2006)

Shirasawa K, ShiokaiS, Yamaguchi M, Kishitani S, Nishio T･･ Dot-blot-SNP analysis

Genet. in press (2006)

(2)口頭発表

Toriyama K, Morita R: Induction of independent Ds transposition using

meiosis-associated promoters in tran'sgenicrice･ Intemational Workshop Towards Building a Global Rice Gene Machine (2002 Nov ll-12 Canberra, Australia)

安倍史高･岸谷幸枝･鳥山欽哉:耐冷性を異にするイネ品種間における alternative oxidase遺伝子発現の差異 日本育種学会(2002.3.30-31 玉川大会) 佐藤豊･西尾剛: PCR-RF-SSCP(PRS)法によるイネwaxy突然変異体の点突 然変異の解析 日本育種学会(2002.3.30-31玉川大会) 井上寿史･西尾剛: Brassl'ca oleraceaにおけるPRS(PCR-RF-SSCP)法による 高効率DNA多型マーカーの作成 日本育種学会(2002.8.26-27帯広 畜産大) 森田竜平･横井修司･高瀬尚文･平塚和之･鳥山欽哉:減数分裂特異的遺伝子 のプロモーターを用いたイネにおける Ds転移の誘導 日本育種学会 (2002.8.26-27帯広畜産大)

Abe F, Kishitani S, Toriyama K: The analysis of the altemative oxidase genes among

rice cultivars differing in low temperature tolerance･ 6th Intemational Congress

on Plant Mitochndria. (2003 Perth)

Chiba A, Nakagawa Y, Machida C, Machida Y: Chromosomal deletion generated by

R/RS site-specific recombination in transgenic rice･ Intemational Rice

Congress (2003 Beijing)

Ariizumi T, Kishitani S, Inatsugi R, Nishida I, Murata N, Toriyama K: An increase in

unsaturation of fatty acids by introduction of genes fわr glycero1-3-phosphate

acyltransferase enhanced low-temperature tolerance in rice seedlings･

Intemational Rice Congress (2003 Beijing)

AriizumiT, Hatakeyama K, Hinata K, Sato S, Kato T, Tabata S) Toriyama K: Isolation

and chracterization of a novel male-sterile mutant, Ppl, lacking most of the reticulate pattem of pollen exine･ Plant Biology (2003, Jul･ 25-30 Honolulu, Hawaii)

self-incompatibility(S ) locus between Brassica oleraceaand Brassica rapa. Plant Biology (2003, Jul. 25-30 Honolulu, Hawaii)

Fukai E, Fujimoto R, Nishio T: GenomiC organization of the S core region and the S flanking regions Of a class-II S haplotypeinBrassica rapa･ Plant Biology

(2003, Jul. 25-30 Honolulu, Ha☆aii)

Kazama T, Toriyama K: Molecular characterization of RP,the fertility restorer gene for

BT-type CMS rice, that promotes the processlng Of mitochondrial B-atp6 mRNA･ Plant Biology (2003, Jul･ 25-30 Honolulu, Hawaii)

Toriyama 冗, Morita 良: Assessment of utility of meiosis-associated promoters of lily f♭r

induction of geminalDs transposition inrice･ Plant Biology (2003, Jul. 25-30

Honolulu, Hawaii)

Morita R, Yokoi S? Takase H, Hiratsuka, K, Toriyama K: Meiosis-Specific transposition

of maize Ds element in transgenicrice･ Intemational Rice Congress (2003

Beijing)

Nishio T: Polymorphism of S-locus genesinBrassica - Evolutionary aspects and usein

plant breeding･ Intemational Symposium on Plant SelHncompatibility (2003, Sep. 17 Nara, Japan)

Ariizumi T, Hatakeyama K, Hinata K, Sato S, Kato T) Tabata SタToriyama K: A novel

male-sterile mutant of Arabidopsis thaliana, faceless pollenll, which lacks a slgnal for pollen hydratiom Intemational Symposium on Plant

Self-Incompatibility (2003, Sep･ 17 Nara, Japan)

Fujimoto R, Kusaba M, Nishio T: Comparison of self-incompatibility (S) locus between･ Brassica oleraceaand Brassica rapa,and diversity of retrotransposons found

in the S locus region Of Brassica oleracea･ Intemational Symposium on Plant

SelHncompatibility (2003, Sep. 17 Nara, Japan)

FukaiE, Fujimoto R, Nishio T: GenomiC organization of the S core region and the S

flanking reglOnS Of a class-II S haplotypein Brassica rapa. Intemational

Symposium on Plant SelHncompatibility (2003, Sep･ 17 Nara, Japan)

Inoue H, Nishio T: PCRIRF-SSCP markers for the mapping Ofthe genes controlling the

strength of self-incompatibility in Brassica oleracea I Intemational Symposium on Plant Self-Incompatibility(2003, Sep. 17 Nara, Japan)

(S) haplotypesindifferent genera, Raphanus and Brassica･ Intemational Symposium on Plant Self-Incompatibility (2003, Sep･ 17 Nara, Japan)

Sato Y, Fujimoto R, Toriyama K, Nishio T: Commonality of self-recognition specificity

of S haplotypes between Brassica oleracea and Brassica rapa･ Intemational

Symposium on Plant SelHnco血patibility (2003, Sep･ 17 Nara, Japan)

Sueoka M, Nishio T: Stmctural variation of SLRl (∫-locus related gene 1) in

Brassicaceae. Intemational Symposium on Plant Self-Incompatibility (2003,

Sep. 17 Nara, Japan)

白樺健太･岸谷幸枝･西尾剛: PRS法による日本型イネ品種の遺伝子多型の解 析 日本育種学会(2003.4.2-3千葉大会) 奥崎文子･鳥山欽哉:キメラRNA/DNAオリゴヌクレオチドを用いたイネア セト乳酸合成酵素遺伝子の部位特異的改変 日本植物細胞分子生物学 会(2003.8.7-8香川大会) 風間智彦･鳥山欽哉:イネ稔性回復遺伝子(Rf-1)はPPRモチーフをコードし､ ミトコンドリアRNAのプロセッシングに関与する 日本植物細胞分子 生物学会(2003.8.7-8香川大会) 有泉亨･畠山勝徳･日向康吉･佐藤修正･加藤友彦･田畑哲之･鳥山欽哉:シ ロイヌナズナ雄性不稔変異体faceless pollen-1は滑らかな花粉表面と アセトリシス処理に感受性なエキシンを持つ 日本育種学会 (2003.9.19-20神戸大会) 奥崎文子･鳥山欽哉:キメラプラスとを用いた遺伝子タ-ゲテイングによるALS 一塩基置換イネの作出 日本育種学会(2003.9.19-20神戸大会) 小宮怜奈･西尾剛:トウモロコシMS46遺伝子のイネ類似遺伝子､ OsMS46の 機能解析 日本育種学会(2003.9.19-20神戸大会) 白樺健太･岸谷幸枝･西尾剛:イネ近縁両親間雑種集団を用いた遺伝子マッピ ングのためのAFLPマーカーのSCAR､ CAPS､ PCR-RF-SSCPマー カーへの変換 日本育種学会(2003.9.19-20神戸大会) 武藤景子･森田竜平･鳥山欽哉:イネに導入したトランスポゾンDs-GUS T-DNA と転移した Ds-GUS の挿入位置の解析 日本育種学会 (2003.9.19-20神戸大会)

Nishio, T･, Y･ Sato, R･ Fujimoto & S･ Okamoto: Diversification and evolution of S

self-incompatibility･ 18th Intemational Congress on Sexual Plant Reproduction

(2004･8.20-24 Beijing, China)

Fujimoto, R･, K･ Okazaki, M･ Kusaba & T･ Nishio: Comparison of the genome structure of the self-incompatibility (S) locus in interspecific pairs of S haplotypes. 18th lntemational Congress on SexuTal Plant Reproduction (2004･8･20-24 Beijing, China)

Toriyama, K. & T. Kazama: Cloningand Characterisation of RfI, a Fertility Restorer Gene for ms-bo typeCMS Rice･ Proceedings of the 4th Intemational Crop

Science Congress (2004.9.26-10･ 1 Brisbane, Australia)

Nishio, T., A. Izumida, H. Hanzawa 皮 K･ Sakamoto: Development of S tester lines of

Brassica oleT･aCea, Brassica rapa, and Raphanus sativus as genetic resources. Joint Meeting of 14th Crucifer Genetics Workshop and 4tb ISHS Symposium

on Brassicas (BRASSICA2004) (2004･10･24-28 Daejeon, Korea)

Fujimoto, R., A. Sawasato, E. Fukai& T. Nishio: Gene structure ofSRKand SPll/SCR

in self-compatible B. rapa L･ var･ Yellow Sarson･ Joint Meeting of 14th

Crucifer Genetics Workshop and 4th ISHS Symposium on Brassicas

(BRASSICA2004) (2004.10.24-28 Daejeon, Korea)

Nishio, T., Y. Sato, & K. Shirasawa: Perspectives on mutation breeding of rice:

Application of the information onrice genome･ World Rice Research Conference 2004 (2004.ll.5-7 Tsukuba, Japan)

Fujii, S. & K. Toriyama: Mapplng Of a fertility restorer gene for male-sterile cytoplasm

ofrice reported by Katsuoand Mizushima (1958)･ World Rice Research Conference 2004 (2004.ll.5-7 Tsukuba, Japan)

Kazama, T. & K. Toriyama: Genetic evolution ofRP locus for the fertility restorer gene

of BT-type CMSrice. World Rice Research Conference 2004 (2004.ll.5-7 Tsukuba, Japan)

Okuzaki, A. & K. Toriyama: Production of rice plantswith a site-specirlC base change

in acetolactate synthase gene by chimeraplast-directed gene targeting, World Rice Research Conference 2004 (2004･ ll ･5-7 Tsukuba, Japan)

Shirasawa, K., L. Monna, S.Kishitani & T･ Nishio: Single nucleotide polymorphismsin

randomly selected genes among japonicarice (Oryza saliva L.) varieties

(2004.ll.5-7 Tsukuba, Japan)

Shirasawa, K., S.Kishitani & T. Nishio: Single nucleotide polymorphisms in genes

among Japanese leading cultivars and their parental cultivars of japonica

paddy-rice identified by PCR-RF-SSCP･ 2nd Intemational Symposium of Rice

Functional Genomics (2004.ll.15117 Tucson, USA)

Toriyama, K. & S. Fujii: Breeding and genetic analysis of a fertility restorer line for a

ma16-sterile cytoplasm 【cms-CW〕 of rice･ ュnd lntemational Symposium of

Rice Functional Genomics (2004.11･15-17 Tucson, USA)

有泉亨･畠山勝徳･日向康吉･稲継理恵･西田生郎･佐藤修正･加藤友彦･田 畑哲之･鳥山欽哉:シロイヌナズナのnefl雄性不稔変異体の解析 第 45回日本植物生理学会(2004.3.27-29東京都立大学) 風間智彦･鳥山欽哉:イネ細胞質雄性不稔稔性回復遺伝子によるB-atp6 mA の転写後制御 第45回日本植物生理学会(2004.3.27-29東京都立大 学) 白樺健太･岸谷幸枝･西尾剛:日本型水稲の育種過程で選抜された染色体領域 のPRS法による解析 第105回日本育種学会(2004.3.30-31東京大 学) 白樺健太･岸谷幸枝･西尾剛:一塩基多型(SNPs)分析により明らかとなっ たイネ主要品種間の遺伝子変異 第1回東北大学バイオサイエンスシ ンポジウム(2004.5.14仙台) 白樺健太･岸谷幸枝･西尾剛:ドットプロット分析によるイネの品種判別と組 換え自殖系統群の遺伝子型判定 イネ遺伝学･分子生物学ワークショ ップ2004 (2004.7.8-9つくば) 藤井壮太･鳥山欽哉: CW型細胞質雄性不稔イネにおける稔性回復遺伝子の連 鎖解析 イネ遺伝学･分子生物学ワークショップ2004(2004.7.8-9つ くば) 川遠隆大･有泉亨･鳥山欽哉: BaxとAtBI-1を夕べ-ト組織で発現させたシ ロイヌナズナの解析 第106回日本育種学会(2004.9.21-22三重大 学) 品田智隆･菊池洋介･岸谷幸枝: mur型細胞質雄性不稔Brasslca oleraceaで 特異的に発現するミトコンドリアキメラORF72 第106回日本育種学 会(2004.9.2卜22三重大学)

白樺健太･佐藤豊･岸谷幸枝･西尾剛:アブラナ科野菜のミスマッチ切断酵素 のよる日本型イネ品種の-塩基多型の解析 第106回日本育種学会

(2004.9.2卜22三重大学)

藤井壮太･鳥山欽哉: CW型細胞質雄性不稔イネにおける稔性回復遺伝子Rfcw

のマッピング 第106回日本育種学会(2004.9.2卜22三重大学) Sato Y, Nishio T: Diversification of recognition specificity of S haplotypes in Brassica.

Plant Biology (2005.7.16-20 Seattle, Washington)

Shirasawa 冗, Shiokai S, Kishitani S. Nishio T: Doトblot analysis to detect SNPs and

indels of rice (Oryza saliva L･). Plant Biology 2005 (2005･7･16-20 Seattle, Was hington)

Shirasawa K, Shiokai S, Nagano K, Yamaguchi M,Kishitani S, Nishio T: Dot-blot-SNP

analysis for quantitative trait loci analysis and plant breeding ln rice･ loth

Intemational Congress of SABRAO (2005･8 Tsukuba, Japan)

Shirasawa K, ShiokaiS, Nagano K,Kishitani S, Nishio T: A simpleand cost-effective

SNP detection method, dot-blot-SNP analysis, for cultivar identification and

Qn analysis. 5th Intemational Rice Genetics Symposium and 3rd

lntemational Symposium of Rice Functional Genomics (2005･11 Manila, Philippines) 有泉亨･畠山勝徳･日向康吉･佐藤修正･加藤友彦･田畑哲之･鳥山欽哉:シ ロイヌナズナのmojyao雄性不稔変異体の単離と解析 第46回日本植 物生理学会年会(2005.3.24-26新潟) 掘泰子･西尾剛:イネのモチ品種におけるⅥⅨ遺伝子の変異解析 日本育種学 会(2005.8 つくば) 白樺健太･汐海砂知子･岸谷幸枝･西尾剛:ドットプロット分析による日本型 イネ品種の-塩基多型の解析 日本育種学会(2005.8 つくば) 品田智隆･岸谷幸枝･西尾剛: SNPsマーカーを利用したBrasslca olellaCea のマップ作成  日本育種学会(2005.8 つくば) (3)著書･出版物

Nishio T, Sato K: Structural differences of S locus between Brassica oleraceaand

Brassica rapa. in "Bioteclmology in Agriculture and Forestry 52 Brassicas and

西尾剛:植物の性と生殖 三上哲夫編｢植物遺伝学入門｣朝倉書店pp1-32 (2004)

鳥山欽哉･風間智彦:細胞質雄性不稔植物の稔性回復遺伝子の正体とは? 化 学と生物 43 : 212-213 (2005)

西尾剛･向井康比己･大洋良･草場信･鳥山欽哉:遺伝学の基礎 見て分かる

アプラナ科植物の所特異的発現遺伝子の解析

核遺伝子雄性不稔を利用した育種を展望した研究は､これまでほとんどなさ

れていない｡本研究ではReVerSe GeneticsとFoⅣard Geneticsを用い､シロイヌ

ナズナを材料として雄性不稔に関わる核遺伝子の単離を試みた｡ Reverse GeneticsではRNAi法を用いて薪特異的遺伝子の発現を抑制した系統を得､そ れらの表現型を観察した｡ Forward Geneticsでは2,250系統のT-DNAタグライ ンより新規の3系統の雄性不稔変異体をスクリーニングした(伽nefhkm) ｡こ れらの変異体の雄性不稔の原因を詳細に解析した｡ 1. Fbverse Goneticsを用いた帝特異的発現遺伝子の解析 マクロアレイのデータ等を利用して薪で特異的に発現が強い遺伝子を23個 選び､これらの遺伝子発現を抑制した時に花粉発達が異常になるかを観察した｡ まず､薪で特異的に発現が強い3つの遺伝子Il'pid transferprotein 12 (LTP12)､

xyloglucan endotransglucosylase 3 (XTH3), polygalacturonase 4 (PGA4)を選び､プロ

モーターの発現誘導解析を行った(Ariizumi et al. 2002)｡その結果､ -核期､ 二核期で夕べ-ト組織特異的に遺伝子発現を誘導するLTP12プロモーターを得 た｡これを用いて遺伝子発現を抑制するためのRNAi用のコンストラクトを作 製した｡ RNAiにより 6個の遺伝子についてその発現レベルを減少させた形質 転換体を作出したが､稔性に異常が見られた個体を得る事はできなかった｡ 2.シロイヌナズナface/ass pouenl(flpl)雄性不稔変異体の解析 ppl雄性不稔変異体は通常条件下では雄性不稔性を示したが､高湿度条件下 で生育させると稔性が回復した｡ Ppl変異体の花粉表面を走査型電子顕微鏡 (SEM)で観察した結果､Ppl変異体では野生株と比べて滑らかな花粉表面であり､ エキシンの網目模様がはっきりと見えないことが分かった｡この表現型からこ の変異体をfacelesspollenl(桝)と名付けた｡ Ppl変異体は条件的雄性不稔性を 示したが､この表現型は茎や葉あるいは英におけるクチクラワックス合成に欠 陥のあるcerl､ cer6/popl雄性不稔変異体に見られる表現型である.そこでPpl 変異体の茎と英におけるクチクラワックスをSEMで観察した結果､野生株と 比べると変異体では大幅にクチクラワックスが減少している事が明らかとなっ

した結果､ T-DNAがPpl遺伝子の第四イントロン内に挿入されていたことが分 かった｡相同性検索の結果､ FLPl タンパク質は受容体としてワックス合成に 関わるEPI23タンパク質と最も高い相同性を示した｡相補性実験によりPpl遺 伝子が原因遺伝子であることを明らかにした｡発現解析の結果､ Ppl遺伝子は 花器官で強く発現し､根以外の様々な栄養器官でも発現することが分かった｡ エキシン､トリフィンそしてワックスの共通する構成要素が脂肪酸(脂質)であ ることから､ FLPlタンパク質は受容体として､あるいは酵素として脂肪酸(脂 質)の合成に関わっていることが推測された(Ariizumi et all 2003).

3. rlO eXJ･ie format/･onl(rwfl)雄性不稔変異体の解析

nefl雄性不稔変異体は花粉が完全に消失する変異体であったC花粉の崩壊が 始まる発達段階を明らかにするために､薪の異なる発達ステージの切片を作製 して光学顕微鏡で観察した｡光学顕微鏡下ではnefl変異体で最初の異常がみら れたのは-核期であり､小胞子の周辺に頼粒が見えた｡二核期になるとこの頼 粒がより顕著に現れた｡三核期になると花粉が消失していた｡ TEMを用いてエ キシン発達過程を調べたところ､エキシンが作られないことがわかった｡エキ シンが作られない事から､ no Erineformationl(nell)と名付けた｡ TEMで夕べ-ト組織の発達過程を調べたところ､ nefl変異体では夕べ-ト組織中のプラスチ ドや脂肪体の脂質蓄積に欠陥があることが分かった｡ neP変異体は栄養器官に おいても欠陥を示した｡葉の葉緑体構造をTEMで観察した結果､ nefl変異体 の葉緑体は均一な構造を持たず､またグラナ構造も乏しい事が分かった｡つま り栄養器官の異常は､葉緑体の異常に起因することが推測された｡野生株とnefl 変異体の脂質と脂肪酸組成の分析を行った結果､野生株とnefl変異体の間で脂 肪酸組成に差は見られなかったが､ nefl変異体の脂質量は野生株と比べて10% 減少していることが明らかとなった｡次にTAIL PCRによりneP遺伝子をクロ ーニングし､ 5'RACE法を用いて全長のnefl cDNAを決定した｡データベー ス検索の結果､ NEFlタンパク質はプラスチド移行シグナルと26個の膜貫通債 域を有することが推測された｡モチーフ検索の結果､ NEFlタンパク質は膜の 統合性(envelope integrity)の維持に重要とされる原核膜リポタンパク質脂質結合 部位を3つ有することが分かった｡相補性実験によりnefl遺伝子が原因遺伝子 であることを明らかにした｡発現解析の結果､ nefl遺伝子は花器官で強く発現 し､様々な栄養器官でも発現している事が分かったo nefl変異体の表現型､遺

伝子構造の解析の結果､ NEFlはプラスチド膜の統合性の維持に重要なタンパ ク質であることが推測された(Ariizumi et al. 2004)｡ 4. hackly microspore(hkm)捷性不稔変異体の解析 光学顕微鏡とTEMを用いた観察の結果､ hkm変異体は四分子期以降に異常が あることが分かった｡四分子期において､ hkm変異体の夕べ-ト組織は野生株 と比較して空胞化が進んでいた事が分かった｡また四分子は正常に形成されて いたが､ -核期になると変異体の小胞子は不規則な形となった｡このとき､ぎ ざぎざのエキシンが見られたため､ hacklymicrosporeと名付けた.二核期にな ると花粉や夕べ-ト組織の空胞化がさらに進み､三核期になると空胞化した夕 べ-ト組織が蔚室を押しつぶしていた｡ この変異はT-DNAにタギングされていなかった｡表現型が遺伝子破壊によ り雄性不稔になることが報告されていたmsl変異体と類似していたため､ MSl 遺伝子について照査したところ､ SNPが検出でき､交配実験によりMSlのアリ ルであることが明らかとなった｡ 〟∫了は夕べ-卜細胞特異的な転写因子である ことが報告されている｡ HKMタンパク質は夕べ-ト組織の分化､発達に関わ り､この遺伝子の欠損によりプライムエキシン合成に必要な物質が夕べ-ト組 織から供給されない事が推測された(Ariizumi et al. 2005)｡ 5.まとめ Reverse Geneticsを用いて雄性不稔遺伝子を単離する効率は低いことが考えら れた｡一方､ FoⅣard Geneticsによりエキシン合成に必要な遺伝子を新たに3個 同定することができ､その原因遺伝子をクローニングすることができた｡ Ppl 変異体は花粉を有し､高湿度で稔性が回復した｡アブラナ科野菜のPpl遺伝子 をRNAi法で破壊すれば､その形質転換体は､花粉は有するが発芽できない雄 性不稔性を示すと期待される｡この雄性不稔をFlハイブリッド育種の採種に用 いれば､花粉を有するのでFlハイブリッド育種の際に訪花昆虫が利用でき､ま た高湿度条件下で自殖できるので､維持系統も不要の新規育種技術開発につな がる可能性がある｡ シロイヌナズナの核遺伝子雄性不稔における研究の現状と応用への展望につ いて育種学研究に総説を発表した(有泉･鳥山2004)｡

イネの雄性不稔性遺伝子の解析 シロイヌナズナの薪特異的発現遺伝子の解析に基づいて､イネとアプラナ科 野菜における相同遺伝子を見出し､それらの内､薪や花粉の発達に必須の遺伝 子をRNAi法やアンチセンス法を利用して明らかにする｡これら遺伝子の欠失 突然変異体をpCR法を利用してスクリーニングする｡一方で､既存の核遺伝子 雄性不稔突然変異体の遺伝子をマッピングし､筋特異的発現遺伝子と対応付け することにより､雄性不稔系統の突然変異遺伝子を同定する｡ SNP解析手法を 改良し､多数試料を一時に分析できるシステムを開発することにより､核遺伝 子雄性不稔個体を幼苗で選抜する技術を確立する｡これにより､核遺伝子雄性 不稔を利用した新たな一代雑種育種体系を構築する｡ 1.イネの雄性不稔突然変異遺伝子のマッピング 放射線誘発の不稔突然変異27系統(主にコシヒカリ由来)を用い､雄性不 稔性を調査したところ､安定しての雄性不稔性を示したものは2系統しかなか った｡別の1系統は雌性も不稔性を示した｡花粉稔性が30%程度のものや同 じ穂に不稔の穎花と可稔の穎花が生じる不完全な雄性不稔系統もあった｡不稔 突然変異系統が不稔性を示さないあるいは安定しないのは､突然変異体が選抜 された茨城県と雄性不稔性調査を行った仙台との幼穂形成期における温度の差 が影響している可能性が考えられる｡安定して雄性不稔性を示す2系統のうち 1系統を選抜し､突然変異遺伝子のマッピングのための交雑を行った｡ 不稔系統にインディカのKasala也を交配してF2での不稔性を調査すると､ 2003年の冷害の影響で不稔となったり､日印間の雑種不稔が生じ､突然変異 遺伝子による雄性不稔性を正確に評価するのが困難であった｡そこで､突然変 異系統に比較的コシヒカリとの間でDNA多型の検出率が高いアキヒカリを交 雑することにした｡点突然変異を簡易に検出できるPCR-RF-SSCP法(sato and Nishio 2003)を利用して､日本品種間でも多型を検出できるマーカーを約200種 類作成した｡突然変異体とアキヒカリの雑種集団を用いて突郊変異遺伝子のマ ッピングを行ったところ､第9染色体のT1423から26.7cM､ SSR87から5.8cM の距離に座乗していることが分かった｡その染色体領域だけインディカ型にな っている系統と交雑して､精密マッピングを試みている｡

2･トウモロコシ雄性不稔性遺伝子のイネオルソログの逆遺伝学的解析 シロイヌナズナの雄性不稔性遺伝子のオルソログをイネで見出すのは困難で あったため､トウモロコシで雄性不稔性遺伝子として明らかとなっているMS45 のイネの相同遺伝子OsMS45を単離し､その機能解析を行った｡この遺伝子は イネではゲノムあたり1コピーと考えられ､葉やカルスでは発現が見られず四 分子期と-核期の前で強く発現していた｡ OsMS45の遺伝子発現をRNAi法で抑制するためのキメラ遺伝子を作成し､ イネに導入したところ､ユピキチンプロモーターを用いたコンストラクトでは 32個体､薪特異的発現プロモーターのOsg6bプロモーターのコンストラクト では26個体の形質転換体を得た｡これらの中に､ osMS45の発現が全く検出さ れない個体が複数得られたが､それらの花粉稔性は比較的高く､花粉不稔の個 体にOsMS45の発現レベルが高いものが見られ､ osMS45と雄性不稔性との関 連性は見られなかった｡ 3･逆遺伝学的突然変異休作出技術の開発 RNAi法では遺伝子発現を抑制することは出来るが､完全に止めることは難 しいため､検出できない程度のわずかなmRNAがその遺伝子による形質発現に 十分である可能性は否定できない｡ノックアウト突然変異遺伝子が得られれば､ その遺伝子の機能を証明できるため､逆遺伝学的な突然変異体作出法の開発を 行った｡ ミズナの葉柄から一本鎖DNA切断酵素を粗精製し､ -塩基多型を持つDNA を混合して形成させたヘテロ二本鎖DNAに処理したところ､変異があるDNA が1/10量含まれていればその変異を検出できた｡そこで､ガンマ線を種子照射 したコシヒか｣のM25個体ずつをまとめてゲノムDNAを抽出し､遺伝子の1.0 -1.5 kbのDNA断片をpCRで増幅し､一本鎖DNA切断酵素を処理して､ア ガロースゲル電気泳動で切断されたDNAを検出した｡変異を持つDNAの塩基 配列を決定し､ -塩基多型を同定した｡ 25遺伝子のスクリーニングで､ 6つの 変異が検出でき､そのうちエキソン内の2つの変異はフレームシフトとミスセ ンス変異であった｡用いたM2集団における突然変異遺伝子の検出率は約8 Mb あたり1つと計算され､ Mlでの変異誘発率は約6Mbあたり1つと推定できた｡ 他の集団でも同じ方法により突然変異体が得られ ガンマ線では､化学変異剤 に比べDNAレベルでの突然変異率は低いものの､ DNA変異あたりのノックア

ウト変異の率は高いと考えられた(Satoet al. 2006)0 4.核遺伝子碓性不稔を利用した育種技術の構築 核遺伝子雄性不稔性は､細胞質雄性不稔性と異なり一代雑種品種の育種にお いてはほとんど利用されていない｡ ′これは核遺伝子雄性不稔では雄性不稔性が 固定できないからで､不稔系統内で不稔個体と可稔個体が分離する｡核遺伝子 雄性不稔性を一代雑種品種の採種に利用するには､不稔系統内での不稔個体の 選抜が必要となる｡突然変異遺伝子あるいはその連鎖マーカーが分かればそれ を分析することにより不稔個体の選抜が可能となる｡このような方法を利用す るには､一塩基多型の分析を簡易に低コストで行える必要がある｡そこで､ cASSOH法を応用してドットプロット法を一塩基多型が分析できるように改良 し､ドットプロットsNP法を開発した(shirasawa et al. 2006)｡この方法は､極 めて多数の試料を分析できる点は普通のドットプロット法と同様であり､育種 における個体選抜に利用可能である｡ -試料の分析にかかる労力やコストは､ 他の-塩基多型分析法に比べて極めて少ないため､ドットプロットSNP法は核 遺伝子雄性不稔を利用したFl採種に利用が期待される｡ 5.まとめ イネの雄性不稔突然変異遺伝子の解明には到らなかったが､逆遺伝学的突然 変異体の作出技術と独自のSNP分析法の開発により､後半部分の育種技術の構 築においては大きな進展があった｡雄性不稔突然変異遺伝子が解明できれば､ これら技術を利用した独自の一代雑種育種技術が構築出来るものと期待してい る｡

mur型細胞賞雄性不稔性のミトコンドリア側の原田遺伝子解明

アブラナ科野生種Diplotaxis muralis (mur型)の細胞質を有するBrassica

oleracea細胞質雄性不稔性(CMS)の分子機構を明らかにすることを目的とし た｡本研究遂行のため､同じmur型細胞質を持ち､この雄性不稔性を回復させ る核遺伝子をもった回復系統を作成した｡つまり､雄性不稔系統に核遺伝子を 有する他のBrassica oleracea系統を2回戻し交配した後､自殖と選抜を繰り返 して育成した｡これにより､細胞質雄性不稔性の発現に関わるミトコンドリア 側の原因遺伝子と核側の稔性回復遺伝子の解明が可能となった｡ 1.ミトコンドリア側の原田遺伝子の単離 まず､細胞質ドナーであるDiplotaxis muralisからミトコンドリア遺伝子の単 離を行った｡既報のArabidopsis thalianaのミトコンドリア全塩基配列情報を参 考にしてプライマーを作成し､ pCR法によりミトコンドリア遺伝子22個を単 離し､すでに解析済み11遺伝子と合わせ計33遺伝子について周辺領域を解析 した｡ cMS関連遺伝子は既知のミトコンドリア遺伝子と共転写する場合が多い ことが知られているからである｡ 33遺伝子をプローブにサザンプロット分析を行った結果､ cMS系統に検出 できるようなミトコンドリアの構造変異は生じていないこと､またcMS系統 と細胞質ドナー系統には維持系統と異なりatp9遺伝子が2コピー存在すること が明らかとなった｡ ノーザンプロット分析を行った結果､ rps7, rps12及びccb256をプローブとし た時､その発現パターンがcMS系統と細胞質ドナー系統で異なることが明ら かになった｡そこで､稔性回復系統を加えて､さらに検討した結果､ rps7をプ ローブにした時にのみ転写産物の大きさに違いが見られた｡稔性回復系統では cMS系統で得られたよりも短い1400ntのバンドが得られた｡ 細胞質ドナー系統とcMS系統からファージライブラリーを構築し､ tPS7を 含むファージクローンを得て､ rps7を含む9 kbのDNA断片を得た｡このrps7 周辺領域3.5 kbの塩基配列を決定した所､ rps7下流にatp9と相同性の高い部分 を含むoRFを見出したoこのORFは72アミノ酸をコードし､ 5'末端側にorf188 のカルポキシル基末端部分(102 bp)を､ 3'末端側に呼夕のアミノ基末端部分 (89bp)を含んだキメラ構造をとっていた.このORFをolf72と名付けた｡

orf72をプローブとして､ CMS系統､稔性回復系統､細胞質ドナー系統及び 核ドナー系統の膏で発現している全RNAを抽出して､ノーザンプロット分析 を行った｡ cMS特異的な800ntの転写産物と各系統に共通した600ntの転写産 物が得られ､ cMS系統と稔性回復系統･細胞質ドナー系統の間にバンドパター ンの違いが見られた｡      ー aq79をプローブにサザンプロット分析を行うとcMS系統､細胞質ドナー系 統､稔性回復系統にはatp9が2コピー存在したが､ rps7下流に存在するatp9 をatp9-bとし､もう1つのatp9をatp9-aとして､クローニングした｡ atp9-bで はatp9-aに対して､ 2塩基の挿入､ 1塩基の置換が生じ､さらに2塩基の挿入 による終止コドンが形成されていた｡呼クーαが座乗するファージクローンを得 て､ atp9-a周辺1kbの配列を明らかにしたところ､ B. napusのatp9と100%の 相同性を示した.そこで､ atp9-aが本来のatp9であると考えられた｡ oTf72をプローブとした時に大きさの異なる2つの転写産物が得られるため､ orj72を構成する2つの遺伝子由来の各部分においてプローブを作成した｡oTf188 部分のプローブとatp9-b部分のプローブにおいて､ノーザンプロット分析を行 った所､ atp9-b部分のプローブではorf72をプローブとした時と同様の転写産 物が得られ､orf188部分のプローブでは800 ntの転写産物のみが得られた｡800nt の転写産物はCMS系統で強く､回復系統では弱く､細胞質ドナー系統では全 く発現していなかった(shinada et a1. 2006)｡ 2.稔性回復遺伝子羊難のための染色体地図の作成 稔性回復遺伝子の単離を行うためには､マップベースクローニングが最も確 実な方法で､すでにいくつかの稔性回復遺伝子がこの方法により単離されてい るが､ Brassica oleraceaでは詳細な連鎖地図やゲノム情報があまり公開されて いないため､独自にDNAマーカーと連鎖地図を作成する必要があった｡

DNAマーカーは､ Brassica rapaやBrassica napusの公開されているESTの塩

基配列情報及び独自に塩基配列を決定したB. oleraceaのEST塩基配列を用いて

作成した(Inoue and Nishio 2004). B. oleraceaのEST情報で作成したプライマー

は､約75%がB. oleraceaの単一DNAのPCRによる増幅に利用できたが､B. napus のEST情報もB. oleraceaの単一DNAの増幅に有効(60%)であった｡ B. rapa のEST情報によるプライマーは､約半数がB. oleraceaの単一DNAの増幅に利

ど利用できなかった｡増幅したDNAは､連鎖解析に用いたF2の両親であるブ ロッコリーとカイランの間で､ CAPSやpcR-RF-SSCP法の利用により約70% が多型を示した｡ ブロッコリーとカイランのF2を用いて､ 112のDNAマーカーのマッピング を行ったところ､ 10の連鎖群からなる662 cMをカバーする連鎖地図を作成で きた｡ B. oleraceaの配偶体の染色体数は9本であるので､ 10連鎖群のうち少な くとも2つは同一染色体のものと考えられ､更なるDNAマーカーの作成と連 鎖解析が必要と考えられた｡ 稔性回復遺伝子はそのFlおよびF2の分離から優性-遺伝子であると推定で きた｡そこで､この稔性回復遺伝子のマッピングのため､ AFLP分析により連 鎖マーカーを作成した｡この連鎖マーカーを作成した染色体地図に位置づけて いるところである｡ 3.まとめ

mur型cMS Brassica oleraceaのミトコンドリア原因遺伝子候補としてorf72

を単離･同定したo orj72配列は細胞質ドナー系統のミトコンドリアゲノム上に 存在していたが､核遺伝子(稔性回復遺伝子)によってその発現が抑制されて おり､雄性不稔性を誘導しながら核置換を行う過程で稔性回復遺伝子を消失し たことで発現して来たと考えられる｡このorJ72の花粉発達における機能につ いては今後の研究に期待するしかないが､可能性としてはoTP2自身が毒性を もつ場合やorj72が発現することでatp9と相同性の高いatp9lb部分が正常なatp9 に転写後干渉してArP活性を結果的に低下させる場合などが考えられる｡この ように本異質細胞質雄性不稔性は核とミトコンドリアの相互作用をみる事例と しても興味深く､核側の遺伝子(稔性回復遺伝子)の単離が待たれる｡

イネの細胞賞雄性不稔性の稔性回復遺伝子の解明

本研究では､ Chinsurah Boro IIに由来するBorO型cMS､ Chinesewildriceに由

来するCW型cMS､および､ビルマ稲Lead Riceに由来するLD型cMSにつ

いて解析した｡ BorO型CMSでは稔性回復遺伝子のクローニング(Kazama and Toriyama 2003)､および､稔性回復の分子機構解明に関する研究を行った｡ cw 型cMSでは稔性回復遺伝子のファインマッピングを行った(Fu5ii and Toriyama

2005)｡ LD型cMSでは稔性回復遺伝子のラフマッピングを行った｡ 1 BorO型CMSの稔性回復遺伝子のクローニング､および､稔性回復 の分子機構解明 BorO型cMSイネでは, 1個の稔性回復遺伝子RPが第10染色体に座乗するこ とが報告されていた｡また､ミトコンドリアには,正常型のatp6遺伝子(以下 N-atp6)の他に､ BorO型cMSに特異的なatp6-orJ79遺伝子(以下B-atp6)が存 在し､ CMS系統ではatp6-orf79が共転写されて2.0 kbのRNAを生じるが､回 復系統では共転写を受けたRNAがプロセッシングを受けることで､1.5kbのatp6

RNAと0･5 kbのorf79 RNAを生じることが報告されていた｡しかし､ RPはク

ローニングされておらず､ orJ79の翻訳についても明らかにされていなかった｡ 1-1マップベースクローニング法によるRJlのクローニング マップベースクローニングを行う集団としてCMS系統【cms-bo] rflrfl x Fl (cMS系統【cms-bo] rflrfl x回復系統【cms-bo] RPRfl)の交配によって得られた 1121個体のBCIFlを用いた｡公開されている日本晴(rflrfl)の塩基配列情報よ りDNAマーカーを作成し連鎖解析を行った結果､ ssRマーカーcT502で4個 体､ RFLPマーカーGEND713で6個体の組換え個体を選抜することができた｡ これらのマーカーに挟まれる日本晴の領域は､ 4個のBACクローンによってカ ーバ-されており､その物理的距離は約380kbであった｡ Rflタンパク質はミトコンドリアで機能していることが考えられるため､日 本晴ゲノムにおいて上記のマーカーに挟まれる領域に含まれる遺伝子の中で､ ミトコンドリアに移行するものを予測した｡その結果､ 3個の遺伝子が予測さ れた｡これらの遺伝子はいずれもpPR (pentatricopeptide repeat)タンパク質を コードしていると予測されたため､それぞれppR8-1,PPR8-2,PPR8-3と名付け

た｡ ppRタンパク質とは､ 35アミノ酸からなる繰り返し配列を持つタンパク 質のことで､葉緑体やミトコンドリアにおいてRNAの転写後制御に関与して いると予測されている｡日本晴で見つけた3個のPPR遺伝子の回復系統にお ける対立遺伝子をRP候補遺伝子と予想した○ 回復系統の1つである密陽23 号のBACクローンよりそれぞれのONA断片をクローニングし､アグロバク テリウム法を用いてCMSイネヘ導入して､相補性試験を行った.遺伝子導入を

行ったカルスより全RNAを抽出し､ B-atp6 RNAの転写パターンをノーザンプ

ロット分析で調べた結果､ ppR8-1を導入したカルスでのみ0･5 kb orJ79RNA が検出され､プロセッシングが起ることが分かった｡プロセッシングの有無の 検出に注目したスクリーニング法により､カルスの段階で迅速に候補遺伝子を PPR8-1に絞り込むことができた｡さらに､ppR811遺伝子導入個体は,花粉稔性･ 種子稔性ともに回復することも明らかとなった｡これよりppR8-1がRJ7である ことを証明できた｡ クローニングしたRPの塩基配列を決定したところ､ 2376 bpで791アミノ 酸からなるタンパク質をコードしており､ 18繰り返しのPPRモチーフを含ん でいたoこの配列と日本晴の41を比較したところ, 'flでは1 bpの欠失により フレームシフトを起こし､終止コドンが生じていた｡さらに､ RflのN末端領 域が,推定ミトコンドリア移行シグナルをコードしているかどうかを､ GFPと の融合コンストラクトを用いてパーティクルガン法で調査した｡この結果､GFP はミトコンドリアに局在しており､ Rflはミトコンドリアに移行することが示 された｡ ト2 CMSの原因タンパク質とRflの機能 プライマー伸長法により､ B-atp6RNAのプロセッシング部位を決定した｡こ の結果､ od79の開始コドンより52 bp上流にプロセッシング部位が存在するこ とが分かった｡プロセッシングサイトを含む400nt RNAの2次構造を構造予測 ソフトによって予測した結果､プロセッシングサイトは2つのステムループに 挟まれる一本鎖領域に位置することが分かった｡さらに､大腸菌で生成させた Rflリコンビナントタンパク質と､この衛域をプローブにゲルシフトアッセイ を行った結果､この領域とリコンビナントRflとの結合が確認された｡ oTf79遺伝子がタンパク質として発現可能な遺伝子であるかどうかを調べるた めに､真核生物型および原核細胞型のinvitro翻訳系において､タンパク質の

翻訳について調べた｡この結果､原核生物型のinvitro翻訳系においてのみ翻訳 産物が検出できたので､ orj79遺伝子はミトコンドリアにおいて翻訳可能な遺伝 子構造を持っていると考えられた｡また,原核生物型のinvitro翻訳系では､プ ロセッシングを受けたorj79の方が､プロセッシングを受ける前よりも翻訳産 物が少ないことも分かった｡ orJ79の5'側85 bpはcoxI (シトクロムオキシダ ーゼ･サブユニットⅠ)と相同性が高く､後半部は既知の配列と相同性が見ら れない. coxI相同領域を除いたorJ79の後半部(oRF79DN)を大腸菌で発現さ せてリコンビナントタンパク質を得た｡これを抗原として抗体を作成し､ウエ スタンプロット分析を行ったoこの結果､RjIホモの回復系統においては､ oRF79 の蓄積が観東されなかった｡さらに､ Rj7遺伝子導入個体ではcMS系統の半分 までORF79の量が減少していることが明らかになった｡一方､ ATP6の蓄積量 はどちらの系統においても変化がなかった｡このことはoRF79の蓄積がcMS を引き起こし､ RflによるB-atp6 RNAのプロセッシングによりORF79の翻訳 が減少するために､稔性が回復することを示している｡ 2 CW型CMSとLD型CMSの稔性回復遺伝子のマッピング cw型cMSの稔性回復遺伝子Rfcwの連鎖解析を進め､第4染色体のSSRマ ーカーRM3866(70.9 cM)とRM1388(77.9 cM)の存在することを明らかにした｡ さらにファインマッピングを行ない､ 77kb以内に絞り込んだ｡ LD型cMSの稔性回復遺伝子RJ2のラフマッピングを進め､第2染色体の43.4 cMと50.OcMのマーカーの間に存在することを明らかにした｡ 3 まとめ CMSはF.雑種品種の育成に利用できるため､世界中で研究されている｡本 研究と同時期にペチュニアとコセナダイコンのCMSにおいて稔性回復遺伝子 がクローニングされ､いずれもppR遺伝子であることが報告された｡本研究で は､世界に先駆けて稔性回復遺伝子RJIをクローニングした｡また､ DNAマー カーを用いたRfcwとRJ2のマッピングはこれまで報告されていない｡本研究を 発展させることにより､ RfcwとRJ2のクローニングが可能である｡

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