*物質工学科 **沼津高専物質工学科 ***長岡技科大生物機能工学専攻
アントシアニジン合成系遺伝子 DFR の系統解析
大岡久子
*浦部健気
*古川一実
**高原美規
***（2019 年 1 月 7 日受理）
１．はじめに
植 物 は 多種 多 様な 色 を持つ が ，こ れ らの 色 の発 色 団 と な る色 素 は，ク ロロフ ィ ル 類，カ ロテ ノ イド類 ， フ ラ ボ ノイ ド 類に 大 別する こ と がで き る．多く の植 物 の 緑 葉 に 含 ま れ る ク ロ ロ フ ィ ル や カ ロ テ ノ イ ド は ，光合 成 色素 と して 植物 の み なら ず 生態 系 全体に お い て 重要 な 役割 を 果たし て い る．一 方で ，花 や果 実 ，葉 や茎 に 含ま れ るフラ ボ ノ イド 色 素は ，２つの 芳 香 環 が ３ つ の 炭 素 で 結 合 し た 基 本 構 造 を も つ フ ェ ノ ー ル性 化 合物 で あり，種 類に よ って さ まざ まな 色 調 を 示す ．フ ラ ボノ イド 色 素 とし て もっ と も広く 存 在 し てい る のが ア ントシ ア ニ ンで あ る 1)． 果 実 や 花に 含 まれ る アント シ ア ニン は ，動 物 との 相 互 作 用に お いて 重 要な役 割 を 果た し てい る．植物 は 生 産 者で あ り，動物 にと っ て 摂食 の 対象 と なる一 方 で ，植 物 も花 粉 の媒 介や 種 子 の散 布 に動 物 を利用 し て い る．ア ント シ アニン の 色 素は ，視覚 的 に動物 を 誘 引 する 役 割を 担 う色素 で あ る 1)． さ ら に， アン ト シ ア ニン の 種類 は，園芸 的 価 値に お いて 重 要な 花 色 を 左 右し ，青 い バラ を代 表 と して そ の色 調 の改変 が 近 年 産業 的 にも 重 要とな っ て いる 2)． ア ン ト シア ニ ンの ア グリコ ン は アン ト シア ニ ジン と 呼 ば れ，３分 子 のマ ロン 酸 由 来の A 環と フ ェニル ア ラ ニ ン由 来の B 環か ら構 成 さ れて い る． B 環の水 酸 化 や メチ ル 化な ど の修飾 パ タ ーン ，糖 や 有機 酸の 付 加 ，蓄積 し てい る 液胞の pH な どに よ って ，アン ト シ ア ニ ンの 色 調は 影 響を受 け る 1)3)．一 般 的 に，ペラ ル ゴ ニ ジン 系 アン ト シアニ ン は 橙色 ～ 赤色 ，シ アニ ジ ン 系 アン ト シア ニ ンは 赤 色 ～ 深紅 ，デ ル フィ ニジ ン 系 ア ン ト シ ア ニ ン は 赤 紫 色 ～ 藤 色 ～ 青 色 を 呈 す る3)4)．こ の よ うに ア ント シ ア ニン の 色調 に は，そ の 基 本 と な る ア ン ト シ ア ニ ジ ン の 構 造 が 大 き く 影 響 し て い る．この ３ 種類 のア ン ト シア ニ ジン の 合成 経 路 を図 １ に 示す ．それ ぞれ の 反 応を 触 媒す る 酵素を 略 号 で 示し（ CHS；カルコ ン 合 成酵 素 ．CHI；カル コ ン イ ソ メラ ー ゼ． F3H；フ ラ バ ノン 3-ヒ ド ロキシ ラ ー ゼ ． F3'H； フラ ボ ノイド 3'-ヒ ド ロキ シ ラー ゼ． F3'5'H； フ ラ ボ ノ イ ド 3',5'-ヒ ド ロ キ シ ラ ー ゼ ． DFR；ジ ヒ ド ロフ ラ ボノー ル 4-レダ ク ター ゼ．ANS； ア ン ト シア ニ ジン 合 成酵素 ．FGT;フ ラボ ノ イド グル コ シ ル トラ ン スフ ェ ラーゼ ．）3)4)5)，点 線 の 四 角 で囲 ん だ ．３ 種類 の ア ント シア ニ ジ ンは ，ク マ ロイ ル CoA と ３ 分 子の マ ロニ ル CoA か ら い くつ か の段 階 を経て 合 成 さ れる が，ど の種 類の ア ン トシ ア ニジ ン が合成 さ れ る かは ， DFR がど のジ ヒ ド ロフ ラ ボノ ー ルに対 し て 高 い基 質 特異 性 を示す か に よ る 6)． こ の DFR の 基 質 特 異 性 に つ い て は い く つ か の 知 見 が あ る も の の そ の 分 子 生 物 学 的 メ カ ニ ズ ム は 明 ら か に さ れ て い な い 5)7)．し か し ，最 終的 な ア ント シ アニ ン の色調 を 決 定 する 因 子と し て，ア ン ト シア ニ ジン 合 成系に お け る DFR の 役割 は 非常に 大 き いと 考 えら れ る． 図１ アントシアニジン合成経路そ こ で 本研 究 では ，植 物の 色 素 合成 系 の鍵 と なる 酵 素 の １つ で ある DFR につ い て，多 くの 植 物種 から 単 離 さ れ た 既 知 遺 伝 子 の ア ミ ノ 酸 配 列 を も と に 系 統 解 析 を行 っ た．
２．研究方法
２ ． １ DFR の 配 列 情 報 の 収 集 DFR の アミ ノ 酸配 列 情報は NCBI8)よ り 収 集 した ． こ れ ま で に 花 色 に 関 す る 研 究 が 進 め ら れ て い る 品 種 を 中 心に 62 種類 の 植物 か ら，170 クロ ー ンのア ミ ノ 酸 配 列を 収 集し 解 析に用 い た．収 集し た クロ ーン は 植 物 種名 に 従い ク ローン 名 を つ け た．ク ロー ン数 な ど の 情報 を表 １ に示 した ．収 集し た クロ ー ンのう ち ，エ キソ ン -イ ン トロン 情 報 があ る もの に は，ク ロ ー ン 名 の最 後 に“ +”を表 記 し た ．ま た表 １ の LOCUS と SOURCE は NCBI に 登録さ れ て いる 情 報で あ る． ２ ． ２ ア ラ イ メ ン ト 解 析 と 系 統 解 析 ア ラ イ メ ン ト 解 析 と 系 統 解 析 は ， CLUSTAL X （ ver.2.1）9)を 用 い て行っ た ．系 統解 析 は ，近 隣結 合 （ Neighbor Joining； NJ） 法 を用 い て， ブ ートス ト ラ ッ プ解 析は 1000 回の サ ン プリ ン グに よ り行っ た ．ま た ，平 均距 離 （ Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean； UPGMA）法 で も解 析 を行 っ た ．系 統 樹 の描 画 は ，NJplot（ ver.2.3）を 用いた ． CLUSTAL X に よ る ア ラ イ メ ン ト 解 析 後 ， GeneDoc （ ver.2.7.000）の Conserved モ ード を 用い て ，共通 配 列 を 示し た ．３．結果と考察
収 集 し た ク ロ ー ン の ア ミ ノ 酸 配 列 を ア ラ イ メ ン ト 解 析 した 結 果，収 集した 170 クロ ー ンの う ち，ア ミ ノ 酸 配列 が 同じ も のがあ る こ とが 分 かっ た．これ ら を 整 理し て １つ の アミノ 酸 配 列と し，重 複が ない 139 のア ミ ノ酸 配 列に つい て 再 度ア ラ イメ ン ト解析 を 行 っ た． こ の結 果 から 得 ら れた NJ 法 に よる 系統 樹 を図 ２ に 示し た ．重 複の あ る クロ ー ンは ス ラッシ ュ に よ り区 切 り並 列 して示 し た ．図 ２ の 系 統樹 より ， 各 ク ロ ーン の 結合 距 離が近 く ，多 く の植 物 で DFR の 相 同 性 が高 い こと が 明らか に さ れた ． これ らの DFR の ク ロ ーン を ，相 同 性の高 さ ，ブー ト スト ラ ップ値 ， UPGMA 法に よ る系 統 解析を 考 慮 して ，10 の グル ープ に 分 類 し， Group I～ Group X と 名付 け た（図 ２ ）．Group I と V に 属 する DFR は ，Fragaria属 の みか ら な る グル ー プで あ ること が 分 かっ た ．ま た ，Group II は Rosa属 のみ か らなり ， Group III はPrunus属 の み か らな る こと が 分かっ た ．こ の よう に いく つか の グ ル ープ は 同属 の みから な り，そ れぞ れ の 属 の特 徴 を 示 して い るこ と が推測 さ れ る．し かし ，そ の 他 の グ ル ープ は，い くつ かの 植 物 種か ら なる グ ループ で あ り，属 を超 え て DRF の 保 存 性が 高 いこ と が示さ れ た ． 次 に ， グ ル ー プ ご と に ア ラ イ メ ン ト 解 析 を 行 い ， GeneDoc を もと に 保存 性の 高 い アミ ノ 酸配 列 を 選抜 し ，各 グル ー プの 共 通配列 と し た．各 グル ー プの共 通 配 列 を用 い てア ラ イメン ト 解 析を 行 い，その 結果 を GenDoc を 用 いて 示 した（図 ３ ）．図 ３ で は，そ れ ぞ れ の グ ル ー プ の 共 通 配 列 に お い て 保 存 性 の 高 い ア ミ ノ 酸を ，アラ イ メント 配 列 の下 に 示し た ．さら に ，それ ぞ れの グ ルー プご と に エキ ソ ン‐ イ ントロ ン 情 報 が あ る ク ロ ー ン の ア ミ ノ 酸 配 列 に お け る イ ン ト ロ ンサ イ トを 確 認し，図 ３ の 配 列内 に 線で 示し ， さ ら に 保 存 性 の 高 い イ ン ト ロ ン サ イ ト を ア ラ イ メ ン ト 配 列の 上 部に 矢 印で示 し た ． Group VII に おい て は ，イ ン トロ ン サイ トが 分 か るク ロ ーン が なくイ ン ト ロ ンサ イ トを 示 してい な い が，アラ イ メン ト解 析 の 結 果 か ら 矢 印 で 示 し た 部 分 に イ ン ト ロ ン サ イ ト が あ ると 考 えら れ る．図 ３ の２ 段 目中 央 付近 の点 線 の 四 角で 囲 まれ た 部分は ， DFR の 基質 特 異性 に関 与 す る と推 測 され る 範囲で あ り，三 角で 示 した アラ イ メ ン ト配 列で 157 番 目の ア ミ ノ酸 は 特に 発 色に関 し て 重 要な ア ミノ 酸 である と さ れて い る 7)． 図 ３ に 示 し た 共 通 配 列 の ア ラ イ メ ン ト 解 析 で は ， す べ て のグ ル ープ に おいて 共 通 にみ ら れる ア ミノ
表１ 収集した DFR の情報
クローン名 LOCUS SOURCE クローン数 クローン名 LOCUS SOURCE クローン数 AcDFR001 KF157393 Actinidia chinensis 1 PnDFR001 KM388826 Penstemon neomexicanus 1 AaDFR001 KF285561 Angelonia angustifolia PfDFR001 AB002817 Perilla frutescens 1 AaDFR002 KJ817183 Angelonia angustifolia PhydDFR001 AB070932 Persicaria hydropiper 1 AtDFR001 AK221622 Arabidopsis thaliana (thale cress) PhybDFR001 EU189078 Petunia x hybrida
AtDFR002 NM_001203924 Arabidopsis thaliana (thale cress) PhybDFR002 KC464483 Petunia x hybrida AtDFR003 NM_001343878 Arabidopsis thaliana (thale cress) PhybDFR003 KC464484 Petunia x hybrida AtDFR004 NM_104854 Arabidopsis thaliana (thale cress) PhybDFR004 KC464485 Petunia x hybrida
AtDFR005 NM_117050 Arabidopsis thaliana (thale cress) PamDFR001 AB128768 Phytolacca americana (American pokeweed) 1 AtDFR006 NM_118859 Arabidopsis thaliana (thale cress) ParDFR001 JQ622229 Prunus armeniaca (apricot) 1 AtDFR007 NM_119708 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR001 GU990528 Prunus avium (sweet cherry)
AtDFR008 NM_122360 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR002 JF740093 Prunus avium (sweet cherry) AtDFR009+ NM_123645 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR003 KP347504 Prunus avium (sweet cherry) AtDFR010 NM_130102 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR004 KP347505 Prunus avium (sweet cherry) AtDFR011 NM_130314 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR005+ XM_021964510 Prunus avium (sweet cherry) AtDFR012 NM_180738 Arabidopsis thaliana (thale cress) PavDFR006+ XM_021975874 Prunus avium (sweet cherry)
AtDFR013 NM_180739 Arabidopsis thaliana (thale cress) PceDFR001 KP772277 Prunus cerasifera (cherry plum) 1 BvDFR001+ XM_010674949 Beta vulgaris subsp. Vulgaris PmDFR001+ XM_016792478 Prunus mume (Japanese apricot) 1 BvDFR002+ XM_010675370 Beta vulgaris subsp. Vulgaris PpbDFR001 HM543571 Prunus persica (blood flesh peach) 1 BvDFR003+ XM_010685621 Beta vulgaris subsp. Vulgaris PppDFR001 JQ622239 Prunus persica (peach)
CjDFR001 AB524885 Camellia japonica 1 PppDFR002 JQ717268 Prunus persica (peach) CsDFR001 AB018685 Camellia sinensis PppDFR003 KJ484545 Prunus persica (peach) CsDFR002 AB018686 Camellia sinensis PppDFR004 KJ484550 Prunus persica (peach) CsDFR003 AY574920 Camellia sinensis PppDFR005+ XM_007211452 Prunus persica (peach) CsDFR004 AY648027 Camellia sinensis PppDFR006+ XM_007222255 Prunus persica (peach) CqDFR001+ XM_021873902 Chenopodium quinoa (quinoa) PppDFR007+ XM_020567318 Prunus persica (peach) CqDFR002+ XM_021873903 Chenopodium quinoa (quinoa) PsDFR001 KP266869 Prunus salicina CqDFR003+ XM_021887285 Chenopodium quinoa (quinoa) PsDFR002 KT597918 Prunus salicina CqDFR004+ XM_021887296 Chenopodium quinoa (quinoa) PcoDFR001 AY227730 Pyrus communis (pear) CqDFR005+ XM_021887297 Chenopodium quinoa (quinoa) PcoDFR002 AY227731 Pyrus communis (pear) CmDFR001 AY786995 Crataegus monogyna 1 PcoDFR003 AY227732 Pyrus communis (pear) CgDFR001 AB517921 Cyclamen graecum PcoDFR004 JX403952 Pyrus communis (pear) CgDFR002 AB517922 Cyclamen graecum PcoDFR005 JX403953 Pyrus communis (pear) DcDFR001 LC377195 Dianthus caryophyllus (clove pink) PcoDFR006 KC460395 Pyrus communis (pear)
DcDFR002 Z67983 Dianthus caryophyllus (clove pink) PpyDFR001 JN870840 Pyrus pyrifolia 1 DgDFR001 AF291097 Dianthus gratianopolitanus 1 PbrDFR001 KF387514 Pyrus x bretschneideri (Chinese white pear)
DpDFR001 AF267172 Dianthus plumarius 1 PbrDFR002 KF387515 Pyrus x bretschneideri (Chinese white pear) DkDFR001 AB472371 Diospyros kaki (kaki persimmon) PbrDFR003+ XM_009366816 Pyrus x bretschneideri (Chinese white pear) DkDFR002 AB472373 Diospyros kaki (kaki persimmon) RcDFR001 KF734592 Rosa chinensis
DkDFR003 AB472374 Diospyros kaki (kaki persimmon) RcDFR002+ XM_024311351 Rosa chinensis EeDFR001 AB078958 Eustoma exaltatum subsp. Russellianum 1 RcDFR003+ XM_024311994 Rosa chinensis FcyDFR001 EF522145 Fagopyrum cymosum 1 RcDFR004+ XM_024311995 Rosa chinensis FeDFR001 LC216398 Fagopyrum esculentum subsp. Esculentum RcDFR005+ XM_024312234 Rosa chinensis FeDFR002 LC216399 Fagopyrum esculentum subsp. Esculentum RcDFR006+ XM_024312235 Rosa chinensis
FiDFR001 X97131 Forsythia x intermedia RpDFR001 AB289595 Rhododendron x pulchrum 1 FiDFR002 Y09127 Forsythia x intermedia RhDFR001 AB239785 Rosa hybrid cultivar
FchDFR001 HM026184 Fragaria chiloensis 1 RhDFR002 AB239796 Rosa hybrid cultivar FvDFR001 KC894042 Fragaria vesca (wild strawberry) RhDFR003 AB490072 Rosa hybrid cultivar FvDFR002 KC894043 Fragaria vesca (wild strawberry) RhDFR004 AY780885 Rosa hybrid cultivar FvDFR003 KC894044 Fragaria vesca (wild strawberry) RhDFR005 ROZD4R Rosa hybrid cultivar
FvDFR004 KC894045 Fragaria vesca (wild strawberry) RmDFR001 KP137549 Rosa multiflora 1 FvDFR005 KC894046 Fragaria vesca (wild strawberry) RrDFR001 KM203111 Rosa rugosa
FvDFR006 KC894049 Fragaria vesca (wild strawberry) RrDFR002 KT809350 Rosa rugosa
FvDFR007 KC894050 Fragaria vesca (wild strawberry) ShDFR001 LC269960 [Saintpaulia] hybrid cultivar 1 FvDFR008 KC894051 Fragaria vesca (wild strawberry) SvDFR001 FJ605512 Scutellaria viscidula 1 FvDFR009 KC894052 Fragaria vesca (wild strawberry) SiDFR001+ XM_011084901 Sesamum indicum (sesame)
FvDFR010 KC894053 Fragaria vesca (wild strawberry) SiDFR002+ XM_011085563 Sesamum indicum (sesame) FvDFR011 KC894056 Fragaria vesca (wild strawberry) SiDFR003+ XM_011085564 Sesamum indicum (sesame)
FvDFR012 KC894057 Fragaria vesca (wild strawberry) SliDFR001 KT954905 Silene littorea 1 FvDFR013 KC894058 Fragaria vesca (wild strawberry) SlyDFR001+ NM_001247479 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FvDFR014 KC894059 Fragaria vesca (wild strawberry) SlyDFR002+ XM_004251441 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FvDFR015+ NM_001305268 Fragaria vesca (wild strawberry) SlyDFR003+ XM_004252721 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FvDFR016+ NM_001305270 Fragaria vesca (wild strawberry) SlyDFR004+ XM_010315353 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FaDFR001 AB201759 Fragaria x ananassa (strawberry) SlyDFR005+ XM_010316315 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FaDFR002 AF029685 Fragaria x ananassa (strawberry) SlyDFR006+ XM_010317577 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FaDFR003 AY695812 Fragaria x ananassa (strawberry) SlyDFR007 Z18277 Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) FaDFR004 AY780884 Fragaria x ananassa (strawberry) SmDFR001 AB269920 Solanum melongena (eggplant)
FaDFR005 JX134094 Fragaria x ananassa (strawberry) SmDFR002 KT119429 Solanum melongena (eggplant)
FaDFR006 KC894047 Fragaria x ananassa (strawberry) SpDFR001 AY954031 Solanum pinnatisectum (tansyleaf nightshade) FaDFR007 KC894048 Fragaria x ananassa (strawberry) SpDFR002 AY954035 Solanum pinnatisectum (tansyleaf nightshade) FaDFR008 KC894054 Fragaria x ananassa (strawberry) StDFR001 AY289921 Solanum tuberosum (potato)
FaDFR009 KC894055 Fragaria x ananassa (strawberry) StDFR002 AY289922 Solanum tuberosum (potato) GyDFR001 AY256381 Gypsophila elegans 1 StDFR003 JF754579 Solanum tuberosum (potato) HlDFR001 AB290349 Humulus lupulus (European hop) 1 StDFR004 JQ581654 Solanum tuberosum (potato) IhDFR001 AB304917 Iris x hollandica StDFR005 NM_001288059 Solanum tuberosum (potato) IhDFR002 AB332098 Iris x hollandica StDFR006 NM_001288480 Solanum tuberosum (potato)
MdDFR001 AY227728 Malus domestica (apple) SsDFR001 EF522155 Solenostemon scutellarioides 1 MdDFR002 AY227729 Malus domestica (apple) SoDFR001 AB109016 Spinacia oleracea (spinach)
MdDFR003+ NM_001293939 Malus domestica (apple) SoDFR002+ XM_021981251 Spinacia oleracea (spinach) MnDFR001+ XM_010093760 Morus notabilis SoDFR003+ XM_021999632 Spinacia oleracea (spinach)
MnDFR002+ XM_010099329 Morus notabilis ThDFR001 AB012924 Torenia hybrid cultivar 1 MnDFR003+ XM_010111750 Morus notabilis VaDFR001 AB610763 Vaccinium ashei 1 MnDFR004+ XM_024174542 Morus notabilis VcDFR001 KF960989 Vaccinium corymbosum 1 OeDFR001+ XM_023024096 Olea europaea var. sylvestris VmaDFR001 AY780883 Vaccinium macrocarpon 1 OeDFR002+ XM_023024097 Olea europaea var. sylvestris VmyDFR001 AY123767 Vaccinium myrtillus 1 OeDFR003+ XM_023039626 Olea europaea var. sylvestris
PbaDFR001 KM388827 Penstemon barbatus 1 170 3 6 3 2 合計 2 6 6 2 2 2 3 3 3 4 6 3 7 3 7 9 4 2 5 2 2 2 5 13 16 4 2
図３ グ ループ ごとの D FR 共通配列 を用い たアラ イメ ント解析 結果
酸 が い くつ か 確認 さ れた． Group IX と X の共 通配 列 の 相 同性 は 他の グ ループ と 比 較す る と低 い が ，図 ２ の 系 統 樹 に お い て も こ の ２ つ の グ ル ー プ は 離 れ て お り，こ の差 が アミ ノ酸 配 列 レベ ル で示 さ れたも の で あ ると 考 えら れ る．さ ら に イン ト ロン サ イト に お い て も， Group I～ VIII に お いて は 高い 保 存性が 示 さ れ たが ，Group IX と X に お いて は 数ア ミ ノ酸ほ ど の ズ レが 生 じて い た． DFR の基 質 特異 性 の決 定に 関 与 す ると さ れて い る領域 は ，第 ３ エキ ソ ンの C 末 端 側 に 存在 す るこ と が分か っ た．Eric ら（ 2001）の 研 究 に おい て は，この 領域 は ６ 種類 の 植物 の DFR の ア ラ イ メ ン ト 解 析 を 行 う こ と で 相 同 性 の 高 さ が 示 さ れ て いた が，本 研究 で行 っ た さら に 多く の 植物種 を 用 い た網 羅 的な 解 析にお い て は，この 領 域の 保存 性 は そ れほ ど 高く な いこと が 明 らか に され た．言い 換 え る と，この 領 域の 多様 性 が DFR の 基質 特 異性に 影 響 を 与え て いる と 考えら れ る ． さ ら に Eric らの 研 究にお い て ，図 ３ の 三 角で 示 し た ア ライ メ ント 配 列にお け る 157 番目 の アミ ノ酸 を 疎 水 性ア ミ ノ酸 で 置き換 え る こと に よっ て，発色 が 変 わ るこ と が明 ら かにさ れ て いる （ 文献7)の ク ロ ー ン で は 134 番 目 の ア ミ ノ 酸 ）． 本 研 究 に お け る Group V と X に お いて は， 他 の 多く の グル ー プでは ア ス パ ラギ ン（N）とな って い る 157 番 目の ア ミノ酸 残 基 が ，疎水 性 のア ラ ニン（ A）と グ リシ ン（ G）で あ り ，こ の グル ー プ V と X に 属 する DFR が 基 質とす る ジ ヒ ドロ フ ラボ ノ ールが 何 で ある か，ま たそ の後 ど の よ うな 色 調を 示 すのか 興 味 深い ．
４．まとめ
本 研 究 にお い て，多く の植 物 種 にお け る DFR のア ミ ノ 酸 配列 の 相同 性 が高い こ と が示 さ れ，多く の植 物 間 で 保存 性 が高 い ことが 明 ら かに さ れた ．ア ント シ ア ニ ン の 生 合 成 経 路 は 多 く の 植 物 で ほ ぼ 共 通 し て い る こと が 知ら れ ている こ と から も ，今 後，今回 明 ら か にさ れた DFR の保 存 性 の高 い 部分 を もとに ， こ れ ま でに DFR の クロ ーニ ン グ にな さ れて い ない多 く の 植 物に お いて も DFR 遺 伝 子 のク ロ ーニ ン グが可 能 に な ると 考 えら れ る．さ ら に 多く の 植物 種で DFR の 解 析 が進 む こと に よって ， DFR の 基質 特 異性 とア ン ト シ アニ ジ ン合 成，発色 や 色 調の 関 係が 明 らかに さ れ る と期 待 でき る ． 謝 辞 本 研 究 は，平成 30 年度高 専 -長 岡技 術 科学 大 学共 同 研 究 助成 を 受け た もので あ る ． 参 考 文 献 1) L. テ イ ツ , E. ザ イ ガ ー ： 植 物 生 理 学 第 3 版 ，培 風 館 ， pp.290-298, 2010.2) Yukihisa Katsumoto, Masako Fukuchi-Mizutani, Yuko Fukui, Filippa Brugliera, Timothy A. Holton, Mirko Karan, Noriko Nakamura, Keiko Yonekura-Sakakibara, Junichi Togami, Alix Pigeaire, Guo-Qing Tao, Narender S. Nehra, Chin-Yi Lu, Barry K. Dyson, Shinzo Tsuda, Toshihiko Ashikari, Takaaki Kusumi, John G. Mason and Yoshikazu Tanaka： Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin, Plant Cell Physiol., 48(11), pp.1589–1600, 2007.
3) 芦 田 坦 ，作 田 正 明：植 物 分 子 細 胞 生 物 学 ，オ ー ム 社 ， pp.147-152，2004．
4) Bob B. Buchanan, Wilhelm Gruissem, Russell L. Jones：植 物 の 生 化 学・分 子 生 物 学 ，学 会 出 版 セ ン タ ー ， pp.1180-1185, 2005. 5) 中 山 亨 ，兪東 燦 ，高 橋 征 司：メ タ ボ ロ ン …植 物二 次 代 謝 工学 に おけ る インパ ク ト ，生 物 工学 ，第 90 巻 ， 第 9 号 ， pp.576-581， 2012． 6) 大 庭 理 一 郎 ，五 十 嵐 喜 治 ，津 久 井 亜 紀 夫：ア ン ト シ ア ニ ン－ 食 品の 色 と健康 － ，建帛 社 ，pp.27-28， 2000．
7) Eric T. Johson, Sunhyo Ryu, Hankuil Yi, Byongc Shin, Hyeonsook Cheong and Giltsu Choi： Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of
dihydroflavonol 4-reductase ， The Plant Journal, 25(3), pp.325-333, 2001.
8) NCBI （ National Center for Biotechnology Information）， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
9) M.A. Larkin, G. Blackshields, N.P. Brown, R. Chenna,
P.A. McGettigan, H. McWilliam, F. Valentin, I.M. Wallace, A. Wilm, R. Lopez, J.D. Thompson, T.J. Gibson, D.G. Higgins ： Clustal W and Clustal X version 2.0, Bioinformatics, 23(21), pp.2947-48, 2007.
Phylogenetic Analysis of DFR Genes Involved
in Anthocyanidin Synthesis Pathway
Hisako OOKA, Tatsuki URABE, Kazumi FURUKAWA and Yoshinori TAKAHARA
Plants have various color pigments. Many plants have fruits and flowers of vivid colors such as orange, red, purple and blue. Anthocyanins with anthocyanidins as aglycone are one group of plant pigments. Each type of anthocyanidins is determined by the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) in its biosynthetic pathway and has a major influence on the determination of plant color. We performed a phylogenetic analysis of DFR genes, which are key enzymes of this anthocyanidin biosynthesis pathway. We collected 170 DFR clones in various plants by browsing database (NCBI). The collected DFRs were classified into ten groups according to sequence similarity. The consensus sequences within each group were aligned, and amino acids involved in the responsible region for determination of the substrate specificity of DFR have been shown. In addition, DFR's intron sites were highly conserved. These results would be useful to unveil the relationship between DFR and plant pigments.
