Boro型細胞質雄性不稔イネに対する稔性回復遺伝子
Rf1の機能解析
著者
風間 智彦
号
850
発行年
2005
URL
http://hdl.handle.net/10097/16467
氏
名(本 籍)
学 位 の 種 類
学 位 記 番 号
学位授与年月 日
学位授与の要件
研 究 科 専 攻
学 位 論 文 題 目
論 文 審 査 委 員
か ざ ま とも ひ ご 風 間 智 彦 博 士(農 学) 農 博 第850号 平 成18年3月24目 学 位 規 則 第4条 第1項 該 当 農 学研 究科 応用 生命 科学 専攻 (博士課程) Boro型 細胞 質 雄 性 不 稔 イネ に対 す る稔性 回復 遺伝 子1蝦の機能騨
(主 査)教 授 鳥 山 (副 査)教 授 西 尾 教 授 山 谷欽
哉
剛
知
行
論
文
内
容
要
旨
緒 言 細 胞 質 雄 性 不 稔性(cytoplasmicmalesterility:以 下CMS)は,細 胞 質(ミ トコ ン ドリ ア)と 核 ゲ ノム の 特 定 の組 み 合 わせ で 花 粉 の発 育不 全 を 引 き起 こす 現 象 で あ る.CMSの 一 部 にお いて は,花 粉 稔 性 を回 復 させ る核 コ ー ドの 遺伝 子 が 存 在 す る 場 合 が あ り,こ れ は 稔 性 回 復 遺 伝 子(fertilityrestorergene:以 下 効 とよ ば れ て い る. 本 研 究 に用 い たBoro型CMSイ ネ で は,1個 の 稔 性 回復遺 伝 子 瑠 が第10染 色 体 に座 乗 す る こ とが報 告 され て いた(図1-1).ま た,一ミ トコ ン ドリア には,正 常型 の α㌍6遺 伝 子(以 下N-o♂p6)の 他 に,Boro型CMSに 特 異 的 な α{p6-oη79遺伝
子(以 下B一 α功6)が 存 在 し,CMS系 統 で は ￠p6-oη`79が 共 転 写 されて2.Okbの RNAを 生 じる が,回 復 系統 で は 共転 写 を受 け たRNAが プ ロセ ッシ ン グ を受 け る こ とで,1.5kbの の6RNAと0.5kbのoη79RNAを 生 じ る こ とが 報 告 され て い た(図1-2) ..し か し,1ヴ1は ク ロー ニ ング され て お らず,oηF79の 翻 訳 につ いて も 明 らか に され て い な か っ た. 本研 究 は,Boro型 細 胞 質CMSイ ネ に対 す る稔 性 回復 遺 伝 子 瑠 の機 能 解 析 を 目的 と して,マ ップベ ー ス ク ロー ニ ング法 によ って,瑠 の ク ロー ニ ング を行 い (第1章),ミ トコ ン ドリア にお け る 瑚 タ ンパ ク質 の機 能 に つ いて,分 子 レベ ル で:解析 を行 った(第2章).次 に,ミ トコ ン ドリア にお け るArp6とORF79 の翻 訳 に つ いて解 析 し,CMSの 原 因 につ いて考 察 した(第3章).さ らに,瑚 遺 伝 子 座 の近 傍 に存 在 す る類 似 の遺 伝 子 との 比較 よ り,瑠 遺 伝 子 の進 化 につ いて 考 察 した(第4章). 第1章 マ ップベ ー ス ク ロー ニ ン グ法 に よ る 瑠 の ク ロー ニ ング 本 研 究 で 材 料 と して 用 いた イ ネ の 遺 伝 子 型 と稔性 を表L1に 示 した.マ ップ ベ
ー ス ク ロー ニ ン グ を行 う集 団 は,CMS系 統 【α鰐一わo】魂 ヴ1xFI(CMS系 統 【c〃∬一うo】
げ1魂x回 復 系統 【c脚一わo】1切1切)の 交 配 に よ って得 られ た1121個 体 のBCIF1を
用 い た(図 レ3).こ の集 団 を用 い る こ とで効 率 よ く組 換 え 花 粉 に 由来 す る個 体
を選 抜 す る こ とが で き る.
公 開 され て い る 日本 晴(ヴ1∼ガ)の 塩 基 配列 情 報 よ り,DNAマ ー カ ー を作 成 し
で6個 体 の組 換 え個 体 を選 抜 す る こ とが で きた.そ れ ぞ れ の マ ー カ ー と 解 との 遺 伝 的距 離 を算 出 した と こ ろ,Cr502は0.36cMで あ りGEND713は α54cMで あ った.こ れ らの マー カ ー に挟 まれ る 日本 晴 の領 域 は,4個 のBACク ロー ン に ょ っ て カ ー バ ー され て お り,そ の物 理 的距 離 は約380kbで あ る こ と を 明 らか に し た(図1.4). 日本 晴 ゲ ノム にお い て,こ の マ ー カ ー に挟 まれ る領 域 に含 ま れ る 遺 伝 子 を遺 伝 子 予 測 ソ フ トで 予測 した と ころ,90個 の遺 伝 子 が 予測 さ れ た(表1-2).Rflタ ンパ ク 質 は,ミ トコ ン ドリア で 機 能 して い る こ とが考 え られ る た め,予 測 した 90個 の 遺 伝 子 の コー ドす るタ ンパ ク 質 が ミ トコ ン ドリア に移 行 す る か ど うか を, タ ンパ ク質 局 在 予 測 ソ フ トを 用 いて 予 測 した.こ の 結 果,3個 の 遺 伝 子 が コー ドす る タ ンパ ク 質 が ミ トコ ン ドリアへ 移 行 す る こ とが 予 測 さ れ た.こ れ らの遺 伝 子 は,い ず れ もPPR(pentatdcopeptiderepeat)タ ンパ ク質 を コ ー ドして い る ど 予 測 さ れ た た め,そ れぞ れPPR8-1,〃R8-2,PPR8-3と 名付 け た.PPRタ ンパ ク質 とは,35ア ミ ノ酸 か らな る繰 り返 し配 列 を持 つ タ ンパ ク質 の こ とで,葉 緑 体 や ミ トコ ン ドリア にお いてRNAの 転 写 後 制 御 に関 与 して い る と予 測 さ れ て い る.日 本 晴 で 見 つ け た3個 のPPR遺 伝 子 の 回復 系 統 にお け る対 立 遺 伝 子 を 瑚 候 補 遺 伝 子 と予 想 した.回 復 系 統 の1つ で あ る 密 陽23号 のBACク ロー ン よ りそ れ ぞ れ のDNA断 片 を ク ロー ニ ン グ し,ア グ ロバ クテ リウム 法 を用 い てCMSイ ネ へ 導 入 して,相 補 性 試 験 を行 った(図1-5).遺 伝 子導 入 を行 っ た カ ル ス よ り全RNA を抽 出 し,B一 α㌍6RNAの 転 写 パ タ ー ン を ノー ザ ン プ ロ ッ ト分 析 で 調 べ た 結 果, PPR8-1を 導 入 した カ ル ス で の み05kboη79RNAが 検 出 され,プ ロセ ッシ ン グ が 起 る こ とが 分 か った(図L6).プ ロセ ッシ ング の有 無 の検 出 に注 目 したス ク リーニ ング法 に よ り,カ ル ス の段 階 で迅 速 に候補 遺 伝 子 をPPR&1に 絞 り込 む こ とが で き た さ ら に,PPR8-1遺 伝 子 導 入 個 体 は,花 粉 稔 性 ・種 子 稔 性 と もに 回復 す る こ と も明 らか とな った(図1-7).こ の ことは,PPR8-1が 岬 で あ る こ とを 証 明 して い る. ク ロー ニ ン グ した 瑚 の塩 基 配 列 を決 定 した と ころ,2376bpで791ア ミ ノ酸 か らな る タ ンパ ク質 を コー ドして お り,18繰 り返 しのPPRモ チ ー フ を含 む こ とが 明 らか とな った(図1-8).こ の配 列 と 日本 晴 の 魂 を比 較 した と こ ろ,魂 で は1 bpの 欠 失 に よ り フ レー ム シ フ トを 起 こ し,終 止 コ ドン が 生 じて い た(図1-9).さ らに,Rf1のN末 端 領 域 が,推 定 ミ トコ ン ドリア移 行 シ グ ナ ル を コ ー ドして い る か ど うか を,GFPと の 融 合 コ ンス トラ ク トを用 い て パ ー テ ィ クル ガ ン法 で 調 査
し た.こ の 結 果,GFPは ミ ト コ ン ド リ ア に 局 在 し て お り,Rf1は ミ ト コ ン ド リ ア に 移 行 す る こ と が 示 さ れ た(図1-10). 第2章 ミ トコ ン ドリア にお け るRflの 機 能 CMS系 締,回 復 系統,瑚 遺 伝 子 導 入 系 統 よ り,ミ トコ ン ドリアRNAを 抽 出 し, ノーザ ン プ ロ ッ ト分析 を行 っ た結 果,1ヴ1の 存 在 特 異 的 にB-o勿6RNAの プ ロセ ッ シ ン グ が 起 き て い る こ とが 確 認 さ れ た(図2-1).プ ライ マ ー 伸 長 法 に よ り, B一仰6RNAの プ ロセ ッシ ング 部 位 を決 定 した.こ の結 果,oヴ79の 開始 コ ドンよ り52bp上 流 に プ ロセ ッシ ング 部 位 が 存在 す る こ とが 分 か った(図2-2).プ ロ セ ッシ ング サ イ トを含 む400ntRNAの2次 構 造 を構 造 予 測 ソ フ トMfoldに よ っ て 予測 した 結 果,プ ロセ ッ シ ン グ サ イ トは,2つ の ス テ ム ル ー プ に 挟 ま れ る 一 本 鎖 領 域 に位 置 す る こ とが 分 か っ た(図2-2).さ らに,大 腸 菌 で生 成 させ たRf1 リコ ン ビナ ン トタ ンパ ク 質 と,こ の 領 域 を プ ロー ブ にゲ ル シ フ トア ッセ イ を行 った 結果,こ の 領 域 と リコ ンビ ナ ン トRf1と の結 合 が 確 認 され た(図2-3). 次 に,Rf1とRNA編 集(以 下 エ デ ィ テ ィ ン グ)の 関 係 に つ いて 調査 した.ミ ト コ ン ドリア の α{p6遺伝 子 で はr17カ 所 にお いてC→Uへ のエ デ ィテ ィ ン グが 起 る こ とが 知 られ て い る.さ らに,こ れ らの エ デ ィテ ィ ング は,瑠 を持 た な い 日 本 晴 な ど にお い て も効 率 よ く起 っ て い る ことが報 告 され て い る.CMS系 統 で は,
2.OkbのB一 の6RNAと,15kbのN一 α{p6RNAが 存 在 して い る.cDNA15ク ロー ン
の塩 基 配 列 を調 べ た と ころ,2.OkbのB一 α{p6RNAで は2ク ロー ン しか エ デ ィ テ ィ ングが 起 き て いな か っ た(図2-4).1.5kbのN耀p6RNAで は,13ク ロー ンで エ デ ィテ ィ ン グが 起 って いた.こ の こ とは,Rflは α♂p6RNAの エ デ ィテ ィ ン グ に必 須 な 因子 で は な い ことを示 して い る.さ らに,回 復 系統 にお いて,プ ロセ ッ シ ン グ を受 けて 生 じた1.5kbの α㌍6RNAとN一 α㌍6の エ デ ィ テ ィ ン グ効 率 を調 べ た と ころ,全 て の ク ロー ンで エ デ ィ テ ィ ン グが観 察 され,CMS系 統 のN一仰6RNA で の エ デ イテ イ ング効 率 を上 回 る こ とが分 か った.Rflは ⑳6の エ デ ィ テ イ ン グ に必須 で は な いが,促 進 す る機 能 を持 って いる と考 え られ る.
第3章CMSの 原 因タ ンパ ク質 ペ チ ュ ニ アや コセ ナ ダ イ コ ンな どのCMS植 物 に お いて は,原 因遺 伝 子 の タ ン パ ク質 が 蓄 積 して い る が,回 復 系 統 で は 翻 訳 が 抑 制 さ れ て い る こ とが 報 告 さ れ て い る.Boro型CMSの 原 因 はB-4㌍6と 言 わ れ て い る が,oη79が 翻 訳 され て い る か 不 明 で あ った た め,Boro型CMSイ ネ にお い て も 同様 の こ とが 観 察 さ れ る か ど うか 調 査 した. oヴ79遺 伝 子 が タ ンパ ク質 と して 発 現 可 能 な遺 伝 子 で あ るか どうか を調 べ る た め に,真 核 生 物 型 お よび 原 核 細 胞 型 のfηv伽 翻 訳 系 に お いて,タ ンパ ク質 の翻 訳 に つ いて 調 べ た(図3-1).こ の 結 果,原 核 生 物 型 の 加v如o翻 訳 系 にお い て の み翻 訳 産 物 が 検 出で きた の で,oη79遺 伝子 は ミ トコ ン ド リア にお い て 翻 訳 可 能 な 遺 伝 子 構 造 を持 って いる と考 え られ た.ま た,原 核 生 物 型 の 加 贈o翻 訳 系 で は,プ ロセ ッ シ ン グ を受 け たoヴ79の 方 が,プ ロセ ッ シ ング を受 け る 前 よ り も翻 訳 産 物 が 少 な い こと も分 か っ た.oヴ79の5'側85bpはcoκ1(シ トク ロ ム オ キ シ ダ ー ゼ ・サ ブ ユ ニ ッ ト1)と 相 同性 が 高 く,後 半部 は既 知 の配 列 と相 同性 が 見 られ
な い.coκ1相 同領 域 を除 いたo∼プ79の 後 半 部(ORF79△N)を 大 腸 菌 で発 現 させ て
リコ ン ビナ ン トタ ンパ ク質 を得 た(図3-2).こ れ を抗 原 と して抗 体 を作 成 し,ウ エ ス タ ンブ ロ ッ ト分 析 を 行 っ た.こ の 結 果,瑠 ホ モ の 回 復 系 統 に お い て は, ORF79の 蓄 積 が観 察 され な か った(図3-3).さ らに,瑠 遺 伝 子 導 入 個 体 で は, CMS系 統 の 半 分 までORF79の 量 が 減 少 して い る こ とが 明 らか にな っ た.一 方, ATP6の 蓄 積 量 は どち らの 系統 にお い て も変 化 が な か っ た(図3-3).こ の こ と は,ORF79の 蓄 積 がCMSを 引 き 起 こ し,Rf1に よ るB一α{p6RNAの プ ロセ ッシ ン グ に よ りORF79の 翻 訳 が 減 少 す る た め に,稔 性 が 回 復 す る こ と を示 唆 して い る. 第4章PPR遺 伝子で ある 瑠 の進化 PPRタ ンパ ク質 は,高 等 植 物 で ス ー パ ー フ ァ ミ リー を 形 成 して い る こ とが 知 られ て お り,イ ネ で は ゲ ノム 中 に約650個 のPPR遺 伝 子 の存 在 が 予 測 され て い る.母1近 傍 に存 在 した2つ のPPR遺 伝 子PPR8・2,PPR8-3お よび 瑠 の 特 徴 を表 41に 示 した.こ れ ら3個 の遺 伝 子 につ いて,RT-PCRに よ っ て発 現 を調 査 した と ころ,瑠 とPP1∼8-3は どの組 織 に お い て も発現 して い た.一 方,PPR8-2は 根 と葉
にお い て は発 現 して いな い が,そ の他 の 組 織 で は 発 現 して い る こ とが 分 か っ た (図4-1).RTPCRの 結 果 よ り,〃R8-2と 〃R8-3は と も に発 現 して お り,ミ ト コ ン ド リア にお いて 何 らか の機 能 を担 っ て い る 可能 性 が 示 唆 さ れ た.そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 に つ い て 回 復 遺 伝 子 を持 た な い 日本 晴 ゲ ノム 情 報 と比 較 した と ころ; PPR&2に お いて は,日 本 晴 で は欠 失 に よ る フ レー ム シ フ トに よ っ て 終 止 コ ドン が で きて いた(図4-2).一 方PPR8-3で は,日 本 晴 と の 間 に2ア ミ ノ酸 の置 換 の み が 存 在 した.そ れぞ れ のPPR遺 伝 子 に つ い て,相 同 性 を調 べ た と ころ,そ れぞ れ の 相 同 性 が 非 常 に 高 い こ とが 明 らか とな った(表4-2).特 に,瑠 の5'領 域 と 3'領 域 はPPR8-2と 相 同性 が 高 く,そ の 領 域 に 挟 まれ る領 域 はPP1∼8-3と 相 同性 が 高 い こ とが 明 らか とな っ た(図4-3).こ の こと は,瑠 が 〃IR8-2とPPR8-3 の重 複 に よ って 生 じた 可 能 性 を示 唆 して い る.
結語
CMSはF1雑 種 品 種 の 育 成 に利 用 で き る た め,世 界 中 で研 究 され て い る.本 研 究 と同 時期 にペ チ ュニ ア とコセ ナ ダイ コ ンのCMSに お いて 稔 性 回 復 遺 伝 子 が ク ロー ニ ング され,い ず れ もPPR遺 伝 子 で あ る こ とが 報 告 され た.本 研 究 で は,世 界 に先 駆 けてBoro型CMSイ ネ に対 す る稔 性 回 復遺 伝 子 瑠 を ク ロー ニ ング し, PPRタ ンパ ク質 を コ ー ドして い る こと を明 らか に した.ま た,瑠 の翻 訳 産 物 で あ るPPRタ ンパ ク質 が α{p6-oヴ79RNAに 結 合 し,プ ロセ ッシ ン グ を起 こす こ と を明 らか に した.さ らに,ORF79の 蓄 積 がCMSを 引 き起 こす が,重 複 に よって 生 じた稔 性 回復 遺 伝 子 瑚 の存 在 に よ り,α{p6」oη`79RNAの プ ロセ ッ シ ングが 起 き る とORF79の 翻 訳 が抑 制 され るた め に,ORF79の 悪 影 響 を回 避 して,稔 性 が 回 復 す る とい うメカ ニ ズ ム の モ デ ル を新 た に提 唱 した(図5).ま た,1ヴ1の 進 化 を考 え る こ とで,PPR遺 伝 子 な どの核 遺伝 子 に よ るオ ル ガ ネ ラ遺 伝 子 の発 現 制御 の解 明 に もつ な が る と期 待 され る.(A) CMS系 統 回復系統 F1 [cms-bo]rfirfi[cms-bojRflRfi[cms-bo]Rfirfi (A) +1 1.. N-a加6 +1014
畳 置
iboro.tuft bO/'ORfiRfi born
(e) 花粉稔性 i82 .4% CMS系 統 回復系統 96.● ● ◎ ● 潟r..●8● ● 0% F {00%一 致 ` : ,+1+236
一
B-atp6 (B) atp6 。膚9200bp 100% σ:璽窮;1 50% 雑 B・aφ転写様式δ遺伝子の 転写屋物のサイズと分子種 C閉S系 鶴(ff7月甲) 回復系続(尺脅尺胃) aψ6とoμ79が 共解 共転写後 プロセッシング aOkb a鰺0㎡79剛A 1.5kbatpsRNA O.5kbor779RNA 図1イ 材 料 の 遺 伝 子 型 と稔 性 Boro型CMSは,イ ンド型 品 種ChinsurahBorollに 日本 型 品種 台 中65号 を連続 戻 し交配 す ることで作 出され た(Shinjo1969). (A)そ れ ぞれ の 系 統 の遺 伝 子 型 表 記 と,モデ ル 図 (B)ヨ ウ素 ヨー ドカリウム染 色 による花 粉 稔 性 CMS系 統 では,花 粉 のデ ンプンが 蓄 積 せ ず 不稔 とな る. 配 偶 体 型 に働 く尺f7により稔性 が 回 復 す る. 図1-2Boro型CMSに つ い て 既 に 報 告 され て い たB-aφ6遺 伝 子 の 構 造 と転 写 産 物(Akagiθf訊1994,lwabuchief飢1994) (A)N-a加6,σox'と の 比 較.点 線 で 囲 ま れ た 領 域 ぱ,相 同 性 の 高 い 領 域. aψ6領 域 は100%,08f79(刊 ∼+85)と σω【'(+歪∼+85)は,82.4%の 相 同 性 を 示 す. (B)CMS系 統 と回 復 系 統 に お け るB-alρ6転 写 様 式 の 違 い を 示 した. 花粉 表1-1本 研究 で 使 用 した イネの 遺 伝 子型 と稔 性 F1 [Cη7S,bo】Rf7げ プ皿
π
♂ ・雰糞 レ ar押 一」一 一L一 不 稔 A而 」__⊥__不 稔 系続名 遣伝子型難
CMS系 続 回榎系続 台中65号 日本晴 齊陽23号 【cπ7s・bφレ浄 ガ 【cπ75・bo1R肖鮒 [胡r胃膚 田 膚r潟 【ハ朋 竹R向 不種 槍 稚 稔 可 可 可 可穣 ♀ X aRf1 一 ⊥一一 ⊥一一 可 稔 ARf1 」__L.可 稔 ar斉十 十 ・馨
勤レ⊥ ユ
arH [cmぷbolげ7げ ゴ CMS系 統→
BC,F,畳
π
aRf1 _L__L_組 換 え花 粉 に 「 一 「 「 一 由 来す る個 体 af押 図1・3マ ップベー スクロー ニング に用 いた 集 団 CMS系 統[cms.bo]醒 ノf7xF1【αηs一加1尺κげ1の交 配 をすれ ば, 次 世 代 は全 て尺肋fブとなり表 現 型を評 価 す る必 要 が ない. マーカーAに ついて,CMS系 統 ホモ型 の 個 体 が,組 換 え個 体 である. (6) GEND713 (4) CT502 壷 ↓ Imo一一一380kb一`) 100kb 図1・4Rf7候 補 領 域 を カバ ー す る 日 本 晴BACク ロー ン マ ー カ ー 上 の 括 弧 中 の 数 字 は,組 換 え 花 粉 由 来 の 個 体 数 を 示 す. 日 本 晴BACク ロ ー ン の ア クセ ッシ ョン 番 号 は,左 の クロ ー ン か ら, ACO68950,ACO92489,ACO68923,ACO79888で あ る. 日本 晴(ガプ膚)塩 基 配 列 デ ータ ▼ 遺 伝 子 予 測,ミトコンドリア移 行 タンパク質 の 予 測 ▼ 密 陽23号(RfiRfi)BACク ロー ンか ら候 補 遺 伝 子 を含 むDNA断 片 の クローニング @駆 密 陽23号BACク ロー ン ＼一 7PPR8-1PPRB-2PPRB-3 CMS系 統 へ 遺伝 子 導 入 .▼ 形質 転 換 カルス において0.5kbOff79RNAの 有 無 を調 査 7 花粉 稔 性 と種 子稔 性 の 回 復 を調 査 図1-5Rfゴ クロ ー ニ ン グ の フ ロ ー チ ャ ー ト表1-2BACク ローン上 に予 測 され た遺 伝 子 の数
ACO88950 ACO92489 ACO68923 ACO79888
予測された遣伝子と逸伝子数 予測された遣伝子と遣伝子致 予測された遣伝子と遣伝子歎 予測された遺伝子と逮伝 子致
A8Ct㎜ 叩or愉 電 Unknown5 Acyltransferase 1 ACV覧一 { KHdomain 瑠 Epo盾dehydrd隅 z My厨 書険eD純A㎞nding蝋in 1 PPR 3 Lar曲ionho8yntho加50 ¶ PPR 4 RNApolymerese 1 MuDRfamilytransposase 噸 Unknown 24 WDdomain づ PGAP1-likeprotein つ Unknown 1b Phy重06hela価nsyntho胞5e 1 Proteinkinase ¶ PPR 3 RNaseH 1 了PR , Unknown 20 胴 齪 痢 遭 に 亀 ヒ 這 ミ +ppR&2 +pPR8-3 (A) 0.5kb rRNA耀 黎
==謬 霧墾影零器零零響謬
図1-6候 補 領域 を導 入 した形 質 転 換カル スにお けるノー ザ ンプ ロット解 析 プ ローブ としてo㎡79を用 いた. PPR8-7を 導 入 したカル スでの み,B-a加6.RNAの プロセッシ ング が 観 察 され た.下 段 は,rRNA. (A) CMS系 統 . 冨 , ..O F . 、 . -門 ゴ. . 一 .内 . .﹃..駕
鞭
4 PPR8イ 導 入個 体●
● ●9
葛) ↑ 揖 O ∈ 匡 店 店 M㎜R瓢7Gハ1武SDGS工 ΩGRGGR轟 GGSG超DハRHVFD輩 工山RRGRG鮎SIYGLHR互 1』DVハRDSPハ ハ」匡VSR-Gj園D㎜PDL CTYGILIGCCCRAGRLDLGFAALGNVIRICGFRVDA IハF田PLLKGLCコ ロ⊃KR望SDAMDI「 一 ㏄1PNV FSY珂 工1山KGLCD猛HRSΩE㎜LL㎜DDKGGGSPPDV VSYTTVINGFFREGDSDICAYSTYHENII,DRGILPDV V!2讐闘S工=肌CK蕊 ΩムMD1㎜VL㎜GVMPDC H望「Y罰S■L翼G7CSSGΩPKE口LエGFLKKMRSDGVEPDV V!mζSL二 劃D1【LCK闘GRく ㎜ ■FDSM望 層【RGI謹 【P回■ … ΩG一 ㎜G勘 ㎜G工 翼P。H ㎜S工1」=(滋 】【」囚匡ΩG㎜ Ω」磁 』VFS㎜ ΩΩGLNP皿 V!1【「G翼V工G工LCKSGKV1云D肌1【FBΩMID2GLSPGH ■VY蔚SLI翼GLC田C㎜R互 琶躍LII㎜RG工 ㎜ ■7rNSエ エDSKC弼GRV=罵SB翼L7㎜ 工GVKPNV ■口Y皿 」工闘07CL照 ㎜ 蹴 【 】踊 ㎝SVGLKP闘 口 V『コ1ζS厘江・工闘GYCK工S㎜Dj臣LVLF㎜SSGVSPD■ ■口YN=工LΩGlf'α 劇R罰隠1㎜L1『71ヒ ■!【回SG田9工EL ・S!慶Y麗■工工遮GムC】口m剛【・=「DD1」:LΩ鯛ro塾江6CLMDLKL回 」L R聖F珂 工M■DIULLKVG㎜E1蜂 口⊃LWハFSS闘GLVP塾 『冥 W聖 】τ㎜ 匡駕工=GΩG1㎜ ΩLPI置SMEDN㏄{躍VDS 螂 馴 聡GE■ ㎜ ㎜D柵SI距 S巴】鵬 工『工DL工」SGG罵1ZΩ思1里㎜LP呂K7鴇F】:BSLSC B1 轟=○ ●6● ●●●●●●●●●○●●●○匪陰[ 図4-8Rf毛 タンパク質 のPPRモ チー フ (A)1行 目は,推 定 ミトコン ドリア 移行 シグ ナル.18繰 り返 しの PPRモ チーフ中 の 赤文 字 は,保 存 され ているアミノ酸 を示す. (B)Pfamに よるRf1タンパ ク質の 模 式 図. (s) / ' 争譲
ゴ ノ . / ' . (A) (B1 eamHI BamHI 図 て一7PPR8イ の遺 伝 子 導 入個 体 の 花 粉稔 性 と種 子 稔 性 (A)CMS系 統 と,CMS系 統 にPPR8-7を 導 入 した 系統 の 花 粉 を12Klで染 色 した.導 入 遺 伝 子 が分 離 す るた め, 50%の 花粉 で稔 性 を回 復す る. (B)PPR8イ を導 入 した 系統 は,種 子 稔 性 を回 復 した. 1by57Aby ATG 了GA 密陽23号R餌_ニ ー 二 /● ●!● /● 日本 晴 .fiEi;ニ N-terminalregion GFP NosT 35S (C} ㎜3R湘76㎜DGSIΩG聡GGR」 』LGGSG鱈DA震}1▽FD起 工」」RRGRGASIヱGLNRA二ADVARHSPAAA▽SRYNRMARAGゑ i)E▽IPPDLC〔EyG工L工GCCCRゑGRLDLGFAALGN▽ エKKGF哀V ピA工 田F彫田炉LLKG工 、CADKR歴SDA㍗ ① 工VLRR瓦 丁瓦LG⊂ 工pnVF3 】ζ冠NL、LNGムCDE餌RSQEAGS ATG TGA 図1-10GFPを 用 いた細 胞 内 局在 (A)コ ンス トラクトの 模 式 図 (B)GFPと 融 合 したRf1のN末 端 領 域 最 初 の26ア ミノ酸 が〔㎞) 2.0 1.5 0.5 N 葦 哩 く 雛 ヒ 疋 ,畿 駆 く 癖 ミ ヒ 塔 隈 羅 回 馨 隈 の Σ O ・奪難 図2-1単 離 ミトコン ドリアRNAの ノー ザ ン プ ロッ ト分 析 プ ロ ー ブ に は,B-aψ6遺 伝 子1.6kbを 用 い た. 尺r7導 入 個 体1,2は,と も に 稔 性 回 復 が 確 認 さ れ て い る. (A)
一
くlB・GSP7 <18・GSPi2 (C》 f61 甲葦 犀 く 瀞 ヒ に 想 隈 羅 回 婁 瞳 ω Σ O C T A G 蘂 箪 . 驚_ 鑑、 轍 噸6 蓄 惣 B-GSP7 ￠ マ ? T G T T C 蓋 F 葦 駆 く 鱒 やを 婁 県 騨 回 婁 隈 の Σ O C T A G B-GSP12 § ≧ マ T G T T C 轟 3 ● " cG 触 G 義 G A G A C り C U C U C U G 裁 C 義 艦. 三 ・^ ￠ ⋮ ..冒 ' ●. A G A A C C G C C C C G G G G G 6 C ㌔ G 臓 3 ⋮ 噛9 闘 -U O 口 3 図2-2プ ライマー 伸 長 法 によるプ ロセッシングサ イトの 決 定 (A)ブ ライマー 伸 長 法 に 用い たプライマー の位 置 を矢 印で示 した. (B)プ ライマー 伸 長 法 で,決 定 したプ ロッセッシングサ イト. (C)プ ロセ ッシングサ イト近 辺 のRNAの2次 構 造を示 レた. プ ロセ ッシングサ イトは,下 隷 で示 した領 域. (A) 闇 (B) ジグナルペプチドPP尺一
PρR6x麗 悟丁
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一
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(kD) 鱒5 16 蒼 卜 ξ 配 ・蒼 ﹂ .雛
図2-3ゲ ル シ フ トア ッセ イ (A)Rf1タ ン パ ク質 の 構 造 と,リ コン ビナ ン トタン パ ク質 の 構 造. Rf{のN末 は ミトコン ドリア 移 行 シ グ ナ ル.Trx-Rf1は, シ グ ナ ル 領 域 を 除 い たRf1を チ オ レ ドキ シ ン(Trx)と 連 結 した.Trxは コン トロー ル として 用 い た. (B)ゲ ル シ フトア ッセ イ に 用 い た リコ ン ビナ ン トタン パ ク 質 を 抗His抗 体 を 用 い ウ エ ス タン ブ ロッ ト分 析 で 検 出 した. そ れ ぞ れ の レ ー ン に240ngの タン パ ク 質 を 泳 動 した. (C)ゲ ル シフ トア ッセ イ に 用 い た プ ロー ブ 領 域 を 下 綜 で 示 した. 矢 印 は プ ロセ ッシ ン グ サ イトを 示 す. (D)ゲ ル シ フ トア ッセ イ の 結 果 を 示 した, 白 矢 印 は,シ フ ト し た シ グ ナ ル を 示 す. 競 合 的 阻 害 剤 として,酵 母 のtRNAを 用 い た. タンパ ク質 は,Trx:12.5fmol,Trx-Rf1:10flηolを 用 い た. 〔C, (D) 暉一
BD4プ ロー ブ飴 的阻訓
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(AJ 蟹 ρ5 岡 朝e劉 ■で 璽z麗 遡 蔭 (B1 ・エディティン グサ イト RNA分 子 種5.67891011121314151617 クロー ン数 (D) (%) goo
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11 奪 1 2 so _40 zo 3.3 60 {Cl 0 40 20 エディテイングサイト RNA分 子種5678910習12131415161ア クローン 数 41 1 1 2 02 .Okb唯.5kb.ノfブRデ7 RNARNA ■■ 全 て のサ イトで にエデ ィテ ィングな し 國 一 部 の サ イトでエディティングな し [コ 全 ての サ イトでエディティングあ り 匿 ⊃ 國 薗 .「噸ゴィ雄... 籔霧. 13・ 多'口 ●・ ,・・..・ ・' 幽,.● 13.3 ・ 醗 署6・ き ● . 93 「 73.3 … ■ 、 i 回 ! 騨 1 重 十 十 噸 ↑ ↑ や ■ 十 毒 や 昏 や 学 十 噂 ↓ ウ や 噸 噸 ◎ ■ ↑ ◎ ウ 喝 噸 十 ウ ウ ◎ ウ ↑ ◇ 十 ◆ ↑ . 耐 6 ㎡鷲
■ , 一 一 ● ■ ■ 一 ■ 鱒 ■ ● 口 鷺 譜 ゴ::::::::1:::: RNA 属 1 図2-4エ ディティング 効 率 (A)a加6遺 伝子 領 域 内 の17カ 所 の ヱディティングサ イトを示 した.黒 矢 印の サ イト13カ所 につい て調 査 した. (B)CMS系 統で のエデ ィティング 効率 を 示 した.+は エデ ィティング 有 り,一がエ ディティング無 しを示 す. (C)R"の 有 無 による1.5kb母tp6RNAの エディティング効 率 を示 した。 Rf7Rf7で は 、t5kbのRNAは プ ロセ ッシング を受 けたB-aφ6とN一θ加6を含 み,区 別 す ることは できな い.『 (D)CMS系 統に お けるaφ6RNAの 長 さによるエデ ィティング 効 率 の 変 化をグラフで 示 した。 (E)Rf1の 有 無に よるt5kbaψ6RNAの エディティング効 率 の 変 化 をグラフで示 した 、, (A) B-aψ6+1 aφ6 .刊014 書 響 orf79 +1+236 ▼■一 但) (kD) 8.9レ 1 a 234 b ORF79 図3-135S-Metを 用 いた1η吻加 翻 訳 (A)鋳 型 として用 いたDNA断 片 を示 した.矢 印 は, プ ロセッシング部 位を示 した. aは,プ ロセッシングを受 ける前 のoガ79を 仮 定 し, bは,プ ロセッシング後 のo評9と 仮 定 した. (B)レ ー ン1,3はaのDNA断 片を鋳 型 とし,レー ン2,4 は,bのDNA断 片を鋳 型 とした.レー ン1,2は 真 核 生 物 型 翻 訳システム,レ ー ン3,4は 原 核 生物 型 翻 訳 システム で'η伽 翻 訳 した産 物をSDS・PAGEし た. プ ロセッシングを受け る前 のαf79を 用 いたときの 方 (レーン3)が,プ ロセ ッシ ング 後 の01f79を用 いたとき (レーン4)よ りも翻 訳 産 物 が 多い. (A) B-atp6 oo翼f 8{P6 璽 」 國』、 ■ゴ 幽■IL こミ＼ 。艀9 蓄 ■ 暦 (B) (kD) 7.2 123456 103030605060 醒f79置 一 御一 瓢 τ 含8■8零置雷置星零3竃9838零3=8333==3ε胃3338置$3署 置.33呂冨33333巴 o■躍τ 鳥㎜ 一 一 一 708090 0rf79一 轟 呂83霧3雷88馨冨88=竃88謬==338 0ロ巴ば 烈 一 100 1ユ0 iza )「
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難.
...号蘇 く! CBBstain 図3-2リ コンビナ ントORF79の 精 製 (A}Off79とC◎x'の相 同 性 の高 い 領 域を 示 した. (B)pQE30ベ クター を用 いて大 腸 菌 で発 現 させた結 果(A) (B) (kD) 凝 隆 羅 回 握 隆 の Σ O 駆 く 鷺 ミ (kD) 航ORF79ムN抗 体8 .9レ の Σ O 駆 く 鮎 ヒ 8.9レ 、 CBBstain 377レ 図3-3ウ エスタンブ ロット分 析 (A)全 抽 出 タンパ ク質 を抗ORF79△N抗 体 で 検出 した. (B)単 離ミト:コン ドリアを抗ORF79△N抗 体 と, 抗ATP6抗 体 で検 出 した. 抗ORF79ムN抗 体 抗ATP6抗 体 CBBstain (A) 闇 PPRB-2
幽
密 陽23号 2慣bP26bP ATG一
了GA 日本晴+⊥___iJ■ ■■■直 ATGTAA970by PPR&3 β一加bロ 伽 (s) 密隅23号. アミノ酸O閥 ゲノムTA A 図4-1RT-PCRに よる発 現 の 調 査 コントロー ル として恒 常 的 に発 現 してい る 匪勉bu伽 を用 いた. 日本晴一
A了G+375←7嘱3 ATG や1537 TGA TGA 表4-2尺 κ,ρPR8・2,PPR8-3遺 伝 子,推 定 ア ミノ酸 の 比較 影 付 き の数 字 は,DNAレ ペル で の相 同性 を 示 した. それ 以 外 は,ア ミノ酸 レベ ル での 相 同性 を示 した. Rfi PPR82PPRB-3 闘 R伺 PPR8-2. PPR&3 ■ 92.5ｰ/a 89.0ｰ/all難叢
89.2%一 ■一
G D C D絵
G O 図4-2PPR8-2,.PρR8・3の 日 本 晴 ゲ ノム との 比 較 (A)日 本 晴 のPPR8-2で は,21bp,26bpの 欠 失 で 終 止 コ ドン が 生 じて い た. (B)PPR8・3で は,375番 目 と713番 目 お よび 朽37番 目 の 塩 基 置 換 以 外 の 変 異 は 存 在 しな か った. 表4-1Rf7,ρPR8・2,PPR8・3遺 伝 子 の 特 徴 コー ド領 域 推 定PPRそ の他 の (bp)ア ミノ酸 数 モチー フ数 モチー フ 尺" 2376 79螺 18 PPR&2 2052 683 雫6 PPR&3 2385 794 艦8/ ♪ぐ ＼
雪.1 鮒 」 昼{・. 駅8・2↑欄
} / 97潟 も 図4・3R向 を3つ の パ ー トに 区 切 って,PPR8-2,PPR8-3と 比 較 した. 5'側 領 域 のRff(1即91)は,PPR8-2(1卿91)と96.7%の 相 同 性 を 示 し, 3'側 領 域 の 鮒(562司376)はPρR8-2(241∼2052)と95.9%の 相 同 性 を 示 した.ま た,そ の 領 域 に 挟 ま れ る,Rf7(92陶561)はPρR8・3 (104-573)と,97.2%の 相 同 性 を 示 した.こ の ように,Rf7はPPR8,2と PPR8-3の 融 合 に よ って 生 じた 可 能 性 が 示 唆 され た.第10染 色 体 煮 重複 顯o● ・● r R肖PP尺8・2月PR8-3
