Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
セメント芽細胞をLipopolysaccharide で刺激した際の硬
組織形成関連遺伝子のメチル化
Author(s)
小林, 史枝; 村松, 敬; 佐古, 亮; 古澤, 成博
Journal
歯科学報, 116(3): 229-229
URL
http://hdl.handle.net/10130/4021
Right
目的：根尖性歯周炎において，感染根管治療後の理 想的治癒形態は，根尖が新生セメント質により覆わ れる骨性瘢痕治癒であるが，難治性の根尖性歯周炎 の中には根尖が硬組織で覆われることなく経過する ものが存在する。これまでは根管治療時の根尖部の 過拡大が原因で骨性瘢痕治癒が起こりにくいとされ てきた。近年，細菌感染により宿主細胞の遺伝子に エピジェネティックな変化が起こることが報告され るようになってきたが，セメント芽細胞が細菌刺激 をうけることでエピジェネティックな変化を起こす のかは明らかとなっていない。本研究では，セメン ト 芽 細 胞 に グ ラ ム 陰 性 菌 の 細 胞 壁 成 分 で あ る lipopolysaccharide（LPS）で 刺 激 を 与 え，硬 組 織 関連遺伝子の DNA のメチル化を評価した。 方法：本研究には，テロメラーゼを導入し不死化し た，ヒトセメント芽細胞（HCEM，広島大学・高田 隆教授より供与）を用いた。培地にはα-MEM（１０％ FBS，１％ penicillin-streptomycin 添加）を使用し， ３５mm ディッシュに１×１０５ 個の密度で播種した。 ２４時 間 後，培 養 液 に E. coli 由 来 LPS（Sigma-Aldrich）を１μg/ml の濃度で添加し，一か月後に細 胞より DNA を抽出し，DNA を Epitect Plus Bisul-fite kits（Qiagen）にてバイサルファイト処理し た。その後，定量的 real-time PCR にて Bone mor-phogenetic protein 4（ BMP 4 ）， SOST / sclerostin, Gap junction protein alpha 1（GJA 1）の DNA のメ チル化を SYBR green を用い検索した。なお対照 群としては LPS の代わりにα-MEM を添加したも のを用いた。 結果および考察：定量的 realtime PCR の結果， LPS 添 加 群 で は，GJA 1 と BMP 4 に 高 メ チ ル 化 （hypermethylation）がみられた。一方，SOST で は LPS 添加群で低メチル化（hypomethylation）が みられた。これまでの研究ではセメント芽細胞の硬 組織形成関連遺伝子をエピジェネティックな観点か ら調べた報告はないが，本研究の結果からは LPS の長期刺激によりセメント芽細胞の硬組織形成が阻 害されることが示唆された。 目的：ヒトの安静時唾液分泌量は１５時ごろに最大値 を示し，睡眠中にほぼ分泌停止する概日リズムが存 在していることが知られている。唾液腺には時計遺 伝子の発現が認められ，その発現が遺伝子ごとに特 定部位に局在していることが報告されている。本研 究ではラット顎下腺導管細胞の時計遺伝子発現およ び唾液の経細胞分泌と傍細胞分泌に関連する遺伝子 の日内変動を解析し，唾液分泌の概日リズム形成メ カニズムを検討した。 方法：６９週齢の Wistar 系統の雄ラットを１２時 間毎の明暗環境（８時から２０時を明期）で自由摂食 飲水環境下２週間飼育し，自発的な wheel-running 行動から概日リズムを記録した。概日リズム実験で はすべての区間計算は zeitgeber time（ZT）を基 準とし，照明が点灯する８：００を ZT０，消灯する ２０：００を ZT１２と規定した。行動量は回転輪の回転 数，飲水行動は暗視カメラにより記録した。顎下腺 における時計遺伝子の発現は，２週間の馴化飼育し たラットの顎下腺を４８時間連続して６時間毎に摘出 し，total RNA をリア ル タ イ ム 定 量 RT-PCR 法 に て計測した。さらに collagenase および hyaluroni-dase による酵素処理後に４０％ percoll 分画にて導管 細胞と腺房細胞を単離し，total RNA を抽出した。 摘出時刻ごとの各種時計遺伝子（Bmal 1，Per 2， Clock，Cry 1）および唾液分泌関連遺伝子の発現量 をβ-actin 発現量に対する相対発現量と比較した。 結果および考察：行動解析の結果より Wistar 系統 のラット活動量は暗期に有意に増加し，飲水行動も 暗期に増加する傾向を認めた。作成したダブルプ ロットアクトグラムにより明暗環境下でのラット概 日リズムが安定していることが確認できた。ラット 顎 下 腺 に は４種 の 時 計 遺 伝 子（Bmal 1，Per 2， Clock，Cry 1）が発現し，約２４時間周期で明確な日 内変動を示した。また，導管細胞，腺房細胞におけ る時計遺伝子は各々に固有の発現パターンを示し， 細胞間同調因子の存在を示唆した。
