ベスナリノンによるヒト唾液腺癌細胞(TYS)の増殖抑制機構の解析

(1)

様式

5 論文内容要旨

題目

_{ベスナリノンによるヒト唾液腺癌細胞}_σYS)_{の増殖抑制機構の解析} 著者中城公一

内容要旨〈和文約

1 . 500

字

〉

唾液腺癌は化学療法、放射線療法に樹元性で局所再発、遠隔転移の多い予後不良の悪性腫蕩である。ベスナリノンは強心剤として開発されたれその副作用である無耕立球症発症の原因究明のj践で多くの悪性腫蕩細胞に対して分化・アポトシス誘導活性を有すること例月らかにさ九唾協定癌を含む多くの悪性腫蕩に対して分化誘導療法が試みられている。本研究ではベスナリノン処理により Glaπestか言縛されるヒト唾液腺癌細胞 (TYS)を用いてベスナリノンによる細胞増殖予防IJf乍用の分子機構の解明を試みた。

解析は(1)ベスナリノン処理TYS細胞より調製した mRNAを用い anti-senseoriented expression cDNA library を構築し、そのlibraryを TYS細胞にトランスフェクション後、ベスナリノン耐性株を選択し、挿入されている cDNA断片を回収する anti-senseexpression cloning法と、 (2)上記 libraryをランダムにシークェンスし分化、増殖に関与すると考えられる遺伝子のペスナリノンによる発現誘導を検索し、 up-regulationがあれlま、その分子を中心にそのシグナルを上流、下流へと追っていく candidategene searching法にて行った。その結果、 anti-senseexpression cloning法にて ribosomalprotein L21 cDNAを得た。 ribosomalprotein L21 anti-sense cDNAを強情悦現させた，棚包はベスナリノンに対する感受性治活下していたれその作用はおそらくある種のタンパク合成の阻害によるものであり、 ribosomalprotein L21タンパクの特異的な発現抑制がベスナリノン樹元性の原因とは考え難かった。一方、 candidategene searching法でマウスあるいはラットの細胞において transforming growth factor-sl (TGF-sl)あるいは follicle-stimulatinghormone (FSH)により誘導される遺伝子として報告されているTGF・sl・stimulatedclone 22 (TSC-22) cDNA断片を得た。 TSC・22遺伝子は TYS細胞においてベスナリノン処理にて明らかな発現誘導流志められたため、ヒトTSC-22cDNAの全長のクローニング、構造解析、機背繍析を試みた。 5'-RACE変法で openreading frameを含むほほ完全長1.6kbのヒト TSC-22cDNAを得た。全塩基配列を決定したところ予想されるアミノ酸配列はマウス、ラットに98.6%の相向性が認められた。またロイシンジ‘ッパー構造が認められたが、その近傍にDNA結合領域あるいは核移行シグナルが存在しないことより、 bZIP転写因子と結合しその転窃性を抑制するdominantnegative転写制卸因子である可制空が示唆された。 TSC・22遺伝子は TYS 細胞において細胞密度に依存しその発現が増加し、ベスナリノンはその発現を更に増強した。タンパク合成阻害剤シクロヘキシミドを用いた実験によりベスナリノンによる TSC・22遺伝、子の発現増強は間接作用であることが示唆された。次にTSC・22の上流、下流のシグナルを解析する目的で TGF・sl、p21WAFlの発現を検索した。ベスナリノン

はTYS細胞において TGF-slをわずかに誘導し、 p21WAFlを著明に誘導した。また p21WAFlの誘導は直張作用であることが明らかとなった。更にTGF-slは p21WAFl、TSC・22の発現を誘導した。次に TSC-22アンチセンスオリゴヌクレオチドのTYS細胞に対する景簿を検索すると、対愛知l曽殖期には全く景簿を与えないが、細胞密度が上がり増殖を止めるべき時期になると細胞増殖促進作用カ雫志められた。またTSC・22アンチセンスオリゴヌクレオチドはベスナリノンによるTYS細胞の増殖が附Uf乍用を阻害した。以上の結果より、ベスナリノンはTYS細胞において TGF-slあるいは他のタンパク質を介した TSC-22遺伝子の誘導、更に直張作用あるいはTGF-slを介した p21WAFlの誘導により細胞周期を Gl期に止め、細胞増殖茅防111'乍用を示すことが加変された。

(2)

論文表題ベスナリノンによるヒト唾液腺癌細胞 (T Y S ) の増殖抑制機構の解析著者 : 中城

公一

所属 : 徳島大学大学院歯学研究科口腔外科学第二講座 ( 主任 : 佐藤光信教授 )

(3)

論文表題ベスナリノンによるヒト唾液腺癌細胞 (T Y S ) の増殖抑制機構の解析著者 : 中城公一所属 : 徳島大学大学院歯学研究科口腔外科学第二講座 ( 主任 : 佐藤光信教授 ) キーワード : ヒト唾液腺癌細胞、ベスナリノン T S C -2 2

、

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、

G l arrest 1 ) 原著論文 2 ) 英文抄録 2 枚、本文 4 1 枚、文献 1 5 枚、図の説明 5 枚、図 1 6 枚、表 1 枚

3

) 連絡先 : 徳島大学歯学部口腔外科学第二講座

(4)

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(6)

緒百日本人における悪性腫蕩の発症数は年間約

4

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000

例あると推計されている 1) 。そのほとんどが粘膜上皮由来の肩平上皮癌で、約 9 0

%

を占めている。唾液腺癌は残る 1 0 % を占め、病理組織学的には腺様嚢胞癌、腺癌、扇平上皮癌、悪性多形性腺腫等、多彩な組織像を示す。唾液腺癌は増殖能は低いが、放射線治療、化学療法に抵抗性で、組織学的にも周囲組織への浸潤が強く、手術後局所再発、遠隔転移が極めて多いとされている _o _'-、，のように従来の治療法に抵抗性を示す腫蕩に対して近年新しい治療法として、分化誘導療法が試みられている。一般に、腫蕩細胞は発生起源となった細胞が分化過程のある段階でブロックされた状態にあると考えられており _{このブロックされた状態を分化誘導剤で} 解除して分化を進行させると、腫蕩細胞の悪性度の低下に伴った増殖の抑制、あるいは終末分化の誘導による悪性腫蕩の治癒を導くことが可能である。現在、臨床において最も効果が認められている分化誘導療法は、急性前骨髄性白血病 ( 以下

A

P L

と略記する ) に対する all-trans _{retinoic acid} _{( 以下} A T R A と略記する ) による治療である o A T R A による AP L の治療効果は、従来の化学療法をしのぎ、完

(7)

全寛解率 8 0

_{9 0}

_%

_{という高値が得られている} 2-4)o 頭頚部領域の固形癌に対しでも種々の分化誘導剤が試みられており、 13 -c i s レチノイン酸が口腔扇平上皮癌および白板症の治療に有効であること、更に second primary tumor の発生を抑制したことが報告されている 5， 6 )。我々は新規分化誘導斉IJベスナリノンがある種の唾液腺癌に対して治療効果があることを報告している

7) 。ベ

スナリノンは 2 -( 1 H ) ーキノリノンを基本骨格とする誘導体で、ジギタリスにかわる慢性心不全の経口治療薬として開発されたが

8) 、臨床試験中に重篤な副作用

である無頼粒球症の発現が明らかとなった o その副作用に対する研究過程で、ベスナリノンは in vitro および 1n v 1 v 0 において多くの腫湯細胞に対して分化・アポトーシス誘導活性、細胞増殖抑制活性を有することが明らかとなった 9 ) 1 0 ) 。また、我々もベスナリノンが in vitro および 1n v 1 v 0 においてヒト唾液腺癌細胞 (T Y S ) に対して増殖抑制作用を有することを確認している 10 - 1 2 )。前述の如くべスナリノンは臨床試験において _{ある種の悪性腫蕩に対して治} 療効果が認められているにもかかわらず _{その作用機} 序は不明であり、 _{ベスナリノンによる治療に対して抵} 抗性を示す腫蕩も多く存在する。 _{同一臓器に発生した} 悪性腫蕩で、組織学的な表現形質が類似していても、 4

(8)

その遺伝子変異の蓄積は多様であり、各種治療に対する反応性も一様ではな A P L はほとんどの症例において _{( 1 5} _{17) ( q 2 2} q 2 1 ) の相互転座が認められ 1 3 ) 、その結果レチノイン酸レセプター

α

( R A R α ) 遺伝子と P M L 遺伝子のキメラ遺伝子が形成され、そのキメラ遺伝子産物が P M L， R A R α の機能を問害し、 A P L 細胞の分化を閉止していると推察されている 1 4 - 1 6 ) 。そのような相互転座が認められる A P L には A T R A が著効するが、そうでない症例には全く効果が認められない。 _{従って} ベスナリノンによる治療に際しでも治療前に各腫蕩のベスナリノンに対する感受性 _{あるいは治療後の効果判定の診断法} の開発が必要である。 _{そのためにはベスナリノンの腫} 蕩細胞に対する分化・アポトーシス誘導活性 _{あるい} は増殖抑制活性の分子機構を明らかにする必要がある o 本研究ではベスナリノンに対して感受性を有するヒト唾液腺癌細胞 (T Y S ) を用いて、ベスナリノンの細胞増殖抑制作用のメカニズムを分子レベルで明らかにすることを目的とした。すなわち、ベスナリノンで処理を行った T Y S 細胞より抽出した m R N A より anti-<::f" n c l -s:e n s e e x p r e s s i o n c D N A library を構築し、

1 )

a n t i 又円 / C1l1 Ll-sense e x p r e s s i o n c l o n i n g 法、あるいは 2 ) r a n d o m s e q u e n c i n g 法による candidate g e n e searching によりベスナリノン 5

(9)

の細胞増殖抑制シグナルを伝える分子のクローニングを試み、その発現誘導、機能解析を行った。

(10)

実験材料ならびに実験方法

1 )

細胞及び培養法実験には当研究室で分離、樹立された T Y S 細胞を用いた o T Y S 細胞は口底部に発生した高分化型扇平上皮癌より樹立されたが、腺系の腫蕩マーカーである癌胎児性抗原 (C E A ) を発現しており、また酪酸ナトリウムで前処理した T Y S 細胞をヌードマウス背部皮下に移植すると腺房細胞癌を形成することより、口腔粘膜小唾液腺由来の腺肩平上皮癌細胞であると考えられている 17)0 T Y S 細胞の培養は、 10 % ( 容量 / 容量以下 V / V と略記する ) 牛胎児血清 ( 以下 F C S と略記する， B i o - W h i t t a k e r， ¥Valkersville ， M D )、 1 0 0 μ g/ m 1 ストレプトマイシン ( G i b c o Gaithersburg， M D ) 、 1 0 0 U / m l ペニシリン (Gibco)、

o.

2 5 μ g / m 1 アンホテリシン B (Gibco) を含むダルベツコ改変イーグル培地 ( 以下 D M E M と略記する， G ibco) を増殖培養液として用い、空気中に 5 % の割合で炭酸ガスを含む培養器内で、 3 7

t

にて行った。

2

) 細胞増殖能の評価法ベスナリノンは大塚製薬株式会社 ( 東京 ) より供与された。ベスナリノンは疎水性物質であり、増殖培養液には難溶性であるため培養液への添加は以下の様にし 7

(11)

て行った。まず _{ベスナリノンをジメチルスルホキシ} ( 以下 D 恥1S 0 _{と略記する} _{S i g m a ， S t} L 0 u i s ， M 0 ) にて _{1 0 m g / m 1 の濃度になるように} 溶解し _{それをベスナリノンの最終濃度がそれぞれ}

o

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1 ， _{1 0 ， 5 0 μ g}_/_{m 1 になるように} D M E M て希釈した。 _{この様にして調製したベスナリノンを含} む増殖培養液は、 4

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にて少なくとも _{ヶ月間は細} 胞増殖抑制活性の低下が認められなかった ( データーは示していない )0 T Y S 細胞の増殖に対するベスナリノンの影響を M T T 法を用いて評価した 1 8 ) 。すなわち、 9 6 ウエルマイクロフ。レート ( F a l c o n O x n a r d， C A ) に 2 X 1 0 3 _{個の} T Y S 細胞を植え込み、 2 4 時間後各濃度のベスナリノンを含む増殖培養液に交換した o 更に、 2 日間あるいは 4 日間培養した後、最終濃度が 1 m g / m l になるように 3-(3， 4-dimethyl-thiazol_2_yI)_2 ， 5-diphenyl tetrazolium b r o m i d e ( 以下 M T T と略記する _{S i}_g_{m a}₎ _{を加え、} _{3 7 'cで} ₄ _時間反応させた後、形成された M T T f o r m a z a n を 1 0 0 μ l の D M S O で溶解し、 O D 5 9 0 n m にて吸光度を測定することにより生細胞数を評価した。

3

) 細胞周期の解析法 1 0 0 m m プラスチックペトリ皿 (Falcon) にて 8

(12)

24， 4 8 ， 7 2 時間培養したベスナリノン処理 (5 0 μ g / m 1 ) および未処理 T Y S 細胞を回収し、 7 0

%

( V / V ) エタノール ( 和光純薬，大阪 ) にて固定した。固定した細胞を遠心後、

c

a + +， M g + + を含まないダルベツコのリン酸緩衝液 [ 以下 D -P B S (ー) と略記する ] にて洗浄後、 1 0 0 μ g/ m 1 の R N a s e A (Sigma) で処理し、 4 0 μ g / m ] のヨウ化プロピジウム ( S i g m a ) で染色し、デジタル全自動細胞解析装置 ( E P 1 C S X L - M C L Systeml 11 ， Coulter ， M i a m i， F L ) にて細胞周期の解析を行った。 4 ) R N A 調製法 T Y S 細胞からの Nonidet P - 4 0 cytoplasmic R N A は ( 以下 N P -4 0 と略記する Sigma) を含む低張緩衝液を用いて抽出した 19 ) 。すなわち、 0.5 % (V/V) N P - 4 0 を含む 2 0 m M Tris-HCI ( p H 7.5) 緩衝液にて細胞膜のみを溶解し、遠心により核画分を除去した上清を回収した。その上清を最終濃度

o.

5

%

( 重量 / 容量，以下 W / V と略記する ) のドデシル硫酸ナトリウム ( 以下 S D S と略記する _{和光純薬 ) で処理し、混在する蛋白質を} 変性後、フエノールとクロロホルムを加え蛋白の抽出除去を 2 回行った o 得られた上清よりエタノール沈殿にて核酸を回収し、 0.1 % (V/V) diethyl 9

(13)

p y r o c a r b o n a t e ( S i g m a ) 水溶液 ( 以下 D E P C 処理水と略記する ) に溶解した。この方法により細胞質に存在する核酸すなわち、 r R N A， t R N A m R N A とごくわずかのミトコンドリア D N A カf 回収できる。次に、この T Y S 細胞から抽出した c y t o p l a s m i c R N A よりポリ ( A ) + R N A をオリコ (d T ) セフアロースカラムを用いて精製した。すなわち、オリゴ (d T ) セフアロース ( P h a r m a c i a U p p s a l a， S w e d e n ) を結合緩衝液 [1 0 m M T r i s - H C l ( p H 7.5)， 0 . 5 恥1 N a C 1 (Sigma)] 中で膨潤させた後、 0 . 8 X 4 c m ポリフレツプカラム ( B i o - R a d， H e r c u l e s ， C A ) に充填し、 D E P C 処理水で洗浄後、結合緩衝液でカラムの平衡化を行った 0 7 0

t

で 4 分間処理し二次構造を取り除いた c y t o p l a s m i c R N A (1.0 m g ) に最終濃度

o

.

5

恥f _{になるように} _N_a_C₁ を添加後、オリゴ ( d T ) セフアロースカラムに通した。結合緩衝液でカラムを洗浄した後、 D E P C 処理水でオリゴ (d T ) に結合した R N A をカラムより溶出させ、エタノール沈殿後、再び D E P C 処理水に溶解した。 5 ) A n t i - s e n s e _{nted e x p r e s s i o n} _{c D N A} library の構築法ベスナリノンで 3 日間処理した T Y S 細胞より調製 n u

(14)

-したポリ ( A ) + R N A から antr-sense

orien ted e x p r e s s ion c D N A library を構築した 2 0 ) 。すなわち、精製したポリ ( A ) + R N A 5 μ g を鋳型にしてオリゴ (d T ) _{X h}₀ リンカープライ

マ

_{(S tratagene} L a Jol1a， C A ) を用いて逆転写酵素 _{M - M u L V R T ( M o l o n e y - M u r i n e} l e u k e m i a V 1 r u s reverse transcriptase ， Stratagene) で s i n g 1 _{e strand c D N A を合成} した後、 _{R N a s e H (S tratagene) で} R N A を部分分解し合成した s i n g 1 _{e strand c D N A を鋳型} にして D N A ポリメラーゼ 1 (S tratagene) で s e c o n d s trand c D N A を合成した。合成した c D N A の両端に E c 0 R _{アダプター} (S tratagene) を T 4 D N A リガーゼ (Stratagene) で連結し、その 5I 端を T 4 ポリヌクレオチドキナ _ゼ _{(S tratagene)} _{でリン酸化後、} X h 0 _{(S tratagene)} _{で消化し、} _{E c} 0 R _{( 宝酒} 造，大津 ) _S_a₁ _{( 宝酒造 ) で消化した} _{λ Z A P} E x p r e s s p h a g e vector (Stratagene) に T 4 D N A リガ、ゼで連結した o c D N A はサイトメガロウイルスア

_{フロモ}

_タ ( 以下 C M V

プロモ

_タと略記する ) に対してアンチセンス方向に挿入された。 c D N A が挿入された入 Z A P E x p r e s s p h a g e の ln vitro p a c k a g i n g を G i g a p a c k 11 G o l d 11

(15)

p a c k a g i n g extract (5tratagene) を用いて行い original p h a g e library とした。更に、その p h a g e library を大腸菌株 X L 1 - B l u e M R F ' (5 tratagene) に感染させ、大腸菌内で複製され溶菌により放出された ph a g e を回収し、 1s t . amplified p h a g e library とした。次に、 1s t . amplified p h a g e library と E x A s s i s t helper p h a g e (5 tratagene) を共に X L I - B l u e M R F ' に感染させ、切り出された一本鎖

の

filamentous p h a g e を回収した。回収した filamentous p h a g e を大腸菌株 X L O L R (5tratagene) に感染させ培養増殖させた後、大腸菌内で二本鎖環状 D N A として複製された p h a g e m i d を塩化セシウム密度勾配遠心法により回収、精製し、 p h a g e m i d library を得た。

6)

P o l y m e r a s e chain reaction ( 以下 P C R と略記する ) 法 P C R は d N T P s m i x t u r e ( 宝酒造 ) とプライマーは最終濃度がそれぞれ 2 0 0 μ M と 1 μ M となるよつに、 T a q D N A ポリメラーゼ ( 宝酒造 ) は最終濃度が

o.

0 5 U /μl となるように P C R 反応液に加え、サーマ }l/ V ルンークエンサー ( T S R - 3 0 0，岩城硝子，千葉 ) にて以下の条件で行った 2 1 ) 0 9 4

o

C

， 3 分間の 12

(16)

熱変性後、 9 4

o

C

， 6 0 秒、 5 5

o

C

_{9 0} _秒、 _{7 2}

_t

_， 150 秒を 3 0 サイクル、最後に 7 2 て D N A 断片の増幅を行った。 7 ) E x p r e s s i o n cloning 法

o

C

， 2 4 0 秒に 1 0 0 m m 径プラスチックペトリ皿 (Falcon) に 5 X 1 0 5 個の T Y S 細胞を植え込み、 10

%

(V/V) F C S を含む D M E M にて 24 時間培養後、

2 0 μ g の anti-sense _{lented expression}

c D N A library をエタノ _{ル沈殿後にリポフェクショ} ン法 22) [30 % (V/V) リポフェクチン (Gibco)] あるいはポリブレン法 2 3 ) ポリプレン (Aldrich ， M i l w a u k e e 1 0 μ g / m 1 W 1 ) ] にてトランスフエクシヨンを行った。トランスフエクシヨン後 7 2 時間培養し、 G 4 1 8 ( 7 0 0 μ g / m 1 ， Gibco) を含む選択培地に交換し、その培地に最終濃度が 5 0 μ g / m I になるようにベスナリノンを添加した。更に、 14 日間培養した後に G 4 1 8 およびベスナリノン存在下でもコロニーを形成した細胞を分離した。分離された細胞のベスナリノンに対する感受性の変化を M T T 法を用いて検索し、実際にベスナリノンに対する感受性が低下していた細胞からゲノム D N A を調製した。次に、発現ベクター ( p B K - C M V Stratagene) 上に存在する R N A ポリメラーゼ、プ 13

(17)

ロモーター ( T 3， T 7 ) に一致するプライマーを用いて P C R を行うことにより、ゲノム D N A にランダムに挿入された c D N A 断片を増幅し、回収した。その回収された c D N A 断片を E c 0 R 1・ P s t 1

(宝

酒造 ) で消化し、 G e n e C l e a n K i t 11 ( B i o 101， Vista ， C A ) にて精製した後、同じく E c 0 R 1， P s t 1 で消化した p B K - C M V に連結し、その組み換えプラスミドで大腸菌株 X L 1 - B l u e M R F ' を形質転換した。その形質転換した大腸菌株からアルカリ法 2 4 ) により、挿入された cD N A フラスミドの少量調製を行った後、断片の塩基配列の一部を決定した 25)o すなわち、 F 1 T C で蛍光標識した T 7 プライマーと T h e r m o S e q u e n a s e C y c l e S e q u e n c i n g K i t ( A m e r s h a m B u c k i n g h a m s h i r e， U K ) を用いてジデオキシ法により c D N A 断片の一部の塩基配列を決定した。アルカリ法により少量調製したプラスミドを鋳型とし、 F 1 T C ラベル T 7 プライマー、 d N T P s m i x t u r e およびそれぞれの d d N T P と D

1~

A ポリメラーゼ ( T 7 サーモシーケナーゼ ) 存在下に P C R を行いその P C R 産物を 7 M 尿素 (S i g m a ) 変性 1 0

%

( V / V ) シークエンスゲルにて分析した o 電気泳動と読み取りはオートシークエンサー ( S h i m a d z u D S Q - 5 0 0 D N A s e q u e n c e r，島津製作所，京都 ) 14

(18)

にて行った結果、約 2 0 0 --- 3 0 0 b p の塩基配列の決定が可能であった。次に、インターネットを介して

N

1 H の G e n B a n k あるいは E M B L データーベスより

B L A S T

プログラムを用い、決定された塩基配列のホモロジー検索を行った。

8

) ランダムシークエンシング泣f

antl-sense oriented expression c D N A

library により形質転換された大腸菌 X L 0 L R 株のコロニーをランダムに選択し、 50 μ g / m 1 のカナマイシン ( 和光純薬 ) を含む L B 培地 (S i g m a ) 中で約 6 時間増菌後、アルカリ法により p h a g e m i d を調製した。その調製された半分量の p h a g e m i d をサイクルシークエンシングの鋳型として使用し、挿入された c D N A 断片の塩基配列を一部決定し、ホモロジー給月二〆ノ[夫対立を行った。なお、残り半分の p h a g e m i d はノーザンフロット用の c D N A プロープの調製に用いた。

9

) ノーザンプロット法 cytoplasmic R N A ( 2 0 μ g ) を 2. 2 M ホルムアルデヒド ( 和光純薬 ) 変性 _~o _{( W / V )} _{アガロー} スゲル ( B io-Rad) で 4 0 m M M O P S ( S i g m a ) 緩衝液中で電気泳動後、 3 M N a C l， 0.3 M Cltric acid (S i g m a ) 水溶液 ( 以下 2 0

x

(19)

s

C と略記する ) 中でナイロンフィルタ ( H y b o n d - N +， A m e r s h a m ) に R N A をトランスファ

し

_{8 0}

_O

_C

_、 ₃ _{時間ベーキングを行い} _{R N A} _をフィルタ _{に固定した。続いて、} _{5 0}

_%

_{( V / V )} f o r m a m i d e (S igma)， 5 X Denhardt' s 液 [1

%

( W / V ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( 和光純薬 )

%

(羽T/V) ficoll (S i g m a )， 1

%

( W / V ) polyvinylpyrrolidone (Sigma)]， 5

×

s

S P E [ 0 . _{7 5 M N a C 1}_， _{2 0 m!}_l_r₁ _{T r i s - H C} ( p H 7 . 5 ) ， 2 . _{5 m M E D T A} _{( 和光純薬 )]}_，

_o

_.

1 % ( W / V ) S D S ，

。

_{μ g}_/_{m 1 s s D N A} (Worthington， _{F r e e h o l d}_， _N_{J ) 中で 4 2}

℃

4 時間プレハイブリダイゼーシヨン行った後に、ランダムプライマー ( A m e r s h a m ) と D N A ポリメラゼ I クレノウ断片 ( A m e r s h a m ) にて 3 2 p - d C T P ( A m e r s h a m ) ラベルした cD N A プロープを含むハイブリダイゼ _{ション液で} _{4 2}

_t

1 2 時間 ₆ _時間ハイブリダイゼ _{ションを行った} ₂₆₎ 0 O. 1 X S S C 、

。

₅ _% ₍_{W /}_{V ) S D S で室温} 1 5 分間 2 回 5 0 ℃ で _{3 0 分間} _{回洗浄後、} 乾燥しサランラ _{ツフ} で包み _K₀_{d a k X - O M A T A R フィルム} ( K o d a k， R o c h e s ter， _{N Y ) で} _{4 時間} _{5 日間の感光を行っ} た。 _{各クローンの} c D N A フローフやはランダムシークエンシングに使用した _{p h a g e m i d の残りを E c} 0 R

(20)

&EL F δ D 且 4 . _， •. ，で消化し、切り出された cD N A 断片を G e n e C l e a n K i t 11 にて精製することにより得た。また、ヒト T G F -s 1 は p h T G F B -2 ( A m e r i c a n T y p e Culture Collection ， Rockville ，

M D ) から S m a 1 ( 宝酒造 ) で切り出される 5 9 2 b P の断片を、ヒト s-actin は p H F s A - 1 ( A m e r i c a n T y p e Culture Collection) から X h 0 1 ( 宝酒造 ) で切り出される 2 . 1 k b の断片を、 c D N A フローブとして使用した。ヒト p 2 1 W A F 1 c D N A フローブの調製は以下の様にして行った。すなわち、 T Y S 細胞から N P -4 0 法にて抽出した cytoplasmic R N A を鋳型として p 2 1 W A F 1 に特異的なプライマー ( 上流 : 5'-cggagctgggcgcggattcg-3' ，下流 5' -ggaggaagtagctggcatga-3') を用いて R T - P C R を行い、増幅した P C R 産物を Ps t 1 で消化した後、同じく P s t 1 で消化しウシ小腸由来アルカリフォスファターゼ ( 以下 C 1 A P と略記する Boehringer M a n n h e i m， M a n n h e i m， G e r m a n y ) にて脱リン酸化処理を行った pU C 1 9 プラスミドベクター ( 宝酒造 ) へクローニングし、 P s t 1 により切り出される 2 0 8 b p の断片を c D N A プローブとして使用した。デンシトメトリック分析は N 1 H イメージ 1. 4 4 プログラムあるいは 17

(21)

B A S - 2 0 0 0 II イメージ分析システム ( 富士フィルム，東京 ) により行った。

1 0

) 完全長ヒト T S C - 2 2 c D N A のクローニング

法

ランダムシークエンスで得られたヒト T G F -

s

1 stimulated clone 2 2 ( T S C - 2 2 ) c D N A ( p B K -C 恥1 V - h T S C - 2 2 - 3 1) は 13 1 3 b P 、で open reading f r a m e ( 以下

o

R F と略記する ) を完全には含んでいなかった o そこで、 p h a g e m i d Iibrary の中に完全長ヒト T S C - 2 2 c D N A を含むクローンが存在すると考 _{え、}

_o

_{R F の} ₃ 側に存在する Ps t _{S 1}_t_e _{下流に} _{D P - 1} _{プライマ} (51 -a g ccagtctgcagctgggcctgaa_3 1) を設定し、ベクタ _{( p B K - C M V )} _{上に存在する} _{T 7} _{プライマ} とで P C R を行った o 更に、 D P -1 プライマーより 6 b p 上流に D P -2 プライマ (51 -tctgcagctgggcctgaaactgggc_31) を設定し、上流はマウス T S C - 2 2 c D N A の配列をもとに m U P プライマ (51 -atctagtttgaaccaggctg_3 1) を設定して 1st. P C R 産物を鋳型にして nested P C R を行つた o 増幅した約 4 5 0 b P の

P

C R 産物を T 4 D N A ポリメラーゼ ( 宝酒造 ) にて平滑末端にした後、

(22)

p U C 1 9 を S m a 1 にて切断し、 C 1 A P にて 51 端の脱リン酸化を行った部位にクローニングした ( p U C 1 9 - h T S C - 2 2 - 5 1)0 クローニングされた P C R 産物はシークエンシングにてヒト T S C -2 2 c D N A 51 側であることを確認した。 p B K - C M V - h T S C - 2 2 - 3 1 を Ps t 1 で消化し、切り出されたヒト _{T S C - 2 2 c D N A 3 1 側} P s t 1 断片を、 Ps t 1 で消化し C 1 A P にて脱リン酸化処理を

行った

p U C 1 9 - h T S C - 2 2 - 5 1

へ

T 4 D N A リガーゼ ( 宝酒造 ) で連結することによりほぼ完全長のヒト T S C - 2 2 c D N A を得た。 1 1 ) G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質の発現と精製法 p G E X 4 T - 2 ベクター (Pharrnacia) 上のグルタチオンー S- トランスフエラーゼ ( 以下 G S T と略記する ) 遺伝子の下流にフレームを合わせてヒト T S C - 2 2 c D N A O R F を挿入した。すなわち、 E c 0 R 1 リンカーを有する

o

R F 上流の F P 2 2 - U P フ。ライマ (51 - g G A A T T C c c a t g a a a t c c c a a t g g t g _ 3 1)、およぴ Sa 1 _{リンカーを有する}

_o

_{R F} _{下流の} F P 2 2 - D W フ。ライマー ( トー g G T C G A C c t a t g c g g t t g g t c c t g _ 3 1) を設定し、 p U C 1 9 - h T S C - 2 2 c D N A を鋳型として 19

(23)

P C R を行った。増幅した PC R 産物を E c 0 R 1， S a 1 1 にて消化し、同じく E c o R 1 ， Sal 1 で消化した p G E X 4 T - 2 に T 4 D N:A リガーゼで連結した後、その組み換えプラスミドで大腸菌 M C 1 0 6 1 r e c A - 株を形質転換した。形質転換した大腸菌株を L B 培地中で一晩増菌後、最終濃度

o.

1 m M となるように isopropyl-s-D-thiogalactopyranoside (以下 1P T G と略記する，宝酒造 ) を添加し、融合蛋白質の発現誘導を行った。大腸菌を 1 P T G 存在下で 5 時間培養した後に遠心集菌し、大腸菌溶解物を調製した。すなわち、溶菌緩衝液 [50 rnM T r i s - H C l ( p H 8.0) ， 1 0 0 m M N a C I ， 1 m M E D T A ] で大腸菌を再懸濁させ、プロテアーゼ阻害剤である phenylmethanesulphonyl fluoride ( P M S F ，

o

.2 m M ，和光純薬 ) とアプロチニン ( 1 0 0 U / m l ， Bayer ， L e v e r k u s e n ， G e r m a n y ) を添加後、リゾチーム (0.25 m g / m l ，和光純薬 ) を添加し、氷上で 20 分間処理し細胞壁を破壊した。更に、氷上にて超音波処理 (1 分間， 5 回 ) を行い、細胞を完全に破壊し遠心することにより得られた上清を径

o.

2 5

μ m

のミリポアフィルターにて j慮、過し、大腸菌溶解物とした。次に、大腸菌溶解物より G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質を精製した。すなわち、大腸菌溶解物をグル 20

(24)

タチオンセフアロース

4B

カラム

(Pharmacia)

に通し、カラムを

D-PBS(-)

で洗浄した後に還元型グルタチオン

(10 m M

，

Sigma)

溶液にてグルタチオンに結合した

GST-TSC-22

融合蛋白質を溶出した。 1 2 )

Anti-sense phosphorothioate

oligodeoxynucleotides

( 以下アンチセンスー

S

ーオリゴと略記する ) の T Y S 細胞の増殖に及ぼす影響の検索法まず、アンチセンスー S - オリゴの T Y S 細胞の対数増殖期における影響を検索した 27) 。約 2 X

10

3 _個の T Y S 細胞を 9 6 ウェルマイクロプレ _{トに植え込} み、

₁₀

_%

_{(V/V) F C S}

_{を含む}

_{D M E M}

_{にて}

₂

₄

_時間培養後、ヒト

TSC-22 m R N A

に対するアンチセンスー S- オリゴ

(5' -tgggatttCATgcaattgca

四

3'

) 、センスー

S

-オリゴ (

5

'ー

tgcaattgcATGaaatccca-3' )

を最終濃度

10 μ M

になるように添加した

10 %

(V/V)

F C S

を含む

D M E M

に交換した。更にベスナリノンを添加する場合は最終濃度が _{5 0}

_μg

_/

_{m 1}

_{となるょっ} に添加した。

₂

_{日間培養後に}

_S

_{- オリゴを含む培養液} を交換し _{更に}

₂

_{日間培養した後、} 恥1

T T

法にて細胞数を評価した。次に _{アンチセンスー}

_S

_{- オリゴの}

_{T Y S}

細胞の増殖静 21

(25)

止期における影響を検索した。約

1 X

104

_{個の} T Y S 細胞を 9 6 ウェルマイクロプレートに植え込み

10 %

( V j V )

FCS

を含む

D M E M

にて

24

時間培養後、 F C S を含まない

D M E M

に交換した。更に 2 4 時間培養し細胞がほぼコンフルエントになった段階で、ヒト

TSC-22

m R N A に交すするアンチセンスー

s

- オリゴ (51 -tgggatttCATgcaattgca-31)、センス -S - オリコや (51 -tgcaattgcATGaaatccca-31) を最終濃度

1 0 μ M

含む無血清

D M E M

に交換した。更にベスナリノンを添加する場合は最終濃度が 5

0 μ g

j m

1

となるように添加した。 2 日間培養後に S- オリゴを含む培養液を交換し、更に 2 日間培養した後、

M T T

法にて細胞数を評価した。

2

(26)

結果

1 )

T Y S 細胞の増殖に及ぼすべスナリノンの影響

5 0 μ g

/

m

1

の濃度のベスナリノンは処理後

4

日で著明に T Y S 細胞の増殖を抑制したが、

o.

1 --- 1 0 μ g / m 1 の濃度のベスナリノンではほとんど効果が認められなかった (図 1 ) 。位相差顕微鏡下の観察により、

50 μ g

/

m 1 のベスナリノンで処理した

T Y S

細胞はやや膨化した状態で細胞増殖を止めるものの、培養 1 --- 2 週間では浮遊してくる細胞はほとんど認められなかったことから、ベスナリノンの

TY S

細胞に対する増殖抑制作用は cytocidal なものではなく、 cytostatic なものであると考えられた。また、ベスナリノンの溶媒として用いた D M S O にも T Y S 細胞に対する増殖抑制効果が若干認められたが、ベスナリノンによる増殖抑制効果よりは、はるかに低く、その影響は無視できるものであった o 更に、

1 0 0 μ g/

m

1

の濃度のベスナリノン添加増殖培養液は

4

' c で長期保存中あるいは 3 7

o

c

で培養中にもベスナリノンの結晶が析出してくるため、以後の実験は細胞増殖抑制作用を示しかっ、結晶化してこない最大の濃度である 5 0 μ g / m 1 のベスナリノン濃度にて行った。 2 ) ベスナリノンの

TY S

細胞の細胞周期に及ぼす影響

(27)

未処理 T Y S 細胞では増殖培養液交換後、 2 4 時間日では盛んな D N A 合成が認められ、約 5 0

%

の細胞が S 期、 G 2 / M 期に存在していた。培養液交換後 4 8 時間、 7 2 時間目では徐々に G 0 / G 1 期の細胞の割合が増加し、 S 期および G 2 / !vl 期の細胞の割合が低下してきた。これは血清中の増殖因子の消費あるいは接触阻止による細胞増殖の抑制の結果と考えられる。方、ベスナリノン処理 T Y S 細胞は未処理 T Y S 細胞と比較すると、処理後 2 4 時間目で明らかに S 期、 G 2 / M 期の細胞の割合が低下しており、 4 8 時間後以降においては G 1 arrest が認められた ( 図 2，表

3

) ベスナリノン処理

TY S

細胞からの antl-sense oriented e x p r e s s i o n c D N A library の構築 5 0 μ g / m 1 のベスナリノンで 7 2 時間処理した T Y S 細胞より精製した m R N A より、 anti-sense orlented e x pres s ion c D N A library を構築し

た o original 入Z A P E x p r e s s p h a g e library は約 1.5 X 10 5 _{個のクローンを含んでおり、その}

約 _{9 0}

% は組み換え体であった o original p h a g e library を一回増幅し、 in vivo excis ion を行

い p h a g e m i d library を得た o p h a g e m i d

(28)

library を構成する p B K - C M V p h a g e m i d vector は晴乳類動物細胞において強い転写活性を示す C M V プロモーターを有しており、ベスナリノン処

理

TY S

細胞より得られた c D N A 断片は C M V プロモーター下流にアンチセンス方向に挿入されている (図 3 ) 0 構築した library の各クローンに含まれる c D N A 断片の長さは

o.

5 - ターは示していない ) 。 2 . 5 k b であった ( デ

4)

Anti-sεn _{~t; nse}~ _{e x p r e s s i o n c l o n i n g} antl-sense oriented e x p r e s s i o n c D N A library を T Y S 細胞にトランスフエクシヨンし、 G 4 1 8 およびベスナリノン存在下でもコロニーを形成したトランスフエクタント ( V e s n a r i n o n e reSlstant c l o n e，以下 V R C と略記する ) を 8 クローン分離した o 分離した全てのクローンのベスナリノンに対する感受性の変化を

M T T

法にて検索した結果、 V R C 4 と V R C 7 は明らかにベスナリノンに対する感受性が低下していた ( 図 4)0 V R C 4 は親

株

T Y S 細胞に比較してその増殖能が極端に低下していたためトランスフエクションの影響、あるいは clonal heterogeniety での増殖能の変化と、それに伴う相対的なベスナリノン抵抗性の上昇の可能性が高いため、それ以上の解析は行わなかった o 一方、

(29)

V R C 7 は親株 T Y S 細胞と比較してその増殖能はほとんど変化しておらず、かつベスナリノンに対する抵抗性も再現性を有していたため、 V R C 7 に導入された cD N A 断片を回収した。回収した c D N A 断片の部の塩基配列を決定し、ホモロジー検索を行った結果、 h u m a n r i b o s o m a l protein L 2 1 であった o e r y t h r o l e u k e m i a 細胞 (K 5 6 2 ) での分化・アポトーシス誘導あるいは m y o b l a s t s から m y o t u b e s への分化誘導での r i b o s o m a l p r 0 t e i n の d o w n - r e g u l a t i o n の報告はあるが 2 8 ， 2 9 ) 、我々のシステムにおいて単一の ribos o m a l protein の特異的な発現抑制のみが T Y S 細胞におけるベスナリノン抵抗性の直接原因であるとは考え難かった。本研究では V R C 7 において実際に ribos o m a l protein L 2 1 m R N A およびそのタンパク質の発現低下が見られるか否かの検索はしていないが、 V R C 7 のベスナリノンに対する抵抗性は r i b o s o m a l protein L 2 1 の発現抑制によるある種の蛋白質合成阻害の結果であると考えられた。 5) C a n d i d a t e g e n e searching ベスナリノン処理 T Y S 細胞より構築した anti-sense oriented e x p r e s s i o n c D N A library からランダムに選択した 1 0 7 クローンに 26

(30)

ついて挿入された _{c D N A 断片の塩} _基 _{配列を決定し} ホモロジー検!索を行った。 _{その結果、} _約 _{6 4} % が既知の遺伝子で約 1 8 % _{がデーターベースに登録は} されているが機能が未知の遺伝子、 _{残る約} _{1 8} _% _カ_ま全く未知の遺伝子であった。 _{その中で} _{既知の遺伝子} の約 3 0 % _{が以下の様な細胞の増殖、} _{分化あるいは} アポトーシスに関与していると推測される遺伝子であった ( T S C - 2 2 ， H S C 7 0 ， C K ₉_， _{S 0 S}_， N G F R - r e l a t e d l y m p h o c y t e activation molecule ， I L - 6 ， T A F I I A ， elongation factor-1y， I L - 1 / T N F inducible E S T， D N A - b i n d i n g protein A ， a n e x i n 11 ， D N A - d e p e n d e n t protein k i n a s e catalytic subunit， r a b - G D I， S U I _translation

lnltlation factor， lys os o mlal protective protein， T N F - α i n d u c i b l e protein B 1 2， A D P - r i b o s y l a t i o n factor， p h o s p h o l i p a s e A 2， a n d 13 k D a differentiation-associated protein)o 次に、上記遺伝子の T Y S 細胞におけるベスナリノン処理による発現誘導の有無をノーザンブロットにて検索した。ほとんどの遺伝子は経時的な変化は認めるものの、ベスナリノンによる明らかな発現誘導 - は認められなかった ( データ _{は示していない )} 0 しかし、これらの遺伝 27

(31)

子の中で T S C - 2 2 遺伝子は T Y S 細胞において培養日数、すなわち細胞密度に比例してその発現増加が認められ、かつベスナリノンは著明にその発現を増強した ( 図 5 ， A ， B )

。

6

) 完全長ヒト T S C - 2 2 c D N A のクローニングと全塩基配列決定 T S C -2 2 遺伝子は T G F -

s

1 および FS H により誘導される遺伝子と _{して既にマウス} フツトでクローニングされており _{ロイシンジッパ} 構造を有していると推測されている 3 0 ， 3 1 )。 _{ランダムシ} クエンシングで得ュた _{ヒト} _{T S C - 2 2 c D N A}_. 断片 ( 1 3 1 3 b P ) は、 r元-ι. 宝ノ¥.なL

o

_{R F を含んでいなかったため、} library の中よりヒト T S C - 2 2 c D N A 5 側断片をクロ _{ニングし} _{既にクローニングされている} 3 側断片と連結することによ _り _{ほほ完全長のヒ} ト T S C - 2 2 c D N A をクローニングし、全塩基配列を決

定した

(図 _{6 ， A ， B ) 。ヒト} _{T S C - 2 2 c D N A} は 1 6 0 0 b p より成り、 4 3 2 b p の

o

R F を含んでいた o c D N A の全塩基配列はマウス、ラットと 7 9 % の相向性を有しており、

o

R F 内は 92 % の相向性を有していた o 更に、予測されるヒト T S C -2 2 蛋白質のアミノ酸配列はマウス、ラットと 9 8 % の相同性を有していた o ヒト T S C -2 2 蛋白質は 1 4 4 残基 28

(32)

より成りマウス、 _{フツ} _{トと比較するとコ} _{ドン} 4 2 セリンが挿入され _{コドン} _{1 4 1} _{のセリンカ} f プロリンに置換されていた。 _{また} _{コドン} _{7 7} のロイシンからコドン _{9 8 のロイシンまでの} ₇ 残基ごとのロイシンの繰り返し配列 _{すなわちロイシンジッパー構造と推} 測される配列は保存されていた。 _{更に} _{カゼインキナ} ーゼ 11 によりリン酸化を受けると推測されるコドン 8 9 のセリンと、プロテインキナーゼ C によりリン酸化を受けると推測されるコドン 3 6 のセリンも保存されていた (図

6

，

B

，

C)

。 7 ) G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質の発現と精製ヒト T S C - 2 2 c D N A 核酸配列より推測される

o

R F が安定な蛋白質を発現し得るのか検索するため、あるいは今後の T S C - 2 2 蛋白質の機能解析のために、大腸菌による組み換え T S C - 2 2 蛋白質の発現と精製を行った o すなわち、 p G E X 4 T - 2 vector 上の G S T 遺伝子下流にフレームを合わせてヒト T S C -2 2 c D N A O R F を挿入し、大腸菌にて G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質を発現させた ( 図 7， A ) o I P T G で融合蛋白質の発現を誘導すると、分子量 4 4 k D a のところに G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質と推測されるバンドが出現した (図 7， B ) o G S T の分子量が 26 k D a であることを考慮すると、 T S C -2 2 の分子量は 1 8 29

.

「一一ー一ーーー一一一一一

;

.

_

・

一一一一一ー一ーーーーーー一一一一一一一一一一

・

開

r 噛比一一刊十六て'.04.';

ー

・

(33)

k D a となり、

o

R F より推定される分子量と一致した。更に、 G S T がグルタチオンに結合する特性を利用しグルタチオンアフイニティーカラムを用いて G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質の精製を行った。その結果、銀染色と同程度の感度を有するサイプロオレンジ染色 (Bio-Rad) にて、分子量 4 4 k D a の G S T - T S C - 2 2 融合蛋白質がほぼ単一バンドとして認められるまで精製できた ( 図 7 ， C ) 0

8

) ベスナリノン処理 T Y S 細胞における T S C - 2 2 ， T G F - s l ， p 2 1 W A F l の発現誘導 T S C -2 2 遺伝子はマウスにおいて T G F -s 1 で発現誘導を受ける遺伝子としてクローニングされたこと 3 0 ) 、更に P 5 3 変異細胞では P 5 3 非依存的に T G F -s 1 が cyclin dependent kinase lnhibitor p 2 1 W A F 1 の発現を誘導し、 G 1 a r r e s t を誘導すると報告されていることより 3 2 ) T Y S 細胞における T S C -2 2 の上流、下流のシグナルを検索する意味でベスナリノン処理による T G F - s l ， p 2 1 W A F l の発現を検索した。その結果、 p 2 1 W A F l はベスナリノンにより著明な発現誘導が認められ ( 処理後 1 日目 1 6 2 % . 2 日目 1 7 9 % 3 日目 1 9 0 %， 4 日目 2 9 8 %)、 T G F -

s

1 においても僅かな発現誘導が認められた ( 処理後 1 日目 30

ベスナリノンによるヒト唾液腺癌細胞(TYS)の増殖抑制機構の解析

様式

5

論 文 内 容 要 旨

題 目

内容要旨〈和文約

1

. 500

字

〉

公 一

、

、

3

A

n

a

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y

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論文内容要旨

題目

公一