三重大学大学院工学研究科 博士前期課程分子素材工学専攻 中 町 信 敏

ゲルの厚さによる

間葉系幹細胞の上皮分化への影響

平成 25 年 度 修 士 論 文

三重大学大学院工学研究科 博士前期課程分子素材工学専攻

中 町 信 敏

二県大

γ :

大

1 . 緒言・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ー ‑ ・ ・ ・ ・ 3

1 ‑ 1 .

再生医療

1 ‑ 2 .

幹 細 胞

1 ‑ 2 ‑

1.間葉系幹細胞

1

・

3 .

間葉系幹細胞の分化制御

1 ‑ 3 ‑

1.幹細胞

n i c h e

1

・

3 ‑ 1

・1.物理的因子

1

・

3

・

1 ‑ 2 .

生物学的因子

1

・

3

・

1

・

2

・

1 . c o l l a g e n

ト

3 ‑ 1 ‑ 2 ‑ 1 . e l a s t i n 1

ふ

1

・

3 .

化学的因子 ト子

2 .

上皮分化

l

ふ

2 ‑

1.物理的手法

1

ふ

2

・

2 .

生物学的手法

1

・

3

・

2

・

3 .

化学的手法

2 . 目的・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 1 2 3 . 方法・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 1 3

3‑1.間葉系幹細胞の'性質について

3

・

2 .

ゲ、ノレ上培養(ゲ、ノレ厚み)による分化制御

3

・

2 ‑ 1

ゲ、ル作製/コーティングデ、イスク作製

3

・

2

・

2 .

細胞培養

3 ‑ 2 ‑ 3 .

分化評価

3 ‑ 2 ‑ 4 .

ゲ、ノレの弾性率測定

3

・

2

・

5 .

ゲ、ノレ上における細胞骨格 子

2

・

6 .

アクチン重合の阻害

3 ‑ 2 ‑ 7 .

上皮分化誘導因子の添加

3 ‑ 2 ‑ 8 .

ゲ、ル上で、の細胞動画撮影

3 ‑ 3 .

統 計 処 理 法

4 . 結果・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 1 9

4 ‑

1.厚さの異なるゲ、ノレ上における上皮分化

C c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現)の評価

4

・

2 .

厚さの異なるゲ、ル上における上皮分化メカニズム

4

・

2

・1.異なる細胞外マトリックスによる影響

一重大学大学院

4

・

2 ‑ 2 .

圧縮弾性率測定

4 ‑ 2

・

3 .

厚さの異なるゲ、ノレ上における細胞骨格

4

・

2

・

4 . a c t i n

重合阻害試験

4

ふ

5 .

上皮分化誘導因子の添加試験

4 ‑ 2 ‑ 6 .

ゲ、ノレ上における細胞挙動(動画)

5 . 考察・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 3 0

5

・

1 .

細胞足場材料が分化へ与える影響とそのメカニズム

5 ‑ 2 ‑

1.足場の物性による分化への影響

5

ふ

2 .

異なる細胞外マトリックスによる影響

5

ふ

3 .

ゲノレの厚みによる細胞骨格への影響

5

ふ

4 .

細胞骨格が上皮分化に与える影響

5

ふ

5 .

上皮分化誘導因子が与える影響

5 ‑ 2

^・

6 .

厚さの異なるゲ、ノレ上における

c y t o k e r a i n ‑ 1 8

発現メカニズム

5

・

2 .

ゲル上培養による多様な分化への応用

6 . 結論・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 42 7 . 参考文献・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ 4 3 8 . 謝辞・・・・・・..  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  .  . ・ ・ ・ ・ ・ 44 9 . A p p e n d i x .   • ・  • ・  • • • • ・  • • • • ・  • ・  ・  ・  ・  ・  ・  • ・  ・  ・  ・  ・  ・  • ・  ・  • • ・  ・  ・  ・  • • ^{・ ・ ・ ・ ・ ・} 4 9

9

圃1.各種溶液の調整

9

・

2 .

細胞培養

9

・

3

細胞の解凍方法

9 ‑ 4 .

コラーゲ、ンゲ、ル作製

9 ‑ 5 .

エラスチンゲ、ル作製

9

・

6 .

コーティングデ、イスク作製

9 ‑ 7 .

免疫蛍光染色

9

^・

8 .

圧縮弾性率測定

9 ‑ 9 .

細胞動画撮影

‑2  ‑

1 . 緒言 1

・

1 . 再生医療

組織が疾病や外傷などによって損傷した場合や、正常な機能を果たせなくなった 場合には従来、臓器移植や人工臓器を用いた治療が行われてきた。しかし、臓器 移植では、ドナー数の不足に加え、感染症、拒絶反応、倫理学的問題などとしりた 問題をはらんでおり、また、人工臓器に関しては、実際の体の組織を完全に模倣す ることが現段階では困難であり、さらなる研究・開発が求められる。そこで近年では、

ヒトの体細胞を医療へ応用させる『再生医療』が新たな治療法として注目されている。

再生医療では、ヒトの体細胞が持つ自己修復能力のメカニズムを解明し、応用する ことにより、拒絶反応や後遺症の回避など、生体への負荷を最小化にするとともに、

より自然な状態での修復の実現を図ることを目標にしている。その中でも、比較的 人体からの採取が容易であり、

i nv i t r o

での培養もでき、さらには多分化能を有する 点で幹細胞を用いた再生医療が広く注目されている(1)。

1

・

2 . 幹細胞

幹細胞とは自己複製能と分化した細胞を作る能力を併せ持った細胞で、あり、様々 な臓器において幹細胞の存在が知られている。血液、皮膚、生殖器などの細胞は 一度分化し成熟すると、それぞれ定まった寿命をもって死滅し、個体の寿命と比較 すると極端に短い寿命しカもたない。これを補給するために未分化の幼若細胞が 新たに増殖、分化し、成熟して定常状態を保っている。このような幼若、未分化の 親細胞を幹細胞と呼ぶ。その中でも再生医療への応用が期待されている幹細胞に は、

ES

細胞、

i P S

細胞、

Muse

細胞、間葉系幹細胞が挙げられる(2)。

1

^・

2

^・

1 . 間葉系幹細胞

間葉系幹細胞

( m e s e n c h y m a ls t e m  c e l l : M S C )

は自己複製能と骨芽細胞、軟骨細胞、

脂肪細胞、骨格筋細胞、靭帯細胞などの間葉系組織への多分化能を有する中腔 葉由来の体性幹細胞である。間葉系幹細胞は生体組織においては骨髄間質なら びに真皮・骨格筋・脂肪組織などの結合組織に存在し、生体の結合組織(間葉系 組織)の恒常性の維持や修復に機能している。骨髄中に存在する間葉系幹細胞の 割合は、成人では骨髄に含まれる細胞の数十万分のーと考えられており、年齢とと もに減少してして。間葉系幹細胞であることを特定できる指標は未だ報告されてお らず、

1 )

接着性を有する、

2 )

表面マーカー解析において

CD29

、

CD44

、

CD90

、

CD105

、

CD73

陽性、

CD14

、

CD34

、

CD45

、

CD11b

、

CD79α

、

CD19

、

HLA‑DR

陰性、

3 )

骨、脂肪、軟骨への分化能を有している、これらを総合的に満たしているものを

‑3  ‑

間葉系幹細胞として同定している。間葉系幹細胞は多種の細胞への分化能を有す るが、軟骨細胞・骨芽細胞・脂肪細胞・骨格筋細胞・分化誘導に関して

10%

血清、

デキサメタゾン、ドーグリセロリン酸、アスコルビ、ン酸を加えると骨芽細胞、デキサメタゾ ン、トメチル

‑ 3 ‑

イソブチルキサンチン、インスリン、インドメタシンを添加すると脂肪 細胞へ分化誘導できる。また遠心によりペレット状にし、 無血清下で

TGF‑sを作用

させると軟骨細胞に、分化誘導することができる。さらに、脱メチノレ化剤で、あるふア ザシチジンやアンフォテリシンで処理すると、骨格筋細胞に分化誘導できる。また近 年では外圧葉由来である神経細胞や上皮細胞への分化誘導も報告(列されているこ とから、更なる治療への応用が期待されている。

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F i g . l

^・

1問葉系幹細胞の分化

(4)

‑4  ‑

三重大学大学院 に学研究科

1 ‑ 3 . 間葉系幹細胞の分化制御

間葉系幹細胞の分化制御方法として、重力や足場の弾性を利用した物理学的手 法、コラーゲ、ン等の細胞外マトリックス

(ECM)

を利用した生物学的手法、そして化学 物質やサイトカイン、成長因子等を利用した化学的手法があげられる。本研究では、

物理学的因子として足場の物性、コラーゲ、ンやエラスチンとし、った細胞外マトリック ス

(ECM)

、

ATRA

等の化学物質による間葉系幹細胞の分化制御を目指している。

1

ふ

1 . 幹細胞 n i c h e

幹細胞は生体内において各々、結合組織や体液、他の細胞とし1ったものに固ま れて存在している。このように幹細胞を取り巻く微小な環境のことを幹細胞

n i c h e

と いう。幹細胞は、それぞれの環境に合わせて自身の形態また性質を変える。つまり この

n i c h e

が細胞挙動制御に大きく関わっているのである。なので、

i nv i t r o

におい て幹細胞の制御を行うことを目的とした場合には、この幹細胞

n i c h e

の再現又は模 擬、そこから考えられるメカニズムを理解することが重要で、あるとし、える。現在考えら れている幹細胞

n i c h e

の主要因子としては次のような

3

つのことが考えられている

(5) 。

1 )

液性因子・・・幹細胞周辺に存在するサイトカインや

pH

など

2 )

細胞外マトリックス

(ECM)

・・・ 幹細胞が接着している細胞外マトリックス

3 )   n i c h e

細胞・・・幹細胞の周囲或いは接着してそれを支持している細胞

これらの因子が複雑な関連性を持ち、それぞれが複合して幹細胞と相互作用する ことにより各組織の恒常性を保っている。近年では様々な研究の積み重ねにより幹 細胞

n i c h e

が少しずつ明らかになってきている。そしてここで、本研究に用いている 骨髄由来問葉系幹細胞の幹細胞

n i c h e

についてであるが、骨髄は骨内部を埋める 柔組織であり、その中には主に浮遊性の細胞である血球系と接着性の細胞である 間葉系、これら

2種類の細胞が含まれており、さらにそれぞれの幹細胞も存在して

いる。また、それら細胞を取り巻く様々な細胞外マトリックスも存在しており、以下に 示すような構成要素から成っている。

T a b l e l ‑ l

骨髄内に存在する細胞種、細胞外マトリックス(6)

血球系細胞 造血幹細胞、赤血球、白血球、好中球、単球など 間葉系細胞 間葉系幹細胞、間質細胞、脂肪細胞など 細胞外マトリックス

I

、

E

、

R

人

V

型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン

シンデカン、パーリカン、ビグリカン、ヒアルロン酸など

‑5  ‑

また、本研究での分化制御を目的とした上皮細胞の

n i c h e

はどうし1ったものになっ ているのだろうか。ここで、上皮細胞環境

( n i c h e )

について述べる。広く知られている腸 管

n i c h e

には隣接する上皮細胞、筋線維芽細胞、腸の神経細胞、内皮細胞、上皮 内リンパ球などの細胞要素および基底膜を含む様々な細胞外マトリックスの否細胞 要素で構成されている。この中でも特に、線維芽細胞は自身が分泌するサイトカイ ンによって

n i c h e

における幹細胞様形態維持に重要な役割を果たしているといわれ ている(7)

。

上皮細胞と直接接着している基底膜は

F i g . 1 ‑ 2

に示したような構造を有し ており、細胞と

i n t e g r i n

等を介して接着している。また、幹細胞の生存維持において は上皮細胞と間葉系細胞の相互作用に関連した

Wnt

シグナノレが重要で、あるだ、ろう と考えられている(8)(9)(10)

。

Collagen IV 

L<mufllll 

Celf receptors 

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F i g .

ト

2基底膜構造

(11)

一般的に幹細胞の分化制御方法としては、物理学的手法、生物学的手法、化学 的手法があげられる。そこで、次に各々の因子について述べてして

。

‑6ー

ス葉大学大学院ょっ々研究科

1 ‑ 3

^・

1 ‑

1.物理的因子

近年では、足場弾性を利用した幹細胞の分化制御が数多く報告されている(12)1(3)

。

間葉系幹細胞を弾性率がそれぞれ

1

、

1 0

、

100kPa

程度の足場で培養させると、各 足場において神経細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞へと分化したことが報告されてい る(14)。これら弾性率は IIIVIVOにおける各組織の弾性率を模倣しており、間葉系幹 細胞の分化は足場の弾性率に依存しているものと考えられている

( F i g . 1 ‑ 3 ) 。

A 

81 

. . . ・ ・

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Hasticity of 

問iぞrOEn'JlfOηmeht

B 

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IJ 

EF

﹄守山山LP﹄寸向

F i g . 1 ‑ 3

足場弾性による問葉系幹細胞の分化制御(13)

また足場の弾性だけにとどまらず、幹細胞の挙動を制御している物理的な因子に はせん断応力(14)(15)、足場の形状(16)、機械刺激(17)などが代表的なものとして報告さ れている(18)

。

近年ではこれら様々な研究から、細胞は機械刺激却、った外力を認 識するセンサー(メカノセンサー)を有しており、それを駆使して機能調節を行ってい ることが明らかとなってきた^O 細胞は、接着班を介してストレスファイバーにより近傍 の

ECM

や細胞を引っ張り、対象の機械的応答(伸び)を認識することで、絶えず周 囲の機械的性質を把握しており、その結果に基づき、形態、運動、増殖、分化、形 質転換など、の機能調節を行っていると考えられている(19)

。

‑7  ‑

て重大学大学院で手研究科

1

・

3 ‑ 1 ‑ 2 .

生物学的因子

幹細胞は

l n

VIVOにおいて、それぞれの組織に応じた微小な環境

( n i c h e )

下で、存 在しており、その主要な成分としては細胞外マトリックス

(ECM)

があげられる。細胞 は三次元的に

ECM

に固まれた状態にあり、常にその影響を受けている。それが細 胞の増殖や分化とし1った細胞挙動制御に大きく関わっていると考えられている。現 在では、この考えに基づき、

l n

VIVOに存在する

ECM

を中心とした足場を生物学的 因子として用いた研究が進められている。特に

i nv i v o

において多く存在している

ECM

として

c o l l a g e n

足場を用いた研究が数多く報告されている。近年では、それら 足場材料と細胞との応答メカニズムの解明を目的とした研究が盛んである。これら を解明するにあたっては、細胞と

ECM

聞の界面における接着がどのようになされて いるか、またそこから生じてくるシグナル伝達はどのようなものか。これらの理解が非 常に重要となる。

次に本研究で用いた

ECM

について述べる。

1

・

3 ‑ 1

・

2

・

1 . c o l l a g e n

c o l l a g e n

は動物の皮膚、血管、鵬、筋膜、骨などのほとんどの組織に含まれている 主要なタンパク質であり、体を構成する総タンパク質量の約

30%

を占めている。そ のため、細胞の足場材料として広く用いられている。

c o l l a g e n

は、分子量が約

1 0

万

kDa

のポリペプチド鎖

3

本から成る三重螺旋構造

( t r i p l eh e l i x )

をとったもので¥

1

分 子当たり分子量は約

30

万

kDa

、長さは約

300nm

、太さは約1.

5nm

となる。また、特 徴的なアミノ酸組成として

G l y ‑ X ‑ P r o

あるいは

Gly‑X‑HyPro(X

は任意のアミノ酸、

HyPro 

はヒドロキシフ。ロリン)のトリペフ。チド、単位が繰り返される構造を有している(20)。 細胞は、膜貫通受容体である

i n t e g r i nf a m i l y

を介して

ECM

と接着していることが 知られている。それによって特異的な遺伝子の発現、増殖、分化等の制御が行わ れている。また特に

i n t e g r i n

の中でも

α1s1

、

α2s1

、

α 1 0 s 1

、

α 1 1s  1 i n t e g r i n

は、

c o l l a g e n

レセプターとして報告されている(21)。細胞は

ECM

と接着する際

i n t e g r i n

を 介して接着班

F A K ( f o c a la d h e s i o n )

を形成する^O この

ECM

による刺激(接着)により

FAK

のリン酸化が起こり、

FAK

が活性化される。次いで、

S o s

→Ras→Raf→MEK→

ERK

経路

(MAPKs i g n a l )

を経由して、間葉系幹細胞は骨分化誘導される(22)(23)(24)。

四

8

^田

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F i g . 1 ‑ 4

間葉系幹細胞

‑ECM

作用機序

(MAPK

経 路)(23)(2心

1 ‑ 3 ‑ 2 ‑ 2 ‑ 2 . e l a s t i n  

elastin は主に大動脈(約 30~50%) 、靭帯 (50%) 、肺、皮膚(2~5%)など弾性を必要

とする組織の主要な繊維状たんぱく質である。

e l a s t i nは、分子量が約 65kDaの可

溶性前駆体トロポエラスチンがリシルオキシダーゼにより架橋し形成されたもので、

構成アミノ酸としては主にグリシン、バリン、修飾アラニンおよびフ。ロリンから成って いる。また、

e l a s t i n

は生合成過程にて前駆体のトロポエラスチンにおける

4

つのリシ ン側鎖が互いに架橋する特徴的な構造(デスモシン)を有している。そのため、

e l a s t i n

は収縮・弛緩を繰り返すことができ、生体内における弾性を保つに至ってい る(25)。

また近年では、

e l a s t i n

が

ECM

として細胞の増殖、遊走、接着、分化などの機能調 節にも関与していることが明らかになってきている。例えば、細胞表面に存在する

E B P ( e l a s t i n  b i n d i n g   p r o t e i n )

と呼ばれる結合タンパクが

e l a s t i n

における

VGVAPG

配列を認識、結合しその後の機能調節を行っていることが知られている(26)(27)。

国 9‑

L ' 予 ・

》分チ量67kDa

》疎水性タンパク質 シ伸縮性

》架橋構浩 シ不溶性タンパク質 シ YG\~.\PG配列

1

^・

3

^・

1

^・

3 .

化学的因子

.̲  _{・ ‑ 4}

砂

E l a s t i n

分子

日00ぐ..'Ala‑Ala‑L

、

's‑Ala‑Ala  Sl'r‑

、 ' L

'S‑Ala ‑Ph^{l"  . .} 

c o o n   Fig . 1 ‑5  e l a s t i n

構 造

また、幹細胞はlnVIVOにおいて様々な成長因子を含むサイトカインやホルモンの

パラ分泌/傍分泌により増殖や分化等の制御がなされている。 i nv i t r o における培養

系ではそれら成長因子(化学物質等)を添加した系での増殖・分化制御が行われて いる。サイトカインは免疫系、造血系、内分泌系、神経系など生体の様々な高次機 能を維持するうえで非常に重要な生理活性物質である(28)

。

サイトカインによる細胞 内シグナル伝達には

JAK‑STAT

伝達系が知られている。まずサイトカインが細胞表 面のレセプターに結合し、レセプター近傍の

JAK

がリン酸化され活性化する

。 それ によりレセプターのチロシンリン酸化がヲ￨き起こされ、そこに STAT タンパクが会合す

る

。 STAT

が

JAK

によりリン酸化、活性化され二量体を形成し核内へ移行し、特定の 遺伝子の転写を誘導する(29)

。 その他にも、各成長因子に対応してそのシグナル伝

達経路は多種多様である(23)(30)

。

1 ‑ 3

・

2 . 上皮分化

肺や肝臓、腎臓などの組織は一度障害を受けると自己修復することが困難な組織 である。また、組織の機能が複雑であるため、人工臓器の開発が難しいとされてい る

。

そこで期待されているのが、細胞を用いた再生医療で、あるO 特に近年では、幹 細胞を腸管や角膜、腎臓などの上皮細胞へと分化させ治療に応用することに注目 が集まっている。また上皮細胞への分化も他の分化と同様に

3

つの因子による制御 が試みられている。

‑10‑

:最大学大学院 r.学研ヲ日

f ;

・

1

・

3

ふ1.物理的手法

気相‑液相界面を有した回転バイオリアクターによる培養を行い、

i P S

細胞を上皮 細胞に分化誘導する報告(31)がある。

1 ‑ 3 ‑ 2 ‑ 2 .

生物学的手法

c o l l a g e n

やフィブロネクチン、ラミニンといった

ECM

タンパクが、ヒト任性幹細胞由 来の網膜色素上皮細胞の構造と機能に影響を与えると報告されている(32)。また、

p o l y i m i d e  ( P I )

コーティングされた細胞足場が

hESCs

の網膜色素上皮分化を誘導 することも報告附されている。間葉系幹細胞に関しては、無細胞肺組織を足場とし た分化が報告附されている。

1

・

3 ‑ 2 ‑ 3 .

化学的手法

間葉系幹細胞の上皮細胞への分化誘導方法として化学的な手法もなされている。

その中には、レチノイン酸など化学物質を用いる方法(35)や、上皮に関連する成長 因子である

EGF

、

IGF

、

HGF

などを用いる方法(36)が挙げられる。また、

t r a n s w e l l

を 用 い た 上 皮 細 胞 と の 共 培 養(37)、 上 皮 細 胞 の 培 養 培 地 の 上 清

( C o n d i t i o n e d Medium)

を用し1る方法(38)も報告されてしも。

これらのように各視点からの分化誘導方法が報告されてはいるが、未だに上皮分 化を決定づけるシグナル解明には至っていなし10

四

1 1‑

2 . 目的

細胞足場の弾性が間葉系幹細胞の分化に影響を与えることがわかっている

(12)(13)。また、本研究室で行われた研究より足場の厚みが間葉系幹細胞に対して上 皮マーカーで、ある

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

の発現を誘導させることが判明した(40)。これらの 報告は足場の物性が間葉系幹細胞の分化において重要な役割を果たしていること を示している(41)。

本研究の最終目標は生体材料の物性による間葉系幹細胞の分化メカニズムの 解明およびその制御にある。間葉系幹細胞は生体内で様々な細胞外マトリックスや 組織に固まれており、その環境(幹細胞

n i c h e )

ごとに挙動が異なる。この幹細胞

n i c h e

を念頭に置いた様々な材料足場の物性によって間葉系幹細胞の分化制御が 可能となれば、広く再生医療への応用が期待される。

そこで、今回は足場材料の厚さ、また細胞結合様式の異なる

ECM

に注目し、前 研究成果を足掛かりとして足場材料の物性が間葉系幹細胞の分化、特に上皮分 化に与える影響、及びそのメカニズムの解明を行った^O

ー

1 2‑

藍大学大半

3 . 方法

(使用した薬品、器具の詳細は

9

章

Appendix

参照)

3 ‑ 1 . 間葉系幹細胞の性質について

本研究に使用した細胞は理化学研究所バイオリソースセンター細胞材料開発室 より購入した研究用ヒト間葉系幹細胞

( 3 9

歳/男性

/ p a s s a g enumber:2/HMS0049)

を用 いた。

間葉系幹細胞

( m e s e n c h y m a ls t e m  c e l l : M S C )

は、

5 0 0 0 c e l l s / c m

²で播種し、

DMEM

+  1  O%FBS  +  3 n g / m l  bFGF

の培地を用いて培養し、

10%T r y p s i

n/

PBS

を使用して継 代した。継代は

s u b ‑ c o n f l u e n t

にまで増殖した際に行い、初めに播種した代を

p a s s a g e  1  ( P = I )

として定義した。

P=2‑4

を実験に使用した。培養条件は

3

，7^O

C/5%C0

₂ で、インキュベート、

3

日に

l

回培地交換を行ったO 間葉系幹細胞の同定として購入 元である理化学研究所から提供していただいた情報、また本研究室において表面 抗原を

F l o v vc y t o m e t o r y  

にて解析を行った結果

(CD90(+)

、

CDI05(+)

、

CD73(+)

、

CD44(+)

、

CD29(+)

、

CD45(‑)

、

CD34(

‑))の細胞を使用した。尚、実験に使用した 試薬は特記するもの以外は

S i g m a ‑ A r d r i c hj a p a n

社製(日本)を使用した。

3

^・

2 .

ゲル上培養(ゲ、ル厚み)による分化制御

3 ‑ 2 ‑ 1

・1.コラーゲ、ンゲ、ル作製

本研究室で抽出した

t y p e1  c o l l a g e n

を濃度

0 . 5 m g / m l

となるように

pH3.0

の希塩酸 に溶解し、

0.22μm

のフィルターで、

j

慮過滅菌した^Oその後凍結乾燥により精製した滅 菌済み

t y p e1  c o l l a g e n

を最終濃度

3.0mg/ml

に希塩酸で調整した。また、購入した

c o l l a g e n  t y p e  1  p o r c i n e  t e n d o n ( p e p s i n  s o l u b i l i z e d  c o l l a g e n ) (  p s c

・

I

・

2 0 1

・

1 0 0 /

ニッピ)も 凍結乾燥し試験に用いた。本実験には厚さの異なる 6種類のゲ、ノレを用いた。以下 の方法で、作製したゲ、ルの厚さはそれぞれ約

1.9mm

、1.

5mm

、

1.0mm

、

600μm

、

300μm

、

100μm

である。

( a )

厚いゲル(厚さ:

1900μm

、表記:

t h i c k  g e l )  

24 v v e l l  p l a t e

に濃度

3mg/ml

に調製した

t y p e1  c o l l a g e n

中和溶液を

3 5 0 μ l

添加し、

37

⁰

C

インキュベータ内で

1

日間静置した。

PBS

溶液により洗浄したものを以下の実 験に使用した。

( b ) .

段階的ゲル(厚さ:

1 0 0 μ m ' " ' " '  1500μm

、(注

)100μm

に関しては表記

: t h i ng e l )  

滅菌したフ。レートとゲ、ルの鋳型、セルディスクを

F i g . 3

・

1

のように組み立てた。セル

ー

1 3‑

三重大学大学校

r

^学研究科

デ、イスク上に濃度

3mg/ml

に調製した

t y p e1  c o l l a g e n

中和溶液を約

1 5 0 μ l

滴下し、

37

⁰

C

インキュベータ内にて

1

日間静置した。その後

PBS

溶液により洗浄したものを 以下の実験に使用した。

よ

J

一 日

﹀戸

ク♂ 併は か 日ア 一

L州

︑セ

α

100~1500μ

210Jlm 

プレ}ト

F i g . 3

^・

1

各厚さの

g e l

作製の概略

3

・

2 ‑ 1 ‑ 2 .

エラスチンゲ、ル作製

本研究室で、抽出したエラスチンを濃度

1 . 0 m g / m l

となるように脱イオン水に溶解し、

0.22μm

のフィルターで、清過滅菌した^O その後凍結乾燥により精製した滅菌済みエ ラスチンを最終濃度

25%w/v

になるよう滅菌水に溶解した。

溶解したエラスチンに鴻過滅菌済みの架橋斉JI

Dode‑DSP(330.3mM)

を架橋倍率

0 . 5

倍になるよう添加し、均一の溶液を作製した。その後、促進剤

Na2C03

を全体量 に対して

40mM

となるよう添加しこれをエラスチンゲ、ノレ溶液としたO

調製したエラスチンゲ、ル溶液を

F i g . 3 ‑ 1

のように組み立てたゲ、ノレ鋳型に滴下し

37

⁰

C

インキュベータ内にて数時間静置した。作製したゲノレを

24

穴プレートに移し

1ml

の

DMEM

を添加し

37

⁰

C

インキュベータ内にて

1

日間静置しゲ、ノレを膨潤させたO

膨潤後のゲ、ルは各厚さに調整し試験に使用した。

3

・

2 ‑ 1

ふコーティングディスク作製

生体細胞は、接着するための足場を必要とする接着細胞と、接着なしに浮遊した まま培養可能な浮遊細胞に分類される。接着細胞は細胞外マトリックス

(ECM)

に接 着することではじめて接着・分化・増殖といった機能を果たすため、接着細胞の

ECM

上での詳しい解析を行う必要がある。そこで、細胞接着もタンパクの吸着もで、

きない浮遊細胞培養用のシャーレ表面をコロナ放電処理した後に、

ECM

をコーテ イングすることで

ECM

のみの表面を持つシャーレを作製したO

【コロナ放電処理の原理】

シリコン、ポリフ。ロヒ。レン、ポリエチレン等は、その表面層に極性基を持たない為に、

接着性、コーティング性、親水性が悪い等の問題があり、その表面を改質する必要 がある。コロナ放電表面処理装置は、高周波高電圧を利用し、大気中にコロナ放

‑ 1 4  ‑

三重大学大学院 仁学研究科

電を発生させ、それによって生成される官能基と共に、その電子を物質表面に照射 することにより物質の表面改質を行うもので¥高周波高電圧の気中で、電解内にて 起きる、原子、分子、電子、イオン間での衝突により、電子エネルギーの励起、光子 の放出が起こる。このコロナ放電のエネノレギーを物質の表面で、作用させたとき、そ の表面がエネノレギーを受け表面エネルギーが高くなり活性化された状態(ラジカ ノレ生成)になる。そこに空気中の酸素や水分などが反応し、極性をもったさまざまな 官能基が表面の濡れ性が向上する。

く浮遊培茶筒シャーレ >

〆 戸 ‑

. . . . ' ‑ ‑

̲.缶、 コロナ放 議 処 理

F i g . 3 ‑ 2  

コロナ放電処理前後のシャーレ表面の様子

( a )

コラーゲン

本研究室で抽出した

t y p e1  c o l l a g e n

を濃度

0.5mg/ml

となるように

pH3.0

の希塩酸 に溶解し、

0.22μm

のフィノレターで、櫨過滅菌した。その後凍結乾燥により精製した 滅菌済み

t y p e1  c o l l a g e n

を最終濃度

1.0mg/ml

に希塩酸で調整した。

( b )

エラスチン

本研究室で、抽出したエラスチンを濃度

1.0mg/ml

となるように脱イオン水に溶解し、

0.22μm

のフィルターで、清過滅菌した^O その後凍結乾燥により精製した滅菌済みエ ラスチンを最終濃度

1.0mg/ml

に滅菌水で調整した。

セノレディスク

(MS

・

92132/

住友ベークライト)にコロナ放電を用いて前処理を行った 後、

( a )

、

( b )

で調整した各タンパク溶液に浸し、

5

時間静置した。静置後

PBS

洗浄し、

試験に用いた。

3

ふ

2 .

細胞培養

2 4 w e l l  p l a t e (

底面積

1.8cm

²)に

3 ‑ 2 ‑ 1

で、作製したコラーゲ、ンゲ、ノレ、エラスチンゲ、ルを 移し、ゲル上に

MSC

を播種し基本培地

(DMEM+1  O%FBS)

にて培養を行った^O播 種密度は

zo

^・

1

染色用の場合

1 0

，

0 0 0 c e l l s / c m

²で行い、それ以外は

1

，

5 0 0 c e l l s / c m

² で

‑ 1 5  ‑

一重大学大学院

̲

[乍研究科

3・2ふ 分 化 評 価

ゲ、ル上で、の分化評価として、免疫蛍光染色法を行った^O コラーゲ、ンゲ、ル上にて

7

日間培養した

MSC

において、上皮マーカーである

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

、

ZO‑l

、

P

^圃

c a t e n i n

タンパク質発現の評価を行った。

固定には、パラホルムアルデ、ヒド

‑ t r i t o n ‑ X

溶 液 を 用 い 、 染 色 に は 一 次 抗 体

A n t i ‑ C y t o k e r a t i n ‑ 1 8  ( H ‑ 8 0 )  R a b b i t

、

Anti‑ZO

・

1

，

Human

，

( R a b b i t )

、を希釈率

1 : 2 0 0

、ま た

A n t i ‑ s ‑ c a t e n i n( R a b b i t )を 希 釈 率 1 : 2 5 0

、二次抗体にコラーゲ、ンゲ、ル上培養の場 合で、は

Goata n t i ‑ R a b b i t  IgG(H+L) FITC c o n j u g a t e

を、またエラスチンゲ、ル上培養の 場 合 で は

Goata n t i ‑ R a b b i t  IgG

，

(H+L) DyLightTM649 c o n j u g a t e

を希釈率

1 : 2 0 0

、核 染色として

P I

を希釈率

1 : 2 0 0

の条件のもと使用した。

尚、共焦点顕微鏡による撮影時には、

T a b l e . 3

・

1

~こ示す条件で、撮影を行ったO

蛍光フィルター

NIBA  WIG  WIG  p h a l l o i d i n   D y e l i s t   FITC  P I  

Rhodamin 

検出器の感度調節

(HV) 600

，

650

，

700  600  600

ラ

650

，

560

G a i n   l x   1 x   1 x  

O f f s e t   0%  0%  0% 

レーザー出力の調整

20%  20%  20% 

( L a s e r )  

コンブオーカルアパチャー

80um  80um  80um 

( C . A )  

ハロゲ、ンランプρ調光

2.9V  2.9V  2.9V 

(Lamp) 

F i

1t

e r  Mode  Kalman L i n e 2   Kalman 

Li

ne2  Kalman L i n e 2  

スキャン速度

2 . 0  u s / P i x e l   2 . 0  u s / P i x e l   2 . 0  u s / P i x e l  

画像サイズ

( s i z e ) 1:1512by  1:1512by  1 : 1   512by 

対物レンズ

x10

、

x20

、

x40 x10

、

x20

、

x40 x10

、

x20

、

x40 zoom  x 1

，

x2  x 1

，

x2  x l

，

x2  Table.0

・1芙 焦 凪 レ ‑ ザ

t

只放 鏡 に よ

φ

亘主党観祭の設疋:

1 l

旦

ー

1 6‑

r"j三日i ヲ，!t~ 科

3 ‑ 2 ‑ 4 .

ゲノレの弾性率測定

弾性率測定は試料の物性を知るために広く用いられている測定方法である。本試 験で、はサンフ。ノレの圧縮弾性率を測定したO 圧縮弾性率は、サンフ。ルが受ける荷重 を、その荷重が作用する面積で、害jrった値(応力)、またサンフ。ノレの単位長さあたりの 変形量(ひずみ)、これらの関係から得られる応力一ひずみ線図における弾性域(の 線形部)の傾きとして定義される。

上記のように

c o l l a g e n

ゲ、ル、

e l a s t i nゲ、ルのサンフ。ルを作成し、各々の自然長を測

定した。その後、弾性率測定装置を用いサンフ。ノレをリニアアクチュエーターによっ て圧縮させ、動歪み計測器に表示される圧縮力をアナログ計測計算機によって読 み取った^O 弾性率を応力一歪曲線より算出した。

F[N] /  A  [m

2] 

企L[

m ]  / 

L 

[ m ]  

3

^・

2 ‑ 5 .

ゲノレ上における細胞骨格

=弾性率

E[ P a ]  

T h i n

、

t h i c k

ゲルの上における

MSC

の形態の違いを調べるために、各ゲ、ル上で、間 葉系幹細胞を

7日間培養した後、 p h a l l o i d i n

により

F

皿

a c t i n

の染色を行ったO

染色には固定後、Rh

odaminp h a l l o i d i n ( P H D R 1 / c y t o s k e l e t o n )

を濃度

100nM(500μl

のPBSに対して

14μM

の

P h a l l o i d i n ‑

Rh

odamin3 . 5 μ l

添加)の条件下において

90min

室温で静置した後に共焦点顕微鏡にて観察した。

3

・

2 ‑ 6 .

アクチン重合阻害

細胞骨格の形成を阻害した際の

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

の発現への影響を検証するため に、試験培地にアクチン重合の阻害剤である

c y t o c h a l a s i nDを 0

.1

μM

になるよう添 加し培養を行ったo

t h i n

ゲル上で

7

日間添加培地にて培養を行い、免疫蛍光染色

により

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

の発現を観察した。

3

ふ

7 .

上皮分化誘導因子の添加

生物学的因子や物理的因子に加えて化学的因子による影響を検証するために、

試験培地に上皮分化を誘導する化合物であるレチノイン酸を

10μMとなるように添

加 し 培 養 を 行 っ た 。 ま た そ の 他 に 中 皮 様 形 態 形 成 促 進 が 報 告 さ れ て い る

L ‑ C y s t e i n e

、メルカプトエタノールを

0.25mM

となるように添加し培養を行ったO

ゲ、ル上で、

7

日間の培養を行った後、免疫蛍光染色により

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

、

ZO‑l

、

s ‑ c a t e n i n

の発現を確認した。

‑1 7

^国

3 ‑ 2

・

8 .

ゲ、ノレ上で、の細胞動画撮影

ゲ、ル上における細胞の挙動が

d i s h

上における場合とどのように異なっているのか を調べるため、上記

( 3 ‑ 2 ‑ 1 ‑ 1 )

の方法により作製した

1900μm

の

c o l l a g e n

ゲ、ル上に

MSC

を播種し、数日間その様子を動画撮影によって観察した^O

3 ‑ 3 . 統計処理法

統計ソフトウェアは

S t a t V i e w @ ‑ J 5 . 0 ( S A S

社)を使用した。解析には

p a r e dT  t e s t

を用 いた。データは平均値土標準偏差として表記した。

Pv a l u e s

く

0 . 0 5

のとき有意差があ ると判断した。

‑1 8  ‑

1ブ手研究科

4 . 結果 4 ‑ 1 . c o l l a g e n  g e l 上における分化評価

4 ・ 1 ・ l . c y t o k e r a t i n ‑ 1 8 発 現

は じ め に 、 厚 さ が

1 0 0 μ m ( t h i n )

、

300μm

、

600μm

、

1000μm

、

1500μm

、

1 9 0 0 μ m ( t h i c k )

の

c o l l a g e ng e l

を作成し、その上で、の培養によって問葉系幹細胞の 分化に与える影響を調査した。

まず、免疫蛍光染色により上皮分化マーカーで

、ある

c y t o k e r a t i n

・

1 8

の発現を観察した

( F i g . 4 ‑ 1 ) 0 c o l l a g e n  

_{coat 及び厚さが} 100μm~600μm の薄いゲル上では

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

を発現しなかったが、厚さが

1000μm

を越えると の

t o k e r a t i n ‑ 1 8

の 発 現 が 確 認 さ れ た。

作成したゲ

、ル の 厚 み が 増 加 す る に つ れ

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8 の発現が上昇する傾向が観察された。 また、培養期間を 1 4 日間に 延長しても同様の発現傾向が認められた。

F i g . 4

・

1c o l l a g e n  g e l

上での

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現

A : 免疫蛍光染色結果。 ( a )100μmgel 上

。

( b )300μmgel 上

。

( c )600μm g e l 上 。 ( d )1000μm  g e l 上 。 ( e )1500μm g e l 上。( D 1900 μm  g e l 上 。 ( g )c o a t 上 。 n=3

o

‑ 1 9

ー

ス重大学大学院

I 二午:研究科

4 ‑ 2 . c o l l a g e n  g e l 上における上皮分化メカニズム

4 ・ 2 ・1.異なる細胞外マトリックスによる影響

c o l l a g e n  g e l上における間葉系幹細胞の分化のメカニズムを調べるために、まず c o l l a g e nとは細胞との結合様式が異なる細胞外マトリックスとして e l a s t i nを用いた。

c o l l a g e n と同様に段階的に変えた g e l を作成し、その上で、の培養によって間葉系幹 細胞の分化に与える影響を調査した。 免疫蛍光染色により上皮分化マーカーで、あ る c y t o k e r a t i n ‑ 1 8 の発現を観察した( F i g . 4 ・ 2 ) 0 c o l l a g e n

の場合とは傾向が異なり

g e l

の厚さに関わらず

c y t o k e

削

i n ‑ 1 8

発現が確認で

、

きなかった(

F i g

.4

‑ 3 ) 。

このことから、 c y t o k e r a t i n ‑ 1 8 発現には g e l の厚み依存的なものと、特定の細胞外

マトリックスを必要とする二つの因子が働いていることが示唆された。

F i g . 4 ‑ 2  e l a s t i n  g e l 上での c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現

A : 免疫蛍光染色結果。 ( a )100μmgel 上 。 ( b )300μm g e l 上 。 ( c )600μm g e l 上 。 ( d )1000μm  g e l 上 。( e )1500μm g e l 上 。( f )1900μm g e l 上 。n=3

o

‑

20 ‑

̲

.重大学大学院

r

中研究科

1 2 0  

5

^OB 

)   ¹

^錨

明・・場

i  ⁶⁰ 

制唱F

40 

本τ}rPEJ

1  Go

蕗

a g e n7

d:a

ys 

⁰ 

1

4th戸

市

Type1  Go

出壁寝11.

4 d a y s

寸 岨 骨 吋 伊1

co

l1

a g e n ( 7 d a y )  

;ゲ".明石fNcoHa.さ色町猛毒主両日一…一一小平

;…刊一会

‑ e l

平山ド号制

，日開

e l a s i i n(  1 4  d a y )  

1

岱

00

F i g . 4

^・

3g e l

上での

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発 現

[同}

1900μm:n=6

o 

100μm:n=6

o 

300μm"'1500μm:n=3

o 

Pared T ‑ t e s t

大:

P<0.05

。

‑2 1

^圃

[ . 中 科

4

ふ

2 .圧縮弾性率測定

ゲ、ル自体の物性(弾性)が与える細胞の分化への影響を調べるために作成した

g e l

の圧縮弾性率測定を行ったO測定より得られた弾性率を

F i g

.4

‑ 4

に示す。

c o l l a g e n g e l

は濃度依存的に弾性率の増加がみられた。また、

1 %collagen g e l

の弾性率と

2 5 % e l a s t i n  g e l

の弾性率が約

4.5kPa

でほぼ同等なものであるとしづ結果を得た。そ こで濃度別の

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現結果

( F i g

.4・

5 )

を対比させたところ弾性率のみで は

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現を誘導することはできないことが示唆された。

5 

A

守

﹃

﹃ 岬 町

4雪崩事佐官酒闘運 r・24

OJ'~l~ O    . .

6~o

1 %

iD 

 

ユ5~，'る

F i g . 4

・

4

圧縮弾性率測定

O . 3 % c o l l a g e n   g e l : n = 2 o   O . 6 % c o l l a g e n   g e l : n = 3o 1  % c o l l a g e n   g e l : n = 3o 25%elastin  g e l : n = 2 o  

1 1 1 )  

詰

1部

善 郎

i

^部

“自….，._~-*叫ん一戸

3

^判

官

; 3 8  

R 3 4 5 b  

_位6~~

i g / _{l   D   33%} 

F i g . 4

^・

5

濃度別

c y t o k e r a t i n‑ 1 8

発 現

O . 3 % c o l l a g e n   g e l : n = 6o O.6%collagen  gel:n=3o 1  % c o l l a g e n   g e l : n = 3o 25%elastin  g e l : n = 6o 

‑22‑

三選大学大学院

4

・

2 ‑ 3 .

厚さの異なるゲノレ上における細胞骨格

ゲ、ノレの厚さを変えることで、細胞にどのような影響があたえられるのであろうか。

前研究者による

AFM

の結果によってゲ、ルの厚みの違いによってゲ、ルの歪が異なる ことが示唆された。こ の 歪 の 違 い が 細 胞 形 態に影響を与え、その結果として

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現に違いが生じたものと考えられる。そこで、、各ゲ、ノレ上で、培養した

間葉系幹細胞の

F ‑ a c t i n

を免疫蛍光染色により観察した

( F i g . 4 ‑ 6 ) 。

c o l l a g e n

では

d i s h

、

100μmg e l

上では

F ‑ a c t i n

が形成されていることが確認された。

また、

1900μmg e l

上では

d i s h や 100μmg e l

と比較して細胞の面積が小さく

F ‑ a c t i n

の繊維構造が確認されなかったことから、

F ‑ a c t i nの形成が抑制されていると

し、える。

また、

e l a s t i n

の場合で、はゲ、ルの厚さによらず

F ‑ a c t i n

が形成されていることが確認さ れた(

F i g . 4 ・ 6 ) 。

F i g . 4

・

6g e l

上での細胞骨格

( a )  c o l l a g e n  c o a t

_o 

( b )  c o l l a g e n  g e l

厚さ

100pm( t h i n  g e

l)

。 ( c )  c o l l a g e n  g e l

厚さ

1900pm( t h i c k  g e

l)

。

( d )   e l a s t i n  c o a t

o 

( e )  e l a s t i n  g e l

厚さ

100pm( t h i n  g e l )

。 (D e

l a s t i n  g e l

厚さ

1900pm( t h i c k  g e

l)

。

( a ) ，  ( b ) ，  ( c ) ，  ( d ) ，  ( e ) ，  ( f ) ; n = l 。

‑23

^回

三重大学大学院 仁学研究科

4

・

2 ‑ 4 . a c t i n

重合阻害試験

F ‑ a c t i n

の形成阻害、即ち

a c t i n

の脱重合が

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

の発現を誘導するとし、

う仮説を立て、

a c t i n

の重合阻害剤である

c y t o c h a l a s i nD

を

0.1μM

添加し、

100μm g e l

上で、の培養を行った^O 免疫蛍光染色による

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現の結果を

F i g

.4・

7

、

F i g

.4・

8

に示す。

100μm g e l

上 培 養 で は

c o l l a g e n

、

e l a s t i n

どちらの条件でも間葉系幹細胞は

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

を発現しないが、

c y t o c h a l a s i nD

を添加することで

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

を発 現することがわかったO これは

a c t i n

の脱重合が

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8

発現を誘導すること を示している。

A 

B 

^:s. 

100 

Cad

・

sh 

90 

~ 80 

長品主L0己ω q司. b 

L  70  60  50 

Ph

。 40 

+一一一一目

; 30 

510 1 h  

出

i ng e l  " r i t h o u t   t h l D  g e l  ¥ v i t h   c y t o c h

aJ邸

inD . c v t o c h a l a s i n   D 

F i g . 4

・

7 c o l l a g e n  g e l

上での

a c t i n

重合阻害

A : 免疫蛍光染色結果。 ( a )lOOpm  g e l  ( t h i n  g e l )   w i t h o u t   c y t o c h a l a s i n   D 。

( b )   lOOpm g e l   ( t h i n   g e l )   w i t h o u t  c y t o c h a l a s i n   D o  ( c )   lOOpm g e l   ( t h i n   g e l )   w i t h   c y t o c h a l a s i n  D 。

‑24‑

‑重大学大学院工学研究科

A 

B 

ハ リ ハ リ ハ V A U

ハU

A V

ハ リ ハ リ ハ V A V A V

0 9 8 7 6 5 4 3 2 1  

(ヌ)∞回目冨何百﹄

2 3 h u M o g ‑ a g

骨 ω D  n 

^{. ︐} EA

 

Qd 

a 

'E

EA

 

l a  

e h  

obc  n

u  

‑‑EAjuv' 出

c .

h D  

‑ u n  

w .

剖

咽E E

‑

‑ E l

e 4 a  

o b L u  

nm

ル

・ 噌E A r

︑

IゐEL‑

︑

d v d  

C 

F i g . 4

^・

8e l a s t i n  g e l 上での a c t i n 重合阻害

A :

免疫蛍光染色結果。

( a )100pm g e l  ( t h i n  g e

l) 

without c y t o c h a l a s i n  D 。

( b )   100pm g e l   ( t h i n   g e

l) 

without c y t o c h a l a s i n   D o  ( c )   100pm g e l   ( t h i n   g e

l) 

with  c y t o c h a l a s i n  D 。

‑2 5

^ー

で

i

立大学大学院

r . .

学イ

i J f

究科

4

ふ

5 .

上皮分化誘導因子の添加試験

幹細胞の分化制御方法には物理的手法、生物学的手法、化学的手法が挙げら れる。これまでの実験系では物理的、生物学的手法の組み合わせで、あったが、ここ でさらに化学的手法も組み合わせることで分化へどのような影響がでるのかを調べ た。添加する試薬としては、上皮分化を誘導するとし、われている

a l l ‑ t r a n sr e t i n o i c   a c i d  (ATRA)

、中皮細胞の玉石形態を促進すると報告されている

L ‑ c y s t e i n e

、メルカ プトエタノール(s‑ME)を用い、それぞ、れの試薬を培地に添加しゲ、ル上で、

7日間培

養を行ったO分化評価には免疫蛍光染色により上皮分化マーカーである

c y t o k e r a t i n ‑ 1 8 ( F i g

.4

‑ 8 )

、上皮細胞の

t i g h tj u n c t i o n

タンパクで、ある

z o n u l ao c c l u d e n s   (ZO

・

l ) ( F i g

.4・9

)

、

s ‑ c a t e n i n ( F i g

.4

‑ 1 0 )

の発現を観察した^O

NIE 

t r o l  ATR

司A.

i 本 宇

+一一一一一一

1 2 0  

ハ リ ハ

υ n V

0 6 2  

4 ga ‑

A 4

_・t

)虫

企苦 言

M

向 ︒

弘 よ

eg c三 宮島

MG

80 

40 

。

F i g

.4

‑ 9

誘導因子添加による

c y t o k e r a t i n  ‑ 1 8

発現

左から

d : d i s h

、

c : c o l l a g e n  c o a  t i n g

、

t n : l 0 0 p . mg e l  ( t h i n  g e

、l)

t k : 1 9 0 0 p . m g e l  ( t h i c k  g e

l) 

n=3

_o 

Pared T ‑ t e s t ;

六:

P < O . 0 5

_o 

‑26‑

三 重 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科

。ロr..:(ol ATI常一兆 L‑Cy =. スE

120  100 

ミ~

80 

S

^，・瞳4

⁶⁰ 

弘同c 

.

ロ::: 

40 

事畦

毎 20

。

d c tn  tk  d c 

Fig . 4 ‑ 1 0 誘導因子添加

によ

る z o

^・

1 発現

左

か

ら

d : d i s h 、 c : c o l l a g e nc o a t i n g 、 t n : 1 0 0 1 1 f f ig e l  ( t h i n  g e l ) 、 t k :19001 1 f f i g e l  ( t h i c k  g e l )   n

二

3

0

Pared T ‑ t e s t ;  * :  P<O.05 

‑27 ‑

.

.

'

t，立大学大学院

r

乍fiJF究科

F i g . 4

^・

1 1

誘導因子添加による

s ‑ c a t e n i n

発 現

( a )

排 液 由 来 ヒ ト 腹 膜 中 皮 細 胞。

s ‑ c a t e n i n ; 緑)

( b )  ( c )  c o n t r o l  medium  I g e l

厚さ

100pm( t h i n   ge

l)

1

厚さ

1900pm( t h i c k  g e

l)

。 ( d )  ( e )  ATRA  I g e l

厚さ

100pm( t h i n   ge

l)

1

厚さ

1900pm ( t h i c k  g e

l)

。

( D   ( g )   L‑Cys  I g e l

厚さ

100pm( t h i n   ge

l)

1

厚さ

1900pm ( t h i c k  g e

l)

。

‑28 ‑

三重大学大学院 仁学研究科

(核;赤

T a b l e

.4・

1

誘導因子添加による

8

^胃

c a t e n i n

発現

e x p r e S S l o n   l o c a r i z a t i o n   c o n

甘01 ^{白血 +/一 +/ー}

t h i c k   +  + 

ATRA  t h i n  

+/ー

+ 

出

i c k + 

^+/一

L ‑ C y s   t h i n   + 

^+/一

出

i c k

一 一

ME  t h i n   + 

^+/ー

出

i c k +  + 

c y t o k e r a t i n

^田

1 8

また

z o

^・

¹

の発現に関しては、誘導因子を添加した条件下において もゲ、ノレの厚みが大きく関わっていることが示唆された。また、一部例外はあるが

戸

田

c a t e n i n

の発現に関してもゲ、ノレ厚みに依存していることが示唆された。

これら上皮分化マーカーの発現傾向から、細胞足場の厚みとし1うファクターが分 化制御に大きな影響を及ぼしていることが示された。

4 ‑ 2 ‑ 6 .

細胞動画

厚いゲノレ(

t h i c kg e l )

上において細胞の活発な増殖・遊走が観察された。また、

d i s h

上で培養した場合と大きな違いは見受けられなかったO しかしながら、細胞形態に 関しては少し違いがあることが示唆された。

圃

29‑