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Fig.5‑7 thickゲ、ル上で、の上皮分化メカニズム
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thick collagenゲル上では、 F‑actin形成阻害が生じ、YAP/TAZのリ ン酸化、 B‑catenin との相互作用、それによる Wntシグ、ナルの阻 害が起こり cytokeratin‑18が発現する。 一方、 elastinゲ、ル上で、は、 F‑actin形成が生じ、 ERK経路活性もしくは、 Hippo 経路の阻害から誘起される YAP庁'AZの核内移行による増殖遺伝子の転写が起きる。
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ペ重 大 学 大 学 院 ょ や 研 究 科
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・2 .
ゲ、ル上培養による多様な分化への応用本研究では、厚さの異なるcollagenゲ、ル、elastinゲ、ル上にて培養した問葉系幹細 胞の分化評価を行ったO それにより厚し'1collagenゲル上で、培養することで、のみ間葉 系幹細胞がcytokeratin ‑18を発現することが明らかとなりECMの重要性が示された。
さらに、ゲ、ルの弾性率のみで、の分化制御は不可能で、あり、誘導因子のみでの分化 制御も難しいことが明らかとなったO ゲ、ルの厚みが細胞骨格形成に影響を与えたこ とが分化のトリガーとなっていることも示唆された。
本研究の目的は細胞足場の厚みが分化制御因子としてし、かなる影響を及ぼして いるのか。そのメカニズムはどのようなものなのかを解明することにあったO 現象とし て細胞足場の厚みが細胞骨格形成に大きく関わっていることがわかったが、その詳 細なメカニズムの解明には至らなかったO 今後の展開としてマイクロアレイや二次元 電気泳動等を用いた細胞骨格に関連する全遺伝子/タンパクの発現についての詳 細な検証が必要である。また、col1agenや elastin以外の ECM、液性因子による刺 激による制御なども詳細なメカニズム解明には必要になるだろう。
メカニズム解明は上皮分化に限らず、他細胞への分化に応用ができる。現象から 導き出されるより詳細な生体内微小環境(niche)の模倣、それにより幹細胞の制御 が安全かっ容易になれば、さらなる再生医療の発展へ繋げることができる。
生体内 niche環境模倣に基づいた弾性をはじめとする物理学的因子、 ECMなど の生物学的因子、サイトカイン等の化学的因子の組み合わせにより invitroでの幹 細胞制御を目指す。
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三重大学大学院
6 . 結論
本研究における結論を以下に示す。
① collagen gelの厚さを変えることで、間葉系幹細胞の上皮分化に違いがあること を示した。
② ECMの違いによって分化に違いが生じることが示された。
③弾性のみでの分化制御は不適であり、 ECMとの組み合わせ、足場の厚みの重 要性が示された。
④上皮分化誘導因子の影響より足場の厚みによる影響の方が優位に分化誘導で きることが示された。
⑤上皮分化メカニズムにおいてはF‑actin形成阻害が重要な働きをすることが示 唆された。
以上より、足場の厚さが間葉系幹細胞の運命決定において重要な役割を果たし ていることが示され、 F‑actinの形成が間葉系幹細胞の分化を制御していることが明 らかになった。
‑42‑
七重大学大学院 r‑.ゃ?iJF究科
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:露大学大学院 究科
8 . 謝辞
本修士論文を執筆するにあたり、厳しくも親身になり、適切な助言や懇切丁寧な ご指導を賜りました三重大学工学部堀内孝教授、宮本啓一准教授に深く 感謝申し上げます。
また、研究を進めるにあたり、原子間力顕微鏡を譲渡していただきました北川敏 一教授、)11口正美教授に深く感謝申し上げます。
さらに、遠路にも関わらず足を運んで、いただき、足場の物理的特性としち点につ いての異なる視点から数多くの助言を頂きましたお茶の水女子大学生活科学部 太田裕治教授、また有限要素法によりゲ、ルの歪を解析し本研究をサポートして いただいたお茶の水女子大学生活科学部庄司正子さんにも深く感謝申し上げ ます。
また、本研究に使用したヒト間葉系幹細胞を提供していただきました広島大学加 藤 幸 夫 先 生 、 bFGFを提供していただきました科研製薬株式会社、事務員として 研究室を支えていただきました村上節子様に深く感謝申し上げます。
堀内孝教授には最後まで頼りなく、何事に対しても到らなかった不出来な私を 最後までご指導頂きまして感謝が尽きません。研究のみならず、今後の社会人とし ての在り方についてまで様々な助言を頂きました。この先教授より頂きました助言を 糧とし、今後の成長に生かしていきたいと思っておりますO
宮本啓一准教授には研究に使用したエラスチンの提供またその使用に関する 知識や方法など数多くの助言を頂き深く感謝申し上げます。
日々の研究室生活の過ごし方や意識の持ち方、実験の進め方、後輩指導など時 に厳しく指導していただき、また多くの助言も頂きました水谷直紀先輩、略日々の研 究室生活の中で、実験に関することから日々の他愛のないことまで明るく楽しい時 間を頂きました皆々様に深く感謝申し上げます。
また、自身の実験があるにもかかわらず、快くコラーゲ、ンの抽出を手伝ってくれた 神谷歩先輩、長谷川まりなさん、傍島達也君に心より感謝し、たします。また研 究を進めるにあたって大量のエラスチンを抽出、提供してくださいましたエラスチン グ、ノレーフOの皆様には、深く感謝し、たします。またエラスチンゲ、ルの作製にあたってそ の方法やコツなど様々な助言を頂きました佐々木剛先輩に感謝申し上げます。
そして、不出来な私のせいで大変ご迷惑をお掛けしました堀井貴司先輩、いつ も笑顔で丁寧な指導をしていただきました大友佳子先輩、正確な実験手技の指 導から日々の他愛のない話まで何かとお世話になりました田野裕美先輩、いつも 笑顔で明るい雰囲気を作ってくれた北村早希さん、なんでも頼りになり色々とご不 欄をおかけしました水田裕磨君、頼りない私に変わって積極的に真撃に実a験lこ
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三重大学大学院
取り組み、グループOを支えてくれた萩原慎之君、 4年生ながら非常に操作の難し い原子間力顕微鏡に懸命に取り組んでいただいた杉田夏美さんに深く感謝する とともに、皆々様のこの先の将来とグループOのますますの発展を心より願っておりま す。
最後になりましたが、この 3年間を共に過ごした伊藤直人君、影山聡君、小山 直紀君、叢シュウナさん、長谷川まりなさんに心より感謝するとともに、これからの 社会でのご活躍を心より願っておりますO
‑48 ‑
三盛大学大学院
平成26年 2月 中 町 信 敏
9 . A p p e n d i x
9 ‑ 1 . 各種溶液の調整
<使用機器・器具>
.pH/ION METER(D・53/HORIBA) .吸引ポンプ(BR‑21B/日機装)
.10 m1シリンジ(SS‑10SZ/TERUMO⑧) .注射針
σ
州 ‑2432R/TERUMO⑧).MILLEX⑧GP(SLGP033RS/MILLIPORE)
• STERICUpTM(SCGVU05RE/MILLIPORE) .ウォーターバス(BT‑15/Yamato)
.0.5m1アシストチューブ(A.050W/アシスト) .5m1アシストチューブ(60.9921.523S/アシスト) .15m1遠沈管(725172圃117/VIOLAMO) .50m1遠沈管(725172‑217/VIOLAMO) .ILメスフラスコ
<使用試薬>
・DMEM[Du1becco'sModified Eag1e's Medium](D6046/SIGMA、500ml)
• FBS[Feta1 Bovine Serum](500 m1)
• PBS[Phosphate Buffered Sa1ine](D8537/SIG孔1A、500m1) リン酸二水素カリウム[169‑04245/Wako]
塩化カリウム[163・03545/Wako]
リン酸水素二ナトリウム 12水和物[196・02835/Wako]
塩化ナトリウム[198・01675/Wako]
.TRYPSIN・EDTASOLUTION (10x)(T4174/SIGMA、100ml)
.bFGF[FGF basic](科研製薬、 500μg)※科研製薬より提供していただいた
・DTT[Dithiohtreito1](1261627 /Invitrogen、500μ1)
• PS[Penicillin Streptomycin ](P0781/SIGMA)
• LG[L‑G1utamine ](G7513/SIGMA)
.2mol/L NaOH aq(196‑05635/WAKO、500m1)
・5mol/LHC1 aq(081‑05435/WAKO、500m1)
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研究科
1.培地の調整
くDMEMの調製〉
①PS、LGそれぞれ5mlを培地に加えた。
※実験で使用したDMEMはすべてこれを使用した。
くpHの調整〉
培地のpHが正常値(pH7.35 '"'"'pH7 .40)で、ない場合、pHの調整を行ったO
①酸性側の場合はNaOHaq(1N)を、塩基性側の場合はHClaq(1N)を添加し た。
②添加後、培地全体を0.22μlフィルターにかけた。
くFBSの不活化・分注・保存〉
① ‑200
C
にて凍結保存されているFBSを370C
のウォーターバスに浸し、振り 混ぜながら解凍した。②完全に解凍し終えたら、数回振り混ぜた。
③ 55 '"'"' 5 60Cのウォーターパスで 30分間加熱した。(非働化)
④ STERICUpTM~こてフィルター滅菌し、 50ml チューブ、に 40ml ずつ分注したO 作業はクリーンベンチ内、滅菌操作で、行ったO
⑤・200Cの冷凍庫にて保存した。
※血清の非働化について
血清は血液を凝固させてその上澄みをとったもので、様々な細胞増殖促 進物質、細胞障害保護因子、栄養因子などがふくまれる。血清に含まれる 補体成分が活性化されると、細胞に障害を与える場合があるため、血清を 560Cで30分間加熱して補体成分を不活性化させる。
く各 suprementの保存〉
• PS [Penicillin Streptomycin]
5mlずつ分注し、 ‑200Cで保存した0
• LG[L‑Glutamine]
5mlずつ分注し、・40Cで保存した0
・bFGF[FGFbasic]
① 500μgの粉末状の bFGFに5mlの滅菌水を加え、 100μg/mlのbFGF 溶液を調製し、voltex、遠心を行ったO
② 1mlずつ 1.5mlアシストチューブに分注し、・800Cで保存した。
③使用する際はさらに0.5mlアシストチューブに5μlずつ分注し、滅菌水に て10倍希釈した後に使用した。
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三準大学大学院