ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物 細胞株の育種

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物 細胞株の育種

照屋, 輝一郎

九州大学農学研究科遺伝子資源工学専攻

https://doi.org/10.11501/3099889

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（農学）, 課程博士 バージョン：

ガン遺伝子導入による組換えタンパク質 高発現動物細胞株の育種

照屋 輝一郎

1995

日 次

第1苧: 序論

第2t�1: フラスミドの構築 第l節 緒三

第2節 実験材料および方法

第l項 使用した遺伝子、 ベクターおよびフロモーター 第2項 遺伝子組換え

第3節 結果

7 7 9 9 6

8 -EEa'E-A

第1項 発現ベクターの構築 18

第2項 組換えタンパク質発現フラスミド(レホーターフラスミド)の構築18 第3項 ガン遺伝子発現フラスミド(エフェクターフラスミド)の構築 26

第4項 pMBS-SRα-IL-6の構築 26

第4節 考察 26

第5節 小括 31

第3章 一過性発現実験における各種プロモーター制御下でのhIL-6発現レベ

ルとガン遺伝子導入による各種プロモーターの活性化 32

第l節 緒言 32

第2節 実験材料および方法 32

第l項 細胞培養 32

第2項 遺伝子導入法 33

第3項 ヒト ・ インターロイキンー6の定量 34

第3節 結果 38

第l項 各種細胞における各種フロモーター制御下でのhIL-6発現レベル 38 第2項 COS-1細胞およびÌ3HK-21細胞における各穐フロモーターのガン

遺伝f導入による活性化 38

第3項 Myb結合部位を導入したレポーターフラスミドpMBS-SRα-IL-6の

BHK-21細胞における効果 38

第4節 考察 41

第5節 小括 42

第4章 SRαプロモーター制御下でhlL-6を生産する各穐組換え細胞のhIL-6'È産

性の増強 ₄₃

第^l節 緒言 ⁴³

第2節 完験材料および方法 ₄₄

第l項 細胞培養および遺伝子導入 ₄₄

第2項 hIL-6の定量および澗胞数の測定 ₄₅

第3項 細胞からのmRNA調製 ₄₅

第 4 項 ガン遺伝チmRNAのノーザンプロッテイング ₄₇

第5項 32p標識DNAプロープを用いたハイブリダイゼーション ₄₈

第3節 結果 48

第l項 BHK細胞におけるガン遺伝子導入によるhIL-6生産性の増強 ₄₈ 第2項 SFME細胞におけるガン遺伝子導入によるhIL-6生産性活性化 ₄₉ 第3項 組換え細胞におけるガン遺伝子のmRNAのノーザンブロッテイ

ング ・ ハイブリダイゼーション ₅₃

第4節 考察 ⁵³

第5節 小括 ⁵⁵

第5章 ガン遺伝子導入BHK6-1細胞のフロ)サイトメトリー分析と蛍光活性 化細胞選択装置による高生産細胞の分離の試み 56

第1節 緒言 56

第 2節 実験材料および方法 ₅₇

第1項 細胞培養および使用した試薬 ₅₇

第2項 hIL-6分泌細胞の蛍光標識 57

第3項 FCM分析と細胞分取 57

第3節 結果 ₅₉

第1項 ガン遺伝子導入BHK6-1細胞のFCM分析 ₅₉

第4節 考察 ⁵⁹

第5節 小括 ⁶¹

第6章 高生産性各種ガン遺伝子導入組換えBHK細胞の限界希釈法による樹\[ ⁶²

第l節 緒言 62

第2節 実験材料および方法 62

第l項 細胞培養および遺伝子導入

第2項 限界希釈法によるスクリーニング 第3節 結果

第l項 myb発現フラスミドの導入が組換えBHK細胞のhIL-6生産性に及

62 63 63

ぼす影響 ⁶³

第2項 cjos、 c-mycおよびc-Ha-nω発現フラスミドの導入による組換え

BHK細胞のhIL-6生産性の変化 63

第4節 考察 ⁶⁶

第5節 小括 ⁶⁶

第7章 Secretory Cel1 Immunoscreening Assay (SCISA)法の開発 68

第1節 緒言 ⁶⁸

第2節 実験材料および方法 69

第1項 細胞培養および遺伝子導入 ⁶⁹

第2項 標準hIL-6のブロッテイング 69

第3項 組換えBHK細胞の生産するhIL-6の検出 69

第4項 hIL-6生産性の測定 71

第3節 結果 71

第1項 ニトロセルロース膜kにプロットしたhIL-6の検出 71 第2項 組換え細胞から分泌されたhIL-6の検出 73

第3項 高生産性細胞のスクリーニング 73

第4節 考察 ⁷⁸

第5節 小括 ⁸⁰

第8章 M町に替わる新規細胞数測定用化合物の検討 81

第l節 緒言 81

第2節 実験材料および方法 ₈₃

第l項 各化合物の吸光スヘクトル分析 83

III

第2項 細胞培養および細胞試験 ⁸³

第3節 結果 ⁸³

第l項 各化合物の吸光スヘクトjレ ⁸³

第2項 細胞数測定試験の結 果 87

第4節 考察 87

第5節 小括 ₈₇

第9章 ガン遺伝子の遺伝子増幅による動物細胞のhIL-6生産性の増強 90

第l節 緒言 90

第2節 実験材料および方法 ⁹⁰

第l項 細胞培養および遺伝子導入 90

第2項 SCISA法によるhIL-6高生産性細胞の検出 ⁹¹ 第3項 形質転換細胞のhIL-6生産性の測定 91

第3節 結果 ⁹¹

第l項 αwフロモーター制御下でhIL-6を生産する組換えBHK細胞

(BCI-8細胞)の生産性の増強 ⁹¹

第2項 hIL-6高生産性細胞作製のための至適遺伝子導入条件の設定 ^的

第4節 考察 ⁹⁴

第5節 小括 ⁹⁵

第10章 rωを導入し増幅した細胞によるhIL-6高生産性細胞の作製 96

第l節 緒言 96

第2節 実験材料および方法 ⁹⁶

第1 :項 発現フラスミドの構築 ⁹⁶

第2項 細胞培養および遺伝子導入 ⁹⁶

第3項 SCISA法によるhIL-6高性産性細胞の検出 ⁹⁷

第4項 形質転換細胞のhIL-6生産性の測定 ⁹⁷

第3節 結果 97

第1項 TBR細胞の作製 ⁹⁷

第2項 TBR細胞の生産性増強効果 97

第4項 恒久発現実験におけるhIL-6'主産性の増強 100

第4節 考察 ¹⁰⁰

第5節 小括 103

第11辛 各穐組換えタンハク質の生産性に及ぼすmガン遺伝子の効果 104

第l節 緒言 ¹⁰⁴

第2節 実験材料および方法 104

第l項 細胞培養および遺伝子導入 104

第2項 ELISA法による各種組換えタンハク質の定量 104 第3項 形質転換細胞の各種組換えタンパク質生産性の測定 107

第4項 高生産性細胞のスクリーニング 107

第3節 結果 ¹⁰⁷

第l項 hIL-6、 または凶.fAb AE6F4を産性している組換えBHK細胞への

rω導入による組換えタンパク質生産性の増強 107 第2項 BHK-21細胞への聞と各種組換えタンハク質の共導入による組換

えタンハク質生産性の増強 109

第3項 hIL-6およびhEPO高生産性細胞クローンの組換えタンハク質生産

性の増強 109

第4節 考察 ¹¹¹

第5節 小括 111

第12章 ras増幅BHK細胞における他の核内ガン遺伝子の生産性への影響 113

第l節 緒言 ¹¹³

第2節 実験材料および方法 113

第l項 細胞培養および遺伝子導入 113

第2項 hIL-6高生産性細胞の検出 113

第3項 形質転換細胞のhIL-6生産性の測定 115

第3節 結果 ¹¹⁵

第1項 目Aガン遺伝子によるhIL-6産生rω増幅BHK細胞の生産性増強 115

第4節 考察 ¹¹⁵

第5節 小括 117

V

第13章 ms増幅BHK細胞におけるCMVフロモーター活性化機構について

の検討 118

第l節 緒言 118

第2節 実験材料および方法 118

第l項 αWプロモーター中の転写同子結合部位の検索 118 第2項 細胞培養、 各種薬剤処理および評価系 118 第3項 細胞l人JhIL-6および�asガンタンハク質の検出 120

第4項 rω増幅BHK細胞のrωDNAコピー数の測定 121

第3節 結果 121

第l項 αれ/フロモーターの構造と関連する転写活性化困f 121

第2項 BCI-8細胞へのPMAの効果 122

第3項 PKC阻害剤H7および1>KA活性化剤DBu-cAMPの効果 123 第4項 細胞内hIL-6および�asガンタンパク質の検出 124 第5項 削増幅BHK細胞の間DNAコヒー数の測定 124

第4節 考察 126

第5節 小括 128

第14章 総括 131

謝辞 135

参考文献 136

聞各語

ABC， アビジン ・ ビオチン化HRP複合体

ABTS， 2，2にazino-bis (3-e出ylbenzothi位oline-6・s叫fonicacid) diammonium salt ADA， Adenosine deaminase (アデノシン ・ デアミナーゼ)

AMD， Actinomycin D (アクチノ マイシンD) A1下， Activating transcription factor

BPV， Bovine papilloma virus (ウシ ・ノてピローマウイルス) BSA， Bovine serum albumin

bsr， Bla5ticidin S dωminぉe cAMP， cyclic AMP CMV， Cytomegalovirus

4CN， 4-Chloro-l-naphtol (4-クロロー1・ナフトール) CREB， cAMP response element binding protein

DAB，3，'3・Diaminobenzidine (3，3'-ジアミノべンジジン) DBu・cAMP，Dibutyl cAMP (ジブチjレcAMP)

DF培地， (D恥1EM : F12=1:1の混合培地)

dh_fr， Dihydrofolate reductase gene (ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子) DMEM，ダルベッコ改変イーグル培地

DMF， N，N-Dimethylformamide DMSO， Dimethyl suLfoxide ECL，E叶mnced Chemi luminescence

EGF， Epidermal growth factor (上皮細胞成長因子) ELISA， Enzyme-linked immunosorbent assay ERDF， Enriched RDF

ERDF・PR-， フェノールレッド不含有ERDF培地

FACS， FLuorescence activated cell sorter (蛍光活性化細胞選択装置) FBS， Fetal bovine serum (ウシ胎児血清)

FCM， Flow cytometry (フローサイトメトリー) gpt， Xanthin-guanine phosphoribosyI transferase

GS， Glutamine synthetase (グルタミンシンセターゼ、)

H7， ^1-(5-Isoqulinolinesulfonyl)ー2-methy lpi perazine dihydrochloride HA1004， N-(2-guanidinoethyl)-5-isoquinolinesulfonamide hydrochloride HDL， High density lipoprotcin (ヒト高密度リボタンパク質)

HEPES， N-(2・Hydroxyethyl) piperazine-N' -(2・ethanesulfonic acid) hEPO， H山nan ery由ropoietin (ヒト ・ エリスロポエチン)

hG-CSF， Human granulocyte colony stimulating factor (ヒト・頼粒球コロニー刺激 HIV-LTR， Human immunodeficiency virus-long terminal r可児at

hMAb， H凶n加monoclonal antibody (ヒト型モノクローナル抗体) hnRNA， heterogeneous nuclear RNA

hph， H ybromycin B phosphotransferase HRP， Horseradish 戸m泊dase

HSP70， Heat shock protein 70 IL-2， Interle叫くin・2

ーVll-

IL-6， Interleukin-6

MBS. Myb-binding site (Myb結合部位)

1-Methoxy PMS， 1・Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate MTIIA， Metallothionein llA (メタロチオネインllA)

MTT， [3-{3，5-dime山ylthiazol-2・yl)-2.5-diphenyl tetrazolium bromide]

MTX，Me出ot陀xate(メトトレキセート) neo， Aminoglycoside phosphotransferase NF・χB，Nuclear factor χB

NHS-ビオチン，Biotinyl-e-amin∞aproic acid N -hydroxysuccinimide es舵r OAPシステム，Oncogene-Activated Production system

PBS， Phosphate bufferd saline

PE， R-Phycoeη出rin(f<-フイコエリスリン) PEG， Polyethylene glycol

P孔久，Protein kinase A (cAMP依存性キナーゼ) PKC， Protein kinase C (プロテインキナーゼC)

PMA， Phorbol 12-myristate 13・acetate (ホルボールー12・ミリスチン酸-13-アセテート) SCISA， Secretory Cell Immunoscreening Assay

SFME細胞， Serum free mouse embryo cell (無血清マウス胎児細胞) SRE， Serum response element

SV40， Simian virus 40

TGF-ß1， Transforming growth factor-ß1 TPBS， 0.05% Tween 20/pBS

Tween 20， Polyoxyethylenesorbitan monolaurate

羽w屯ST-1，[2-(付4-Iodoph恥1砲enyl)-3-(4牛-イ引nitroひphen一刊)-与5-(2，4牛-di白su凶llfoph恥1碍enyl)-之2H-t印et佐ra位zoriu凶lJTI孔1， monosodium sa1t]

第l草 序論

ヒトを含めた高等動物の細胞、 すなわち動物細胞はホjレモン、 サイ トカイン、 そして抗体などを始め とする多種多様の生理活性物質を

産し、 それ らを利用した複雑なネットワーク を通じて生体の'但常性の 維持に寄与している。 これらの生理活性物質は、 臨床における疾病の 予防や早期診断、 そして治療において、 効果的かつ有力な武器となる 可能性を持って いる。 実際イ ンターフエロンαFN)、 ティシュー ・ ブラ ズミノーゲン ・ アクチベーター (TPA)、 そ してエリスロホエチン(EPO) など、 現在すでに臨床で使用されているものもあるc

1973年にCohenら が初めて動 物の遺伝子DNAを大腸菌のフラスミドに 連結し増殖させることに成功して以来(Cohen_et aL.， 1973)、 “遺伝fI以"

はヒトの体内で微量に 生産されている有用生理活性タンハク質を得る ための有効な手段とし てクローズアップされてきた。 すなわち、 目的

遺伝子をクローニングにより取得し、 大腸闘で発現させることで、 す べての有用タンハク質を生産すること ができると信じられていた。

しかし、 生体内で有効な生理活性タンパク質は糖鎖修飾などの複雑 な翻訳後修飾を受けた複合タンハク質であることが多く、 Morellらによっ

て示されたように、 タンパク質部分のみでは十分な効果が期待し難い (Morell _et aL.， 1971)。 そこでタンパク質の翻訳後修飾の可能な動物細胞を 用いた有用生理活性タンパク質の大量生産が現在盛んになってきて い る(Griffiths， 1990)。

動物細胞を用いて物質生産を行う際に、 (1)動物細胞を大量に培養す る技術、 (2)動物細胞を高密度で培養する技術、 そして(3)高価で央雑 物が多く目的産物の精製の妨害となる “血清" を使用しない “無血清 培養" 、 が課題として あげられる。 それに加え、 特に大きな問題点と なっているのが、 動物 細胞の組換えタンハク質の生産効率が低いと い うことである。 これは決して、 動物細胞がそ の能力を持っていないの ではな い。 例えば、 ヒトのBリンパ球細胞は抗体を産生するフラズマ 細胞に分化した際、 1日あたり106個の細胞がIgGなら43問、 IgMなら280

1

�lgの抗イ本を産生できる(Murakami， 1990)。 このように 、 潜在的に高生産性 の可能性を持ちながらも様々な理由からその能力が抑制されているも のと考えられている。

現段階では 、 高生産性の細胞株を作製するため 、 ジヒドロ葉酸還元

酵素(dhfけ(Sch imke， 1984)、 アデノシンデアミナーゼ(ADA)(Kaufman ^et al.，

1986)、 グjレタミンシンセターゼ(GS)(Hayward ^et al.， 1986)遺伝子など を利 用した 、 “遺伝子増幅法" がよく用いられている。 特にdf{介を欠損した CHC細胞(Ur1aub ^et al.， 1980)とdhff遺伝子を用いた系はよく利用され てき ており、 TPA、 EPO、 Pーまたはy-IFNな どの高発現化が行われ ているぺ し かしながら 、 この方法には高発現株の取得のために選択薬剤であるメ

トトレキセー ト(MTX)の段階的な濃度上昇による細胞培養 ・ 選択をむ う必要があ り、 高発現株の取得に数ヶ月'""1年程度か かり、 かなりの

時間と労力を必要とするという欠点がある。

そこで、 本研究では 、 より簡便 ・ 迅速に高生産性細胞株を作製する ために 、 ガン遺伝子産物による 、 直接あるい は間接的なプロモーター 活性化を利用した 、 組換えタンパク質高発現動物細胞株の育種法の確 立を目的とした。

ここで、 ガン遺伝子に関して少しまとめる。 ガンが遺伝子の変化 、 特にその変異により生じるという考えは古くから存在していた。 し か しガンが 1つの遺伝子の導入によって引き起こされ るということが明 らかになったのは、 (1)ラウス肉腫ウイルスの温度感受変異株が得られ 、 細胞の遺伝子ではなく 、 ウイルス の遺伝子が 細胞のガン化を支配して いるという発見σ'oyoshimaandVogt， 1969; M紅白， 1970; Kawai and Hanafusa， 1971 )

と 、 (2)ラウス肉腫ウイルスのゲノム解析により、 その中に形質転換を 起こす遺伝子(v-src)が存在する ことを証明した研究(Duesbergand Vogt，

1970; l.ai ^et al.， 1973)に基づいて いる。 このような知見を基に して 、

Stehe1inらはsrcに特異的な c DNAを作製し 、 そのハイプリダゼーシ ョ ンに より、 src遺伝子と相同的な塩基配列が正常細胞の DNAの中に存在する ことを発見した(Stehe1in ^et a1.， 1976)。 その後、 多くのレトロウイルスがゲ ノム中にガン遺伝子を持ヮており、 それらは全ての宿主細胞の遺伝子

に由来すること が判明したコ このウイルス性ガン遺伝f(viralon∞gene，

v-onc)のそれぞれに対応する細胞側の正常遺伝子(Cellular proto-on∞gen久 c-onc)はほとんどの真核生物に存在し、 しかも種をこえて相同性を保持 していることが明らかになった。 一方、 ガン細胞のDNAを正常細胞に 導入して正常細胞を形質転換させ る試みは、 化学発ガン剤を用いてガ ン化させたガン細胞を用いて成功した(Shili ^et a1.， 1979 & 1981; Krontiris ^et al.， 1981) が、 この方法はすぐにヒトのガン細胞から得たDNAにも適用 された。 その結果、 形質転換に必要なDNA断片の塩基配列が、 Harvey肉 腫ウイルスのガン遺伝子として既に発見されていたm遺伝子と相同で あることがわかった(Parada ^et a1.， 1982; Chang ^et a1.， 1982; Dぽeta1.， 1982; Santos

et a1.， 1982)。 この発見は、 細胞の遺伝子の変化がヒトのガンの原因の1 つになって いることを直接証明しただけでなく、 ウイルス遺伝子の研 究によって見いだされていた細胞のガン遺伝子が、 実際にヒトのガン にも役割を持っているということ を示したものであり、 ウイルス由来 のガン遺伝子という概念からさらに広い意味で一般化された “ガン遺 伝子" という概念が形 成されたものである。 この時点において、 ガン 遺伝子という概念が、 実験動物を対象としたレトロウイjレスの分野を 越えて、 ガン一般の基礎的な問題として理解されるよう になったとい える。 長い間のガン研究の中で、 ガンのウイルス説は体細胞変異説と

対立するものと考えられてきた。 しかしガン遺伝子の概念によれば 、 ウイルスは細胞の遺伝子を変異した形で細胞に導入するものである か ら、 体細胞変異とガンウイルスによるガン化は同じ言葉で理解される ようになった。

その後の研究によって、 数卜種類以上のガン遺伝子が分離されてお り(Bishop， 1983)、 その遺伝子産物が核内に存在するものは核内ガン遺伝 子と呼ばれている。 多くの校内ガン遺伝子産物は核内での重要な諸反 応である複製、 転写そ してスプライシングに関与してい ると推定され てきた。 SV40のI抗原や、 ヒト ・ リンパ球白血病ウイルスのタンパク質 が複製や転写の制御因子 であるという明白な知見に比べ、 核内c-onc遺

伝子産物の機能については詳細には知られていないが、 最近これらの

3

遺伝r産物には転写制御肉子としての機能があることが明らかになり つつあるυ

例えば、 ニワトリ骨髄球症ウイルス由来のガン遺伝子であるmyb遺 伝子はSV40やHIV-LTRを活性化することが知られている (Nishi na et a1.，

1989; Dasgup凶efa1.， 1990)。 また、 ニワトリ肉腫ウイjレス由来jun遺伝子産 物はSV40エンハンサ一部位に結合するタンハク質であることが明らか

にされ。匂ki et a1.， 1987)、 後にそれはSV40エンハンサー結合タンハク質で ある転写制御凶子AP-l タンハク質と同ーのものであることが判明した (Bohma n n efa1.， 1987)。 このように、 正常細胞においてはガン遺伝子産物、

特に核内ガン遺伝子産物は宿主細胞のプロモーターやエンハンサ一部 位にlh;接作用して、 RNAポリメラーゼ、の転写活性を高めていることが 知られている。 MycはHSP70フロモー ター からの転写を促進することが 見い出されている(Kingsto n et a1.， 1984) ^c FosとJun�ま、 転写活性化因子AP-1 として転写制御にかかわってお り、 MI1IAやSV40等の転写を促進するこ とが知られている(Lee eta1.， 1987a; Angel et a1.， 1987; Chiu eta1.， 1988)。 アデノ ウイルスE1Aは、 AP-1の正の制御因子としての働きがあり(de G root et a1. ， 1991)、 また、 マウスDNAボリメラーゼp遺伝子のフロモーターを活性化 することが知られている(Yamaguchi eta1.， 1992)0 Rasは、 核内ガン遺伝子 の発現を誘導することが知られているので(Kelek訂and Cole， 1987; Satake et a1.， 1988)、 間接的にプロモーターを活性化すると考えられている。 また、

RasはTGF-ß1やIL-2プロモーターなどを活性化することも知られている (Geisぽet_a1.， 1991)。 このように正常細胞においてガン遺伝子産物は、 宿 主細胞のフロモーターやエンハンサ一部位に作用して、 RNAホリメラー ゼの転写活性を高めることが知られている。

OAPシステムとはFigure 1-1に示しであるように、 ガン遺伝子を有する エフェクターフラスミドと、 目的の有用生理活性タンパク質の遺伝子 を発現するレホーター プラスミドを宿主となる動物細胞に導入した場 合、 細胞内転写肉子によって活性化されたエフエクターフラスミド か ら活性化因子として作用するガン遺伝子産物が生産され、 このガン遺

伝子産物がレホータープラスミドのフーロモーターを細胞内転写同fと

CJl

Host animal cell

Cellular transcriDtion factors

U \ 仏 .

Product

Figure 1-1.高生産性細胞株育種のためのOncogene Activated

Production (OAP)システムの概念

共に活性化し、 最終的に組換えタ ンハク質の生産性が増強されるとい うものである(Shirahata et al.， 1991 & 1992)。

本研究では、 以下に示すように組換えタンハク質高発現細胞の育種 に関して研究を行った。 まず第2章ではOAPシ ステムで使丹jするフラス

ミド類の構築を行い、 第3章では一過性発現によるOAPシステムの検討 を行い、 第 4章から 第 6章まで は S Rαプロモー タ ーにおける生産性増強 を検討し、 第7章では高生産性細胞株を迅速にスクリーニングできる Secretory Cell Immunosα倒lÍng Assay (SCISA)法を開発し 、 第8章では新規細 胞数測定用化合物の検討を行い、 第9章から第12章まではCMVプロモー ターにおける生産性増強を検討し、 第13章では聞によるCMVプロモー ター活性化機構の検討を行った。

第2辛 ソラスミドの構築

第1節 緒言

まずOAPシステムを検討するにあたって、 有用生理活↑年タンハク質 を発現するフラスミドとガン遺伝子を発現するフラスミドを構築したに

本章では、 本研究で使用した全てのフラスミドの構築について述べ るν まずはじめに、 使用したベクタ一類について、 続いて使用した布 用生理活性タンハク質遺伝fおよび発現フラスミド類、について述べる。

そして使用したガン遺伝子および発現プラスミド類、について述べる。

組換えの際の方針はFigure 2-1に示した。 組換えに際しては日的遺伝子 の方向性と遺伝子断片の末端の理!に宕日し、 特に平滑末端のライゲー

ション効率は粘着末端のそれに比べてかなり低くなることを留意した。

また、 組込んだ遺伝子の方向の篠認も断片の両端が同じ酵素部位であ る場合には必要と なる。 そのため青白判定(Sambrooket a1.， 1989) による 組換えの確認が可能なサブクローニングで遺伝子の方向を確認し、 最 終的な発現ベクターに方向性を維持できるように組換えを行った。 ま た将来的に新たな組換えに対応できるようにす るため平滑末端化した 挿入遺伝子を発現ベクタ)に導入するような組換えはできる限り行わ ないようにした。

ガン遺伝子は、 ヒト・ アデノウイルスE1A (Takahashi et al.， 1986)、 ヒト c-fos (van S仕組ten etal.， 1983)、 ト1) Vゾun (Maki _et al.， 1987)、 トリv-myb (Bergmann

et al.， 1981 )、 ヒトc-myc (Taya et al.， 1984)、 そ し てヒトc-Ha-ras (Sekiya et al.，

1984) の6種類を使用し、 それぞれ凶中に示した部分を制限酵素によっ て切断し、 いったんクローニングベクターであるpBluescript IIにてサブ クローニ ングを行った後( v-mybを除く) 、 発現ベクターであるpRdCMV に組換えたσぽuya et a1， 1995; Yano et al.， 1995)。

有用生理活性物質の遺伝子の代表としては主にヒト ・ インターロイ キン- 6 (hIL-6)遺伝子( Hirano et a1.， 1986; Gauldie et al.， 1987)を用いた hIL-6遺 伝子はSV40の初期プロモーターとヒト ・ Tリンハ球白血病ウイルス

7

|挿入断片の末端の型|

!万向性のある粕窟末漏i ↓

サブク口一二ンク

↓

院現ベクタ-ヘ組換え| i

不可能

現ベクター ヘ組換えI

l末漏を平滑化して1

直接発現ベクター吋

\ ^新

^{い 組換え が}

できなくなる

、 7T.Jヴυベ、クターに

(方向性確認が必要)

...

V7向性のない粘着末端l J

+

而佐平?同

サブク口一二ング

方向性の確認

|発現ベクタ-ヘ組換え| +

Figure

2-1遺伝子組換えの方針

(H1LV)のLTRからなるSRαフロモーター を有するpcDL-SRα296 ベクタ ー (Takぬeeta1.， 1988)に連結されたフラスミド(pSRα-IL-6)を入手し 、 他のフ ロモーター を持つ発現ベクターへの組換え を行った。 ま た染色休に組

込まれることなく、 染色体外で高コピー数を維持できるウシ ・ ハヒロー マウイルス(BPV)ベクター( pBCMGSneo)(Karasuyama eto1.， 1989)にv-myb遺伝

子を組込んだエフエクターフラスミド を構築した。 またpSRα-IL-6'こMyb 結合部位(Oehleret 01.， 1990)を導入したpMBS-SRα-IL-6を構築した。

第2節 実験材料および方法

第l項 使用した遺伝子、 ベクターおよびプロモーター

1. 有用タンハク質遺伝子

本研究では主にhIL-6を有用生理活性タンハク質の一例として使用し た。 また各種組換えタンハク質の発現実験のため他にヒト ・ エリスロ ホエチン(hEPO)(Miyakeetal.， 1977; Lin eto1.， 1985; Powell eto1.， 1986)、 ヒト ・果責 粒球コロニー刺激因子(hG-CSF)(Nagata et al.， 1986; Nomura et al.， 1986)、 ヒト ま!Jモノクローナル抗体(hMAb)AE6F 4抗体(Shojiet 01. ，印刷中; Seki et al.，未発表)

の重鎖(y鎖改変型) および軽鎖(K鎖)、 そしてhMAbHB4C5抗体(Murakami et al.， 1985; Tac hibana et al.， 1993)の軽鎖(λ鎖)を使用した。 これら使用した

遺伝子のcDNA配列およびアミノ酸配列をFigure2-2に示した。

hIL-6、 hEPOおよびhG-CSFはキリンピール株式会社より入手した。 ま たhMAb AE6F4とHB4C5のcDNAは当研究室で調製されたものを使用した。

2. ガン遺伝子

本研究で使用し た ガ ン遺伝子をTab1e 2-1に示した。 pSV2-gpt-gE1A σ'akahas hi et al.， 1986)は東京大学の小野寺ーイ青↑卓上より入手した。 その 他のガン遺伝子はJ apanese Cancer Research Resources Bank σCRB)より入手し

た。

9

ト4

o

Human interleuki.n-6 (hIL-6)

1 ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GCC TTC GGT CCA GTT GCC TTC TCC CTG 48

1 M _N S _F S _T S _{A F G P V A F} S _{L 16}

49 GGG CTG CTC CTG GTG TTG CCT GCT GCC TTC CCT GCC CCA GTA CCC CCA 96

17 G L L L V L P A A F _{P A} 1 P V P P 32

I

97 33

145 49

193 65

241 81

289 97

337 113

385 129

433 145

481 161

529 177

577 193

GGA GAA GAT TCC AAA GAT GTA GCC GCC CCA CAC AGA CAG CCA CTC ACC 144

G E D S _{K D V A A P H} R _{Q P L T 48}

TCT TCA GAA CGA A宝� GAC AAA CAA ATT CGG TAC ATC CTC GAC GGC _{ATC 192}

S S _E R _{1 D K Q} 1 R _{Y 1 L D G 1 64}

240 80

AGC AAA _GAG GCA CTG GCA GAA AAC AAC CTG AAC CTT CCA AAG ATG GCT 288

S _{K E A L A E N N L N L P K} M _{A 96}

GAA AAA _GAT GGA _{TGC TTC} CAA ^{TCT GGA} TTC AAT GAG GAG ACT TGC CTG 336

E K D G C F Q S _{G F N E E T C L 112}

GTG AAA ATC ATC ACT GGT CTT TTG GAG TTT GAG GTA TAC CTA GAG TAC 384

V K 1 1 T G L L E F E V Y L E Y 128

CTC CAG AAC AGA TTT GAG AGT AGT GAG GAA CAA GCC AGA GCT GTC CAG 432

L Q N R _{F E} S S _{E E Q A} R _{A V Q 144}

ATG AGT ACA AAA GTC CTG ATC CAG TTC CTG CAG AAA _AAG GCA ^{AAG AAT 480}

M S _{T K V L} 1 _{Q F L Q K K A K N 160}

CTA GAT GCA ATA ACC ACC CCT GAC CCA ACC ACAIAAT GCC AGCICTG CTG 528 L D A 1 T T P D P T T I N A S I L L 176

'..Iu瓜直込込恥hιふ一...d

ACG AAG CTG CAG GCA CAG AAC CAG TGG CTG CAG GAC ATG ACA ACT CAT 576

T K L Q A Q N Q W L Q D M _{T T H 192}

CTC ATT CTG CGC AGC TTT AAG GAG TTC CTG CAG TCC AGC CTG AGG GCT 624

L 1 L R S _{F K E F L Q} S S _L R _{A 208}

625 CTT CGG CAA ^{ATG TAG}

209 L R _Q M *

Human erythropoietin (hEPO)

1 ATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC TGG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG 48

1 M _{G V H E C P A W L W L L L} S _{L 16}

49 CTG T閃CTC CCT CTG GGC CTC CCA GTC C四回CIGCC CCA CCA C民 CTC 96

17 L S _{L P L G L P V L G A P P} R _{L 32}

L 4-

97 ATC TGT GAC AGC CGA GTC CTG GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG 144

33 1 C D S R _{V L E} R _{Y L L E A K E 48}

145 GCC GAGIAAT ATC ACG ACG GGC TGT GCT GAA CAC TGC AGC TTG AAT GAG 192

生9 A E N 1 T T G C A E H C S _{L N E 64}

193 AAT ATC ACTI GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAT TTC TAT 民C T叩AAG A四 240

65 N 1 T V P D T K V N F Y A W K R ₈₀

� 1，1 t

241 ATG GAG GTC GGG CAG CAG GCC GTA GAA GTC TGG CAG GGC CTG GCC CTG 288

81 M _{E V G Q Q A V E V W Q G L A L 96}

289 CTG TCG GAA GCT GTC CTG CGG GGC CAG GCC CTG TTG GTC AAC _{TCT TCC 336}

97 L S _{E A V L} R _{G Q A L L V N} S S ₁₁₂

337 CAG CCG TGG GAG CCC CTG CAG CTG CAT GTG GAT AAA GCC GTC AGT GGC ₃₈₄

113 Q P W E P L Q L H V D K A V S _{G 128}

385 C宝� CGC AGC CTC ACC ACT CTG C宮司 CGG GCT CTG CGA GCC CAG AAG GAA 432

129 L R _{8 L T T L L} R _{A L} R _{A Q K E 144}

433 GCC ATC TCC CCT CCA GAT GCG GCC TCA GCT GCT CCA CTC CGA ACA ATC 480

145 A 1 S _{P P D A A} S _{A A P L} R _{T 1 160}

481 ACT GCT GAC ACT TTC CGC AAA _CTC T喧� CGλGTC TAC TCC AAT TTC CTC 528

161 T A D T F R _{K L F} R _{V Y 8 N F L 176}

529 CGG GGA AAG CTG AAG CTG TAC ACA GGG GAG GCC TGC AGG ACA GGG ^{GAC 576}

177 R _{G K L K L Y T G E A C} R _{T G D 192}

577 AGA TGA 193 R *

Figure 2-2aヒト・インタ一口イキンー6およびヒ卜・工リスロポ工チンcDNA の塩基およびアミノ酸配列

シグナル配列および件、 または0-結合型糖鎖の結合位置を図中に示したn

←A ト」

Human granulocyte colony sti皿11ating factor (hG-^CS^F)

1 ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG 48

1 M A G P A T Q S P M K L M A L Q 16

49 CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC 96

17 L L L W H S ^{A L} W ^T V Q ^{E A} I ^{T P 32}

S).go<... ...

97 CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG CTC AAG TGC ^{TTA 144}

33 L G P A S S ^{L P} Q S ^{F L L K C L 48}

145 GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG 192

49 E Q V ^{R K 1} Q ^{G D G A A L} Q ^{E K 64}

193 CTG TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC 240

65 L C A T Y ^{K L C} H ^{P E E L V L L 80}

241 GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC ^{CCC AGC 288}

81 G H S ^{L G 1 P} W ^{A P L} S S ^{C P} S ⁹⁶

289 CAG GCC CTG CAG CTG GCA ^GGC TGC ^{TTG AGC} CAA CTC CAT AGC GGC CTT 336

97 Q ^{A L} Q ^{L A G C L} S Q ^L H S ^{G L 112}

337 113

385 129

433 145

481 161

529 177

TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG 384

F L Y Q ^{G L L} Q ^{A L E G 1} S ^{P E 128}

TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC 432

L G P T L D T L Q ^{L D} V ^{A D F A 144}

ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG 480

T T 1 W Q Q ^{M E E L G M A P A L 160}

CAG CCC I^ACC ICAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC 528 Q ^P J__J Q ^{G A M P A F A} S ^{A F} Q ^{R 176}

( Ib、 測 ，<11

CGG GCA ^GGA GGG GTC CTA GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG 576

R A G G V ^{L V A} S H ^L Q S ^{F L E 192}

577 GTG TCG 宝AC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC TGA

193 V S Y ^R V ^{L R} H ^{L A} Q ^P *

Human MAb ^AE6F4 heavy chain V-region

1 ATG GAG T宜� GGG CTG AGC TGG GTT TTT CTT GTG GCT ATT TTA AAA GGT 48

1 M E F G L S W V ^{F L} V ^{A 1 L K G 16}

49 GTC CAG TGT GAG G居G CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CAG 96

17 V Q ^{C E} V Q ^{L L E} S ^{G G G L} V Q ³²

�'>-g守<:'1

9 7 CCT GGG GGG TCC C TG A GA C TC TCC TGT GCA GC C TCT GGA T TC ACC T TT 144

33 P G G S ^{L R L} S ^{C A A} S ^{G F T F 48}

145 AGC AGC TAT GCC ATG AGC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG ^{CTG 192}

49 S S Y ^{A M} S W V ^R Q ^{A P G K G L 64}

193 GAG TGG GTC TCA GCT ATT AGT GGT AGT GGT GGT AGC ACA TAC TAC GCA ²⁴⁰

65 E W V S ^{A 1} S ^G S ^{G G} S ^T Y Y ^{A 80}

241 GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC 288

81 D S V ^{K G R F T 1} S ^{R D} N S ^K N ⁹⁶

289 ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GCC GAG GAC ACG GCC GTA 336

97 T L Y ^L Q ^M N S ^{L R A E D T A} V ¹¹²

337 TAT TAC TGT GCG AAA GAT CGT AG司r TTT ATT ACT ATG ATA GTA GTG G'宜� ³⁸⁴

113 Y Y ^{C A K D R} S ^{F 1 T M 1} V V V ¹²⁸

385 ACA TGG GGCωGGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA I

129 T W ^G Q ^{G T L} V ^T V S S

V-l

Figure 2-2b.ヒト・頼粒球コ口二一刺激因子およびヒト型モノク口一ナル抗体AE6F4重鎖可変領域cDNAの塩基およびアミノ酸配列 シグナル配列および0-結合型糖鎖の結合位置を図中に示したc

Human MAb AE6F4 light chain V-region Human MAb HB4C5 light chain V-region

1 ATG GAC ATG GGA TTC CTG G'1"l' CAG C'1"l' CTG GGG CTC CTG CTA CTC TGG 48

1 M D M G F L V Q L L G L L L L W 16

1 ATG GCC TGG TCT CCT CTC T宜� CTC ACC C'1"l' CTC A'1"l' CAC TGC ACA GGG 48

1 M A W S P L F L T L L 1 H C T G 16

49 CTC CGA GGT GCC AGA TGT IGAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCC 96

17 L R G A R C I D 1 Q M T Q S P S S 32

Slgnal ...

97 CCG TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ATC ACT TGC CGG GCA AGT 144

33 P S A S V G D R V T 1 T C R A S 48

49 TCC TGG GCC.CAG TCT GTG TTG ACG CAG CCG CCC TCA GTG TCT GCG GCC 96

17 S W A I Q S V L T Q P P S V S A A 32

J a � _{一一 一一一}

97 CCA GGA CAG AAA GTC ACC ATC TCC TGC TCT GGA IAAC AGC TCC IAAC A'1"l' 144

33 P G Q K V T 1 S C S G I 一N S S I N 1 48

一寸 ^ー

145 CAG AGC A'1"l' AGC ACC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA 192

49 Q S 1 S T Y L N W Y Q Q K P G K 64

145 GGG AAT AAT TAT GTA TCC TGG TAC CAG CAC CTC CCA GGA ACA GCC CCC 192

49 G N N Y V S W Y Q H L P G T A P 64

193 GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT TTG CAA ACT GGG GTC 240

65 A P K L L 1 Y A A S S L Q T G V 80

193 AAA CTC CTC A'1"l' TAT GAC AAT AAT AAG CGA CCC TCA AGT ATC CCT GAC 240

65 K L L 1 Y D N N K R P S S 1 P D 80

241 CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC 288

81 P S R F S G S G S G T D F T L T 96

241 CGA T宜� TCT GGC TCC AAG TCT GGC ACG TCT GCC ACC CTG GGC ATC ACC 288

81 R F S G S K S G T S A T L G 1 T 96

ト」

じ日コ 289 ATC AGC AGT CTG CAA CCT GAA GAT T'1"l' GCA ACT TAC TAC TGT CAA CAG 336

97 1 S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q 112

289 GGA CTC CAG ACT GGG GAC GAG GCC GAT TAT TAC TGC GCA ACA TGG ACT 336

97 G L Q T G D E A D Y Y C A T W T 112

337 AGT TAC AGT ACC CCG TAC AGT T'1"l' GTC CAG GGG ACC AAG CTG GAG ATC 384

113 S Y S T P Y S F V Q G T K L E 1 128

337 AGC ATC CTC CGT GTC AAT TGG CTG TTC GGC GGA GGG ACT AAA CTG ACC 384

113 S 1 L R V N W L F G G G T K L T 128

385 129

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24 司品

V-Regi.on

Figure 2-2c.ヒト型モノク口ーナル抗体AE6F4およびHB4C5の軽鎖可変領域cDNAの塩基およびアミノ酸配列 シグナル配列およびN-結合型糖鎖の結合位置を図中に示したO