レー化 /

ライゲーション

v

Nh8

==頃蝉

�語障 BglIl αalï_Ecc晶

可t.___u..�.n ...6α刑判『回H lし6伯NA Kpnl

Hlndlll

Smal B8IηHI Smal

ト4c..o

Hlndlll S罵蕃 Human ^IL-6 cDNA S廓司t BamHI

加刷糊…明 ^助lA CMV promoter

polyA

+

�al Aful Nhel

E刷lHlndlll

62111

揃制

sa.1

ライゲーション

守

Sm..1 Pvull， α1

8仇I Sa/l処理'

附l:2;l

I#r.d川 Noll MCSIIえM

中d

鈴A

手話七ライゲーシヨン

\、

α1

a明s1 '"凶 m時l 卸RHlndnl 8amH1 命栂lE∞間内tI E∞RV Notl 治耳目 Apll

Figure 2-6. プロモーター組換え用のMCSIと挿入遺伝子

組換え用のMCS 11をもっpCVの構築

l'v トーム

NrtJ. CMV promoter

Pvull処理

，、・a、，

Hindlll Kpnl Sacl MCS B;�HI

Spel

EcoRI

Psll

EcoRV Notl Xhol

何千ì しむ

ライゲーション

1_" r.uv

H加dlll Kpnl Sacl MCS BamHI

Spel

EcoRI

Psll

EcoRV Notl Xhol Xbal Apal PvLAI

'-IftJ. CMV promoter

NrtA CMV

�， ^...^.promoter _.-ー-HindUl

�、 ./ ^Notl

司、曹、Y MCS Xbal

、，一一一 Ap剖

poly A

Ori

poIyA BμF円|

Pvull， BamHI処理

す

， poty A

BamHl

Figure ^2-7. Neor遺伝子を除去したpCMVPおよびdhfr遺伝子を導入したpCMVDの構築

Dihydrofolate

『剖uctase (dhfl)

出Ifr

Figure 2-8. 発現ベクタ-pCV/actおよびpCV/MTIIAの構築

む.，) 巳心

SS/I

EcoRI， BamHI処理

SWI

↓

ライゲーション

'

HumEll IL-6 cDNA

Amp'

一�

pBluescript I卜

(3.7 IL・6kbp) _噌、

fc:oR -- -ョt

HumEllIL・6 cONA

-ョE tJam n

EcoRI， BamH I処理

↓

-EcoRl

HumEllIL-6 cDNA

、BamHI

Hindlll， BamHI処理

↓

ライゲーション

v

Hindll，

Kpnl Sacl

MCS ^BamHI

SpeI EcoRI Pstl EcoRV Notl Xhol Xbsl Ap剥

H/ndlll Kpnl Sscl

MCS BsmHI

Human IL・e cDNA rBsmHI

poly A

Pvull

術11>'

戸、\

_ =:;:

pBluescript 11- ^{Human IL毛}

IL・6 ^cDNA

(3.7 kbp)

ーへÞJ司庫

、--創

Hindlll， BamHI処理

↓

-HJnc.訓"

Human IL-6 cDHA

、8amHI

Figure 2-9. ヒト・インタ一口イキンー6発現プラスミドpSG5-IL-6およびpCMVP-IL-6の構築

Hindllr 8amHI

SÞ8 1 Eヒ掛1

PBtI 氏。RV Notl Xbøl

Apsl

Nru1

αi

理処 MH m

H n Au ih --'

α1

f1 ori

1-1/00111 þ蕃

Human Il�

cONA

SøAt

1-11 Nrul

Ori

理処 HH m

H n Au ih --+ ih HH m 理処

--v Au n H

-Hlf凶111

Human IL・6 cDNA 'BamHI

Nfu1

Ori

Un I -

-司E

ぬJman Il喝 cDNA

、

^sm:a:

理処 HH m i

h--'

Au n H

-HIIldIll

Human IL�

cDNA

、、8amHI

t'0 ..þ..

Figure 2-10. ヒト・インタ一口イキンー6発現プラスミドpCV/act-Iし6およびpCV/MTIIA-IL-6の構築ライゲーション

+

紛ul

pCV/act-IL-6 r-^8，刷HI

(5.2ゆp) ...、k

poly A， \

SSII 問申伽.

ライゲーション

'

Nrul

αi

---Orl

f1 orl

pCV/MTIIA-IL・6

(4.8 kbp) polyA

Orl

Human Iし6cDNA .-BamHI

pCMVP-IL・6

(4.0 kbp)

SP6

poly A

P似Æ

pSG5・IL・6

(4.8 kbp) Human Iし6cDNA

BamHI

poly A

Hir刈川

a a，，， Pν 戸OEL、，FhM叩.ーし区HFし内。ロHはいno nv

Psft - �白蹴

Human IL・6cDNA

f'EcoRl

'Kpnt

poly A

F i 9 u re 2 -11 . 各種ヒ卜・インタ一口イキンー6発現プラスミド

...

戸-pCMYP-G-CSF、 pCMVP-AE6F4H、 pCMVP-AE6F4LおよびpCMVP-HB4C5Lを構築した(Figure2-12)。また、抗体として機能する凶1Ab AE6F4を効率よく発現させるための発現フラスミドpCMVP-AE6F4HLも構築した(Figure 2-13)

第3JJl ガン遺伝子発現フラスミド ( エフェクターフラスミド) の構築

Figure2-14にぶしたように、 pCMV系のエフェクターフラスミドとして、

pCMV-E1A、 pCMV-c-fos、 pCMV由v-myb、 pCMV-c-mycそしてpCMV-c-Ha-rasを構

築した勺 c-Ha-ra.dこ関してはdhfrによる遺伝子増幅が可能なpCMVl)-c-Ha-ras を構築した。またBPV系のエフェクターフラスミドpBCMGSneo-v-mybを構築した。

第4項 pMBS-SRα-IL-6の構築

DNA合成装置により、 Myb結合部位を8コピー含む合成DNAを作製した。続けてpSRα-IL-6のプロモーター上流領域に合成したDNAを導入し、

pMBS-SRα-IL-6を構築した。詳細な構築手順はFigure2-15に示した。

第4節考察

今同のフラスミド構築において、プラスミドDNA調製以外は刀研究宏において通常使用されている方法に基づいたものであり、本章で新しく試みた方法は、プラスミド調製のアjレカリ法-LiCl-ゲルろ過法、そしてリゾチーム-Triton法に関してである。アルカリ法四LiCl-ゲルろ過法は簡便にRNAの混入のないプラスミドDNAを調製するための方法でありアルカリ法のみの調製DNAと比較して、 RNA混入のない標品が調製可

能であった。一方、リゾチーム-Triton法は動物細胞実験に最も適したフラスミドDNA の調製が可能であり|高純度のDNAが調製できたが、これは最も時間と手間のかかる方法であり、多種類のプラスミドDNAを同時に調製したい場合には不適当であった。またこれらの方法を用いて

---I PvlAl

EcoRV Notl Xhol b届 Apal

EcoRI-Xbal， EcoR卜Notl， Pstl処理

ライゲ-ション

守

PvlAl

Nn.A

PvlAl

Xbal S帽 polyA

Notl S同阿yA

Pstl S向 potyA

Human EPO

Ef繍I X伊

陥Jman G-CSF

Ef痢 X�.

Human MAb AE6F4H

EfoAl 叩

PvIAI

Human MAb HB4C5L

叩一一吋立

Human MAb AE6F4L

P戸一明2

rXbal g司 polyA

Pstl 層調‘

問IyA

Figure 2-12. 各種組換えタンパク質発現プラスミドの構築

---poly A

，Psd rNoft S宅

g喝

同Iy A

PvlAl F

Nrul. Pvull処理

+

.�Pstl AE6F4L rPsd

g唱 AE6F4H

rNod g喝

凶yA

/

PvIAI

ン悦ヨ一フイゲ -EE'v 一

ンcp

w m

AE6F4L 同Iy A

pCMVP

AE6F4HL

(6.4 kbp)

d ^mL

^ot

poly A AE6F4H

Figure

2-13.

hMAb AE6F4発現フラスミドの構築

Konl Human adenovirus E1A Human c-myb

Aρal E伊l X� ^εcpA^l B判|

Xhol

Subcloning

SaJI Clal

Hir刈111 EcoRV

EcoRI N何

Pstl

Aρal Smal BamHI Soel

X同l Bï^mHI

Notl Sacl

NILA CMV promoter

1.2 kbp 2.3 kbp

Human c-fos Human c-myc

SfP ECfRl

30 kbp 46 kbp

Avian vゾun Human c-Ha-ras

E伊l N伊

1.0 kbp

Avian v-myb

Xfal X�

2.8 kbp

2.5 kbp

CMV promoter

Nftl

Ampr

pBCMGSneo

(14.5 kbp) Human ß・910凶n

PvtAI

、ーーーー

ーー_.-pCMV-E1A， pCMV・c-fos， pCMV・v-jun， pCMV・c-myb pCMV・c-myc，

pCMV・C・Ha-ras， pCMVD-c・Ha-ras and pBCMGS-v-myb

Figure

2-14. 各種ガン遺伝子発現プラスミドの構築

Xhol Notl

オリゴヌクレオチド1

5・ー〉

TTGGATAムl'AACGG，込ATCTAGG�TAACGGAATCTAGG主ATAACGGAATCTAGGAATAACGGAACA

CfuI TA�ATTGCCTTAGATCCTTATTGCCTTAGATCC中TATTGCCTTAGATCCTTATTGCC小TGTAACC

オリゴヌクレオチドH

オリゴヌクレオチド111

5・国〉

く-5・

TTGGATAATAACGGAATCTAGGAATAACGGAATCTAGGAATAACGGAATCTAGGAユTAACGGAACA HindIII

TATTATTGCC宝�AGATCCT宝A宝�GCCTTAGATCCTTA宝�GCCTTAGATCCTTATTGCCTTG宝�CGA

オリゴヌクレオチドIV

オリゴヌクレオチド I�-rvの合成

↓

オリゴヌクレオチド1 + IIのアニールオリゴヌクレオチドrrr+ IVのアニール

↓

オリゴヌクレオチド1 II

+ 歩ライゲーション(MBS断片) オリゴヌクレオチドIII lV

↓

pSR a IL 6をHindIII EcoRIで処理し処理

HindIII SR a IL 6 EcoRr断片(断片A) 断片B

、 pSRαlL 6をClaI EcoRIで処理

ClaI Ampr ori Poly A EcoRI断片(断片B)

↓

MBS断片、断片A、および断片Bのライゲーション

(赤字部分はMBS}

pSRα-IL・6

Fi gure 2-15. p M

BS-SRα-IL-6の構築

<-5・

断片A

調製したDNAを使用して細胞実験を行ったが、特に実験に支障が出るようなことは起きず(防匂not shown)、いずれの方法を用いても卜分動物細胞実験に使用可能なDNAが調製できた。

また、 PCR法を用いて遺伝子組換えを行うという方法(Shuldinぽet al.，

1991)、また数十kbpのPCRが可能となってきている(Cheng etal.， 1994) こと、

そしてコスミドベクターを使用し1度で多コピーの遺伝子を導入する (Tak岱hitaet al.， 1988)という報告もあり、今後様々な新しい方法を利用してより簡便に短時間で遺伝子の組換えが行えるようになっていくものと思われる。

第5節小括

OAPシステムを検討するため以下のフラスミドを購入、入手、もしくは構築した。

1. クローニングベクター:pBluescript n、 pSL1180

2. 発現ベクター:pcDL-SRα296、 pBCMGSnω、 pRdCMV、 pSG5

3. 薬剤耐性ベクター:pSV2-neo、 pSV2-dhfr" pSV2-gpt、 pSV2-hph" pSV2-bsr 4. 構築した発現ベクター:pCV、 pCMVP、〆::MVD、 pCV/act、 pCV島打nA

5. hIL-6発現プラスミド:pSRα-IL-6、pCMVP-IL-6、pSG5-IL-6、pCV/act -IL-6、

pCV&灯llA-IL-6、 pMBS-SRα-IL-6

6. 各種組換えタンパク質発現プラスミド:pCMVP-EPO、 pCMVP-G-CSF、

pCMVP-AE6F4H、 pCMVP-AE6F4L、 pCMVP-HB4C5L、pCMVP-AE6F4HL

7. 各種ガン遺伝子発現フ。ラスミド:pα.fV-EIA、 pCMV-c-fos、 pCMV-v-myb、

pC乱れT-c-myc、 pCMV -c-Ha-ras、 pCMVD申c-Ha-ras、 pBCMGSn伎〉晶子myb

第3苧: ， A j極性発現実験における各極フロモーター制御下でのhIL-6発刻レベルとガン遺伝子導入による各待.プロモーターの活性化

第 l 節緒バ

Jえ々は転写活性化作用が良く調べられているガン遺伝子による肖按あるいは間接的なフロモーター活性化作用を利用し、細胞の組換えタンパク質の/主産性を増強するシステムを考え、これをOAPシステムと名付けた(S hirahata et al.， 1991 & 1992)。このOAPシステムに基づき、迅速かつ簡便に組換えタンハク質の生産性を増強する方法の開発を試みた。

実際に動物細胞に遺伝子導入を行い、薬剤耐性を指標とした選択、

クローニングを行い、最終的に組換えタンハク質の生産性の増強を確認するまでにはかなりの時間が必要とされる。そのためOAPシステムの有効性に関しての検討も同様に時間が必要とされる。そこで、まず、

取初に有効なガン遺伝子や組換えタンパク質発現に使用するフロモータ)との組合せなどの一次的な選択を行うために、短期間で結果の伊

られる一過性発現(Lins1ey and Siminovitch， 1982)の系において検討を行ったヲ

第2節実験材料および方法

第1項細胞培養

ハムスター由来BHK-21細胞、マウス由来NIH3T3細胞、アフリカミドリザル由来Vぽ0細胞およびCOS-1細胞は5 %のウシ胎児血清σBS)を含む

ダjレベッコ改変イーグル培地(DME問中で培養した。 CHO-DUKXBl1細胞(U rlaub et al.， 1980) (dh介欠損CHO細胞、以後CHO細胞とのみ表記) は10 mMヒポキサンチンおよび1.6mMチミジンを添加した5% FBSIDMEM中で培養した。ただしトランスフェクタム法による遺伝子導入の際には ERDF培地(健東製薬) をDMEMの替わりに使用した。そしてhMAbを産生するハイプリドーマ作製用の親株であるRF-SI細胞は5%FBSを含むERD:

培地rt1でよ庁長したっまた全ての細胞は370C、 5% C02J95%空気の条件ドマミ培薬を行ったコ

第2項遺伝f導入法

l. トランスフェクタム法

この)j法はリホソームを介した動物細胞への遺伝子導入法のー穐で、

トランスフェクタムはSEPRACOR �匂rlborough， MA) より購入して使則した。本法の原理はカチオン性の脂質により形成したリボソーム(トランスフェクタム) とDNAの複合体を調製し、培地中に加えたトランスフェクタムーDNA複合体が細胞のエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれるというものであるのehr ef a1.， 1989)。本法の最大の長所は細胞毒性が低いよなにあり、そのため初代細胞などへの遺伝子導入にも適している。また多穴プレートを用いての多種類の遺伝子導入実験を可能とし、最適DNAの組合せのスクリーニングに応用が可能である。本法による遺伝子導入を以下に示す。

最初に0.5μgのDNAと2.5μgのトランスフェクタムを合む20μiのDNA- トランスフェクタム溶液を96穴プレートの各穴に入れた。 50μlの細胞懸:

濁液(3^X103個の細胞を合む) を96穴プレートの各穴に加えよく混合した。 370C、 5% C02J95%空気の条件下で1時間インキュベートした後、長終的な血清濃度が10%になるように150μlの血清添加ERDF培地を加えた0

3口問培養後、培養上清を同収しELISA法によりh1L-6の量を測定した。

2 . リン酸カルシウム共沈法

動物細胞に外来性遺伝子を導入する最も一般的なえf法のlつで、 DNA がリン酸カルシウム共沈澱物としてある時、動物細胞へのDNAの取り込みが著しく促進されるという現象を利用したものである。この)j法は、 1 9 70年代前半頃に開発され(Graham and ^Van以� Eb， 1973; Wigler ^eta1.，

1977)、特別な装置、技術を必要としないことから遺伝子導入によく利用されているc 遺伝子導入効率を高めるためにグリセリン、 DMSO、ク

ロロキン処用併HJが行われることがある(Corsaro and Pωson， 198 1 )- その後ChenとOkayamaは本法に改良を加え高い効率で細胞にDNAを導入する方法を維なしている(Chen and Okayama ， 198 7)。本章では従*�去のリン椴カ

ルシヴム共沈法を使用した。

リン酸カルシウム共沈法(従来法) で使用した試薬は、 2.5 M CaC12および、2X HBS (HEPES-phosphate Buffered Saline ， 280 mM NaCl， 10 mM KCl， 1 .5 mM N�HP04' 50 mM HEPES， pH 7.2)であった。遺伝子導入の前日に細胞をまきかえ、遺伝f導入の直前に培地を交換した。リン酸カルシウムーDNAの沈澱の作製法および遺伝子導入法を以下に示す.) 0.25 M CaC12溶液250μ1 中にDNA 10μg (店養培地5 mlに対し、 10 �lgのDNAを含むリン酸カルシウムーDNA沈澱懸濁液を500 �t1調製)を含むよう調製した。このDNA-CaC12溶

液を25G5/ 8 の針のついた1mlシリンジにとりよく撹排した後溶液を全部シリンジにとった。別に用意しておいた250 �t1の2XHBS中にDNA-CaC12溶液を2--3滴ずつ滴ドしてはよく混ぜ、た。この操作で濁った沈澱が形成

される(1 つの試料につき5分程度の時間が必要) 。そして室温で混合した溶液を1時間放置し沈澱を熟成させた。 1 mlシリンジで沈澱をよく撹祥し、沈j殿が均ーになるように培養務中の培地をよく混ぜ、ながら培地

中にゆっくりと滴下した。リン酸カルシウムーDNAの沈澱の生成を促進するために格養器を30分間クリーンベンチ内に静置した後 (培地を少し場基性にするため ) 、 370C、5% CO2/95%空気条件下で6時間インキュベートした。インキュベート後、培地を抜き10% DMSOIDMEM'で1分間処理し、

DMEMで、2凶洗い培養培地を加えた。

遺伝子導入後3日日まで培養し、よ斉養上清を阿収しELISA法により hIL-6の量を測定した。

第3項ヒト・インターロイキンー6 の定量

遺伝子導入の後、和i換え細胞によって産F主されたhIL-6の量は酵ぷ抗体法(ELISA)σeruya ^et01.， 1993)により測定した。このELISA法の千JIIrrにつ

いてはFigure 3-1に示した。また使用したヤギポリクローナルt1t_hIL-6は

ドキュメント内ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物細胞株の育種 (ページ 30-53)

レ ー化 /

v

+

62111

守

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何千ì しむ

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↓

↓

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戸、\

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理処 MH m

H n Au ih --'

理処 HH m

H n Au ih --+ ih HH m 理処

--v Au n H

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、

理処 HH m i

h--'

Au n H

+

'

守

+

/

ン 悦 ヨ 一フ イ ゲ -EE'v 一

w m

d mL

Figure

hMAb AE6F4発現フラスミドの構築

Subcloning

ーー_.-pCMV-E1A， pCMV・c-fos， pCMV・v-jun， pCMV・c-myb pCMV・c-myc，

pCMV・C・Ha-ras， pCMVD-c・Ha-ras and pBCMGS-v-myb

2-14. 各種ガン遺伝子発現プラスミドの構築

BS-SRα-IL-6の構築

ン悦ヨ一フイゲ -EE'v 一

d ^mL