ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物細胞株の育種

(1)

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物細胞株の育種

照屋, 輝一郎

九州大学農学研究科遺伝子資源工学専攻

https://doi.org/10.11501/3099889

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（農学）, 課程博士バージョン：

(2)

第9市ガン遺伝fの遺伝子増幅による動物細胞のhIL-6午産性の増強第l節緒r1

これまでOAPシステムに基づき、迅速かつ簡便に組換-えタンハク質の坐虐性をよ円強する方法の開発を試みてきた。はじめにSRαフロモー

ターをレホータープラスミドのプロモーターとして注目し、各干重オンコジーンを月jいてSRαフコロモーターの活性化を試みてきた。その結果、

過性党現実験では牛.産性が増強されたクローンの出現が認められたものの、恒久発現実験では生産性の急速な低下が見られ (第4章) 、安定な増強効果は認、められなかった。この原凶のーっとして、ガン遺伝子の発現レベルの低さが考えられたため、恒久発現実験を行う際に薬剤耐性遺伝子(dhff遺伝子) の共増幅作用を利用してガン遺伝子の増幅を行った。またCMVフロモーターと各種ガン遺伝子の組合せでの生産性増強効巣について調べた。

第2節実験材料およびノf法

第1項細胞培養および遺伝子導入

BHK-21細胞は5% FBSを含むDMEM中で、 370C、 5% C02J95%空気の条件下で培養した。遺伝子導入にはトランスフェクタムを使用した。

CMVプロモーターの制御下でhIL-6を産主主する組換えBHK細胞の作製のために、 pCMVP-IL-6(4.5μg)と薬剤選択マーカーとしてpSV2-bsr(0.5 �tg)

を共導入した。プラストサイジンS(BS)耐性を指標にし(lzumiet al.， 1991)、

安定にhIL-6を生産する組換えBHK細胞(BCI-8細胞)を作製した。続いてこの細胞に、各種ガン遺伝子(4.5μg) と薬剤選択マーカーとして pSV2-dhfr (0.5μg) を共導入し、 5%透析FBS (dFBS)、 50 nM M1χを合む h伍Mα(ー)培地中で細胞の選択およびガン遺伝子の増幅を行った。

(3)

第2^JlI SCISAUょによるhIL-6r�j 生定性細胞の検/H

恒久発現尖験でのhIL-6高生産性細胞の検出にはSCISA法を用いた(第 7辛参照)コ

第3^JJI )形質転換細胞のhIL-6生産性の測定

組換えBHK-21細胞の hIL-6生産量はELISA�，去を用いて測定した(第3y

参照) ⁰ 9 6穴フレートおよび35 mm培養器中の細胞数はWST寸法(第8 主参照)、セルカウンターを用いてそれぞれ測定した。それらの他より細胞106倒あたりの生定性を算出した。

第3節結果

第l項 CMVフロモーター制御下でhIL-6を生産する組換えBHK細胞 (BCI-8細胞 )の牛‘産性の増強

BCI-8細胞にpCMV-c-fos、 pCMV-v-jun、 pCMV-v-myb、 pCMV-c-mycおよび pCMV-c-Ha-rasをそれぞれpSV2-dhfrと共導入し、 50 nM Mfχでガン遺伝子の増幅と細胞の選択を行った。対照として pRdCMVとpSV2-dhjヤを共導入し、問機にM1χで処理した。 MIχ処理後SCISA法を用いてお生産性細胞のスクリーニングを行った。その結果、仰を導入・噌幅した細胞にの

み明らかに高い生産性を示すクローンが出現した。またmycとfosで、は明強効果は認められず、junでは生産性が著しく減少していた(Figure9-1 )。

rωを導入した試験区から高い生産性を示したクローンをスケーjレアッフして、細胞あたりのh1L-6生産性を測定した。 1 2クローンについて調べたところ、対照の平均生産性が100 ngll06細胞/口であったのに対し、

最も生産性の高いクローンは約20倍の2μgl106細胞/日の生産性をノメした σigure 9-2)。この細胞は遺伝子導入後約2ヶ月間は安定に生産性を維持していた。

(4)

c..o L中

c-fos v-Jun

v-myb c-myc c・Ha-ras

Fiqureふ1ガン遺伝子発現プラスミドを導入・増幅した組換えBHK細胞の分泌h1L-6の検出

(5)

Relative Productivity

15 10 5

。 Control

3 4 5 6

8

10

12

14 7

11

13 9 2

』ωaεコZωco一。

Figure ^9-2.rasを導入・増幅した組換えBHK細胞の相対生産性

hIL-6高生産性細胞作製のための至適遺伝子導入条件の設定第2項

50

CMVプロモーター制御ドでの前項で示したようにBCI-8細胞にrω遺伝子とdhfr遺伝子を共導入し、

nMMIχで、m遺伝子を増幅することで、

hIL-6の^{生産}^性^を2⁰^倍^に高める^こと^がで^き^た。さらに高い生産性を示す細胞を取得するため、導入するm遺伝子の量、 m遺伝子とdhjトの比、薬剤選択および増幅開始時におけるMTX濃度についてその最適条件を求

M1χ濃めた。

BCI・8細胞にpCMV-c-Ha-ras 4.5 �tgおよびpSV2-dhfrO.5μgを導入し、

(6)

!主を25nM、 50 nM、 75nM、そして100 nMと変えたJ その結果、 25nMで、は f-分に細胞の選択ができず、 75nMおよび100 nMではほとんどの細胞が死滅してしまい耐性細胞が得られなかった。最終的に50nMでのみhIL-6 高生産竹細胞のtl'，現が認められた(Figure9-3A)。

次にpCMV-c-Ha-ras: pSV2-dザrよヒを9:Uこ同定し、至適m遺伝f導入泣を検討した3 その結果ros2.2 �lgおよび4.5μgの時に高い生産増強効果が得られた。さらにrω2.2μgの時に最も高い生産性を示す細胞が得られた( Figure 9-3B)。細胞に導入するraç: dhfrのモル比を凶のように変化させ

ところ、 ms : d�ρ�5 : 5の時に最も高い生産性を示すクローンが出現した( Figure 9-3C)。

以上の結果よりpCMV_-c-Ha-ras2.5階、 pSV2-dザヤ2.5階、そして50凶1:MTX の時に最も効ネa良く高性定性細胞を取得できると考えられた。またこの条件を丹jい約35倍の生産性(3.4μg/106細胞/U)を示す細胞株を作製することカfできた。

(A)

25nM

F iE C吹.Eo tEb ^{，，}^s

50nM

〉ト2〈・

75nM 100nM

o 10 20 30

.

(8)

。

� 2.2 急4.5

0 3:

890 18.0

o 10 20 30

? ^.2.・

ド ^・1・

's，

(C)

-4可語、3 =

9 : 1 7:3

‘4司ー=・

5 :5

o

E 3 7 悼

^ー

。吉。 1 : 9

o 10 20 30

・-.・・空. .

^'

�.・，

-

.

.. . . .'

‘.c .; �- ^•

，

・・ .

. .

_-

，

Figure 9・3. 遺伝子導入、または薬剤選択の条件のh1L-6生産性に及ぼす影響

第4節考察

CMVフロモーター制御ドで安定にhIL-6 を生産するBCI-8細胞に各ガン遺伝fを発現するレポーターフラスミドを導入し生産性の増強を試み

(7)

たコその際にガン遺伝fを卜分に発現させるために、薬剤耐性遺伝r

(d�tr)のJtl首脳作川を利用してガン遺伝子の増幅を行った、その結果、

r似遺伝fを導.人・増幅することでhIL-6の生産性が、 20借地強された細胞(2 �^lg/_l06細胞/H ) を作製することができた (Sh _廿油ata ^etal.， 1994)。この細胞は高生産↑メf::を約2ヶ月維持していた。

次に、さらに高い生産性を示す細胞を作製するための至適条件を求めた。その結果、MTχ濃度50凶1'\ ms: dhfr=l : 1 ( pCMV-c-Ha-ras 2 .5問、

pSV2-d内fr2.5μg) が至適条件であると示唆された。実際にその条件で向生産性細胞の作製を行ったところ、約35惜の生産性(3.4μg/106細胞/口) を示す細胞を作製することができたっ

ras遺伝f 産物であるp2 1 タンパク質は、細胞膜内に存在し、細胞の分化、増殖をはじめ種々の細胞機能の制御に携わっていることが明らかとなっており、また核内ガン遺伝子の発現を誘導すること、細胞内転

調節附子を活性化することなどが知られている。したがって、 mが低濃度の薬剤によって増幅され細胞内で十分に発現したことで、核内ガン遺伝子の発現を促し、間疑的にCMVフロモーターを活性化しhIL-6

止産性を増強することができたのではないかと与えられた。

BCI-8細胞にpSV2-dhfrのみを同様に導入・増幅したものでは牛産性の増強は起こらなかったo nωを導入しただけでも、高生産性細胞のtl'，現は認められなかった。これらのことより、牛.産性を増強するためには 50凶t1M1χの遺伝子増幅によるmの発現増強が必要であると考えられた〉

第5節小括

本章ではCMVプロモーターにより制御されhIL-6を発現する組換え BHK細胞であるBCI-8細胞において、 rasをd内frと共導入し50 nMMTXによるmの増幅でhIL-6生産性を約35倍に増強できることをぷした。またms 導入・増幅による生産性増強の際の至適条件は以下の通りであった。

1. pCMV-c-Ha-ras 2.5μgおよび、pSV2-dhjヤ2.5μgの遺伝f共導入

2 . 50凶t1MTXによる細胞の選択および遺伝f増幅

(8)

第10 1'71= rasを導入し増幅した細胞によるhIL-6向中産性細胞の作製

第i節給r ⁱ

|布市でぶしたように、 CMVフロモーター制御下でhIL-6を生産する BCI-8細胞に仰とdhfrを共導入し、 50nMM1χ選択によるm遺伝子の増中討を行うことで't産性を約35tffに増強することができた。この方法は遺伝子増幅法を取り入れているが、 MTχ濃度が50nMという低濃度で卜分であったことと、向性産性細胞のスクリーニングにSCISAtlミを用いたために、従来の他段階の遺伝子増幅法より短期間で高坐産性細胞株を樹

、Zすることが可能であった。実際にこの方法を用いて高生産性細胞の取得を試みる場合、予め日的のタンパク質を安定に生産する組換え細胞を作製し、次にrasを導入して増幅しなければならなし川ここで、あらかじめrωを導入・増幅した細胞を作製しておけば、その細胞に[j n0 のタンハク質を発現するレホータープラスミドを導入するだけで、 !日i

生産性細胞の取得が則符できる。そこでBHK-21細胞にm遺伝子を導入し50nMMTX選択による遺伝f増幅を行い、より迅速に生産性を増強で

きる細胞の作製を試みた。

第2節実験材料および方法

第1項発現フラスミドの構築

rωを増幅した細胞を作製する際に、 rasとdhfrを共導入するより、 rωと dhfrを含む1つのプラスミドを導入する方が、より確実にrωの増幅した細胞を得られるはずである。そこでdhfrによる遺伝�r 増幅に対応した pCMVD-c-Ha-rasを構築した(第2章参照)。

第2項細胞培養および遺伝子導入

(9)

BHK-21細胞は5% FBSを合むD_ME_M中で、 37CC、 5% C02J95%空気_の条件ドで桁jをした。 BHK-21細胞へのpCMVD-c-Ha-rasの導入はトランスフエクタ_ム法により 1 f _った。またrωを導入 _・噌幅した細胞へのp_CMVP-IL^-6の

導入は、高効ネリン酸カル _{シウム} 共沈法_により行 _ったっ

第3 JJi SCISAi去によるhIL-6高生産性細胞の検出

↑可久発現実験_でのhIL-6高生産性_細胞の検出にはSCISA法_を用いた(第 7辛参照)。

第4 JJi 形質転換細胞のhIL-6牛産性の測定

組換えBHK-21細胞の hIL-6生産量はELISAi去を用いて測定した(第3i市参照) 0 96穴フレートおよび35 mm培養器中の細胞数はWST-l法(第8 17E参照)およびセルカウンターを用いてそれぞれ測定した。それらの値_より_{細胞1 0}₆例あたりの生産'門_を算 t Hした。

第3節結果

第i項 TBR細胞の作製

トランスフェクタム法によりBHK-2 1細胞にpCMVD-c-Ha-ras 5μgを導入した。 G418耐性を指標に形質転換細胞の選択を行い、続いて50_nMM1χ

選択によるm遺伝子の増幅を行った。得られた細胞(TBR細胞)の牛産性増強効果について調べた。

第2項 TBR細胞の生産性増強効果

TBR細胞にpCMVP-IL-6 4.5階、薬剤選択マーカーとしてpSV2-bsrO.5 �lg、

そしてDNA量を調整するためのウシ胸腺DNA10 �tgを向効率リン般カル

(10)

シウムJti尤jよ-を)f]いて共導入した。また、対照としてBHK-21細胞にも

111J燥にDNAを共導入したっプラストサイジンSによる莱ー剤選択後、

SCISAi去を川いてhIL-6年産性増強効果について調べたり

その結果、 TBR細胞に高い生産性を示すスホットが検出され(Figure 10-1)、 TBR細胞に性産性増強効果があることが示唆されたコこのTBR細胞集l什のrt1には生産性増強効果のない細胞集団も存在すると考えられたため、 TBR細胞のランダム・クローニングを行い、 2 1伺の単一・クローンを取得し、以下の夫験を行ったc

BHK・21 TBR

Figure 10-1. rasを導入・増幅した組換え細胞打BR)の分j&5hIL-6の検出

(11)

- )位性発現実験によるII:_産性増強効果の高いクローンの選r 第3JJ[

2 1 1151 ノ!=- }主性増強効果を調べたι

作られた2 11l，�のクローンについて、

過性発現実験を行った。対照にはBHK-21細のクローンを3 fn[に分け

胞をJHいたっ

24火フレートにBHK-21細胞と7種のクローンをそれぞ、れ3X 104細胞/

ン酸カ pCMVP-IL-6を1.6 �lg/穴の割令で高効率リ

穴で3穴ずつまきこみ、

3日間の培養後に培養1--清 8導入した。

jレシウム共沈j去を用いて遺伝

を川収して分泌されたhIL-6量を測定した。

BHK-21細胞に対しクローンNO.19が5倍と最も高い生庫代その結果、

2.5倍、そし NO.18、そしてNO.3がそれぞれ3.5倍、

またNO.17、

を示した。

このことよりクローン NO.3、

NO.17、 NO.18、 NO.19を以下の実験に使用した。

て1.5惜の生産呈:を示した(Figure 10-2)。

6

5 4 3 2

。 1

』ωaEコzoco一ハ)

Figure 10・2各TBR細胞クローンの一過性発現における相対生産性

(12)

第4JSf _↑r(久党現実験における hIL-6'1て産性の増強

前Jjfで'I�定性増強効果が認められたクローンNO.3、 NO.17、 NO.18、

NO.19について、恒久発現実験での生産件増強効果について調べた 60mm培長器に 3X 105個の各TBR細胞クローンをまきこみ、 pCMVP-IL-6 13.5 p.g、薬剤選択マーカーとして pSV2-bsr 1.5 �lgをl奇効ι本リン酸カjレシ

ウム共沈jよ-で遺伝子導入した。プラストサイジンS薬剤耐性を指標に細胞の選択を行い、 SCISA法を用いて高生産性細胞の検出を行ったコ

その結果、 BHK-21細胞では高性産性細胞は出現しなかったが、クローンNO.3、 NO.17、 NO.18、 NO.19の全クローンにおいて高F主産件.細胞が出現した(Figure 10-3) ^l) I �JでもクローンNO.19において高生産性細胞が最も多

く認められた

それぞれの試験灰から高い生産性をぷしたコロニ)を選択し、その正確な'1_:_産性を調べた結果、クローンNO.19からヒックアップしたコロニーの中に15倍(1. 34 �lg/106細胞/日)と最も生産性の増強された細胞株が

得-られた(Figure 10-4)。

第4節考察

予めrωを導入し明幅したBHK細胞であるTBR細胞にpCMVP-IL-6を導入することで、 BHK-21細胞に導入するより、約15倍生産性の増強された細胞を作製することができた。この結果よりTBR細胞は高生産性細胞株作製のための宿主細胞として有望であると考えられた。

しかしながら TBR細胞から作製された高生産件細胞のhIL-6乍広竹は1.34 �lg/l 06細胞/口であり、前章で得られた3.4μg/106細胞IUと比較した場合1/ 2程度と低いものであった。この原丙としては以ドのことがィラえられた。第9章では予めh1L-6を発現する組換え BHK細胞にm遺伝rを導入・増幅した。そのためrω導入・噌幅細胞の全てが高中産性細胞のスクリーニング対象となっていた。 - - )jで、本章においては予め 2 1クローンのTBR細胞がランダムに選択されていた。つまり第9章ではスクリー

(13)

BHK・21

TBR・3 TBR・17

TBR・18 TBR・19

Figure 10-3.

pCMVP-IL-6導入後の各TBR細胞の分泌h1L-6の検出

(14)

本章では2 1個にすぎないことが最高年応性のレベルの走として現れたものと考えられた、

ニングのほ集|什が104個程度であるが、

Productivity (Jlgl1 06cells)

1.5 1.0

0.0 0.5

3・4

19・5

19・9 19・10 17圃5 17・6

19・3 19-4

19・7 19・8 19圃2 BHK21

18・1 19・1

』oaEコzoco一。

fr

Figure 10・4各TBR細胞クローンの恒久発現におけるhlし6生産性

J番の特徴は、

方で、本章で検討したTBR細胞を丹jいることの

め組換えタンパク質を産生している細胞株を準備することなく、レボー s産性細胞を作製できるこ短期間で高

タープラスミドの導入のみで、

実験の目的によっては高生産性細胞株作製の期間短縮が最とである。

そのような場合には本軍も重要な要素となる場合も十分にあり得る。

で検討したTBR細胞を使用した高生産性細胞株作製法は有効な手段とまた本章では2 1クローンのTBR細胞を対象となるものと考えられる。

(15)

したが、さらに試験の枠を広げた場合にはより生産性増強効果の高い rω導入・よ骨幅宿主細胞を作製できるものと考えられる。

第5節小f�

本章ではrasを予め導入・増幅したBHK細胞である TBR細胞においても、第9章のように組換えタンパク質を産生するBHK細胞にrωを導入・増幅した時と同様に組換えタンパク質の生産性を増強できることが不された。生産性増強効果は約15倍程度であり、第9章の方法と比較すると低いものであったが、これは実験対象となったTBR細胞のクローン数が少ないためであると考えられた。

(16)

第1 1章各格制1換えタンハク質の生産性に及ぼすrasガ、ン遺伝子の効果

第l節桁iす

前章までに検討してきたように、 hI L-6を組換えタンハク質の -例として使川してOAPシステムが組換えタンハク質高生産性動物細胞の

作製において有効であることを実証してきた。そこで本章ではOAPシステムが他の種類の組換えタンパク質を産生する場合にも適用できるかを hEPO、 hG-CSF、そして凶t1Abを用いて検討を行った。

第2節実験材料および}j法

第1項細胞椛養および遺伝f導入

BHK-21 および組換えBHK細胞は5% FBSを含むDMEMrt1で、 370C、 5%

CO2/95%空気の条件下で崎養を行った。遺伝f導入は高効率リン酸カルシウム共沈法により行った。遺伝子導入を含めた実験予]llftはFigure11-1 に示した。遺伝子導入後の細胞の選択はG418 (0.5 mg加1)および50 nM MTXを添加した5% dFBSIDMEM中で行った。なおG418選択は1週間で終f し、 MTXによる遺伝子増幅を引き続き10日間行った。

第2項 ELISA法による各種組換えタンパク質の定量

使用した各種組換えタンパク質、 hIL-6 、 hMAbAE6F4、 hMAbHB4C5 L鎖、

凶t1AbAE6F4 L鎖、 hEPOおよびhG-CSFの生産量の測定にはELI SA法を使用した。それぞれ使用した抗体の種類および入手先をTable 11-1に示した〉

EUSA法による各種組換えタンハク質定量に関しては第3章のhIL-6の EUSA法に准じて行った。

(17)

句。…

pSV2・bsr

(A)

BHK・21

Selection by Blasticidin S

+

。…

pCMVD-c-Ha-ras

p仰C釧M附附鵬…v叩ゆ伽恥Dひ恥恥川.屯+州cひ州.羽H陶a-郎

寸抄.. _ Ih刷l山

、 tISecreting rBHK

Selection by G418

Gene amplification by Methotrexate

Determination of Productivity Amount of Proteins: ELISA

Cell Number: Cell Counter

(8)

BHK・21

Figure 11イ.各種組換えタンパク質の生産性増強のための実験手111買

(A)組換えタンパク質生産細胞樹立後にrasを導入・増幅 (8) rasと組換えタンパク質発現プラスミドを共導入・増幅

(18)

Table11-1.各種組換えタンパク質のELISA用の抗体および標品

Protein Solid-phase antibody human IL-6 anti-IL-6

primary antibody anti-IL・6 (Biotinylated) MM

GEN

secondary antibody standard

human IgG anti-lgG

GP R&D GP TAG GP TAG

Streptavidin POD AMR GEN

anti-lgG GP-P

TAG GP-P TAG

DAK

human λchain anti-λ anti-λchain GEL

chain

human K chain anti""K GP

TAG anti""K chai n GP-P

TAG GEL

chain

「「QU ハUハUnH 内d

* nH DIHH GK 「「円。戸UハU+ft nH 免u「「QU FU ハunH 内dm 川U」け MM

Kirin食 anti Mouse IgG GP-P

TAG SIG R-AS ��: cnl"'\ MM � ��: U�..�� I�f"\ GP-P

human EPO anti-EPO Kirin合 anil-EPO

Kirin* anti Mouse igG

TAG BMY

Goat polyclonal antibody， mouse monoclonal antibody， goat polyclonal antibody POD conjugate， rabbit antisera and rabbit polyclonal antibody are abbreviated GP， MM， GP-P， R-AS and RP ， respectively (R&S， R & S systems; GEN， Genzyme; AMR， Amersham; DAK， DAKO; TAG， TAGO; GEL， Gel∞

Diagnostic; SIG， Sigma; BMY， Boehringer Mannheim Yamanouchi; BIO， BIO-RAD) Antibodies and standard proteins were purchased from the companies indicated in the table except Kirin合. The antibody or antisera labeled Kirin* were obtained from the Kirin Brewery CO. (Japan).

(19)

第3Jfl 形質転換細胞の各種組換えタンハク質生産性の測定

泣伝fを導入し薬剤j選択処理の後、 35mm培養器に細胞をまきこみ、

経時的に倍義上清lþの組換えタンパク質をELISA法により測定し、また細胞数をセルカウンターにより測定した。それら両者の値より細胞106

f同あたりの組換えタンハク質生産性を算出した。

第4項向中産性細胞のスクリーニング

hIL-6およびhEPOの形質転換細胞に関しては高生産性細胞のスクリーニングおよび組換えタンハク質生産性の測定を行った。 hIL-6高生産性細胞のスクリーニングはSCISA法により行った。 hEPO高生定性細胞のスクリーニングは96穴フレートを使用した限界希釈法によるクローニン

グとELISA法により行ったn

それぞれ得られたクローンは35mm塙養器に細胞をまきこみ、経H与的に培養U青中の組換えタンパク質をELISA法により測定し、また細胞数をセルカウンターにより測定し、細胞106倒あたりの組換えタンハク質

ー産性を算出した。

第3節結果

第1項 hIL-6、またはhMAb AE6F4を産牛ーしている組換えBHK細胞へのm、

導入による組換えタンパク質生産性の増強

hIL-6を産牛.している組換えBHK細胞であるBCI-8細胞(第9章参照)そして、フラスミドpCMVP-AE6F4HLを用いてBCI-8とlõ}織の手法で作製された、 BA6-16H1細胞(凶仏B AE6F4産牛�BHK細胞)にpCMVD-c-Ha-rasを導入し、薬剤による選択と遺伝子増幅の後、形質転換細胞集ト丹の組換えタンパク質生産性を測定した。 Table1ト2に示したように、 I両組換えタンパク質の生産性はmの導入によりそれぞれ約2倍程度増強されていた

(20)

Table11-2. h1L-6産生BCI-8細胞およびhMAb AE6F4産生 BA6- 16H1細胞にrasガン遺伝子を導入した時の組換えタンパク質生産性および相対生産性

Productivity (ng/106 cells/day) Relative productivity

Proteins Host Cells _(pCMVD)^Control (pCMVD・c-Ha-ras)^Test (Testlcontrol)

human Iし6 BCト8 (human Iし6

1090 2200 2.0

producing BHK-21)

human IgG (AE6F4) BA6-16H1 (AE6F4

104 232 2.2

producing BHK-21)

Table11-3. BHK-21細胞に各種レポータ-プラスミドとras ガン遺伝子を導入した時の組換えタンパク質生産性および相対生産性

Productivity (ng/106 cells/day) Relative productivity

Proteins Host Cells ^Control ^Test (Testlcontrol)

(pCMVD) (pCMVDゃHa-ras)

human IL-6 BHK-21 398 849 2.1

human IgG (AE6F4) BHK-21 99 166 1.7

human λchain (HB4C5) BHK-21 39 109 2.8

human K chain (AE6F4) BHK-21 35 34 1.0

human G-CSF BHK-21 646 799 1.2

human EPO BHK-21 3487 6562 1.9

(244 mU) (459 mU)

(21)

特に形質転換BCI-8細胞集団の生産性は約2 �lgl106細胞/Hの生産性をぶしていた3 この結果より、生産性のより高いクローンが集[寸|中に合まれていることが示唆された。一方実験で使用したAE6F4重鎖のcDNAはイムノグロプリンμ鎖由来のVHとCHl領域およびy鎖由来のC田とCH3領域が連結されたものである(Sekief 01.，未発表)。そのため天然型のイムノグロプリンy�nと比較した場合(Data not shown)、発現効率が低ドし、 hIL-6と比較して低い/主産性を示したのではないかと考えられた。

第2項 BHK-21細胞へのrasと各種組換えタンパク質の共導入による組

換えタンハク質生産性の増強

各種の制1換えタンハク質を発現するフラスミドとpCMVD-c-Ha-rasを BHK-21細胞へ共導入した。なおこの際、ベクターのみのpCMVDを pCMVD-c-Ha-rasの対照として使用したJ 薬剤による選択と遺伝f増幅の

後、形質転換細胞集同の組換えタンハク質生産性を測定した。ここでは示していないが、それぞれmの導入、非導入に関わらず組換え細胞の倍加時間に大きな差異は見られなかった。 Table 11-3に示したように、 hIL-6、凶r1AB AE6F4、 HB4C5 L鎖、そしてhEPOにおいて約2"-3惜の組換えタンハク質生産性の増強効果が見られた。しかしながら、 hG-CSFではわずかな性産性上昇のみが、そしてAE6F4 L鎖においては牛晶産性k昇効果は見られなかった。

第3項 hIL-6およびhEPO高生産性細胞クローンの組換えタンハク質/主

f司

産性の増強

第2項で遺伝子導入を行った細胞集同の中からhIL-6とhEPOに関して産性細胞の取得と牛産性測定を行った。その結果、 hIL-6および hEPOの双方に関してrω遺伝子を共導入し、増幅した方により高い生産性を示すクローンが出現した。 Table11-4に示したように、 hIL-6では対照に対して最大22倍程度の増強が見られた〉また阻，POに関しては増強

(22)

↑斉家は5十庁科!支であったが標準hEPOの比活性から換算した組換えタンハク質生産泣は36 �lg/106細胞/日という高い組換えタンハク質生産性を示すクローンを得ることができた。

Table 11-4. h1L-6およびEPOのスクリー二ング後の高生産性クローンの生産性

Clone Productivity Relative (μgl106 cells) Productivity

hlL・6 Control

BHK-IL6/CD#16 0.10 1.46

BHK-IL6/CD#17 0.04 0.54

Test

BHK-IL6/CD-R#4 0.58 8.85

BHK-IL6/CD・R#7 1.48 22.46

EPO Control

BHK-EPO/CD#1 9.96 1.26

(0.70 mU)

BHK圃EPO/CD#3 5.84 0.74

(0.41 mU)

Test

BHK-EPO/CD・R#4 36.34 4.60

(2.54 mU)

BHK圃EPO/CD・R#5 15.76 2.00

(1.10mU)

(23)

第4節与然

BCI-8細胞へ遺伝子増幅を伴わないrωを含めたガン遺伝f発現フラスミドの導入では安定な高坐産株を作製することはできなかった(Yano_ef

01.， 1995) しかしながら、第9章に前述したようにmの遺伝f増幅によ

り対照より35 倍高い生産性を示すhIL-6高生産性BHK細胞を作製することができた，本章ではまずhMA B AE6F4において聞の組換えタンハク質生産性増強効果の布無をAE6F4産生組換えBHK細胞を用いて検討した。

また、 pCMVD-c-Ha-rasがpCMV-c-Ha-rasとpSV2-dhfrの共導入に置き換えられるものであることをぶした(Table11-2)。加えて、一過性の発現実験に加え、異なった生産性を示すクローンを含んでいる細胞集団の生産性を

測定することにより、 /主産性増強効果の検討が行えることを心した。

そして第9章の結果と併せて、細胞集団中には当然ことながら集同の

、u均値としての生産性より高い値を示す高生産性クローンが含まれていることが期待された。

またBHK-21細胞に各穐組換えタンハク質を発現するプラスミドと、

pCMVD-c-Ha-rasを共導入することを検討した。対照[?<の値と比較したと

ころ、全ての組換えタンパク質生産性は|司等もしくは増強されることを示した。またhIL-6とhEPOに関しては最終的な高生産クローンの樹伝まで行い、その生産性が明らかに上昇していることを示した。ここで

ヒト型のイムノグロプリン軽鎖であるHB4C5 L鎖とAE6F4 L鎖の生産性増強効果の差が何に由来するかはわかっていないσぽuya ^et01.， 1995b))

本章の結果より、 BHK-21細胞においてmの遺伝子増幅はーー般的に CMVプロモーター制御下での組換えタンパク質の発現を増強すること

が示唆された。

第5節小括

本章ではOAPシステムのhIL-6以外の組換えタンハク質向性産性動物細胞株の作製における有効性を検討した。他の種類の組換えタンハク

(24)

質としてはhEPO、 hG-CSF、そしてhMAbを用いた。その結果、増強程度に差異が牛じることが示されたが、 BHK-21細胞におけるrωの遺伝子増幅はCMVプロモーターにより制御され、発現される組換えタンハク質の生産性を」般的に増強することが示唆された。

(25)

第1 2�f: nω明I隔BHK細胞における他の核内ガン遺伝子の'l:.産性への影響第l節絡r ⁱ

これまで、 m遺伝fを導入し、 50 nMMTχで遺伝f増幅を行うことにより、 CMVフロモーターの制御下でhILるなどの組換えタンハク質を'1:

広するBHK-21細胞の組換えタンパク質の坐産性を増強できることを見いだした。この方法では、短期間で対照の値に対して約35倍高い生産性をノ'J�すクローンを得ることができた(Yanoet al.， 1995)コ本章では、 ræ;;

を増幅した組換えBHK細胞への各種核内ガン遺伝子の効果について検討した。

第2節実験材料および方法

第l項細胞桁養および遺伝子導入

BHK-21およびBCI-8細胞は5% FBSを合むDMEM中で、 370C、 5% CO2/95%

空気の条件ドで培養を行った。 ros増幅BHK細胞(BRA細胞)を作製するためにpCMV-c-Ha-rasとpSV2-dhfrフラスミドをトランスフエクタム法によ

り、 BCI-8細胞に共導入した。遺伝子導入後、 50 nMMTX を添加した5%

dFBSゐ1EMα(ー)rf'で10日間の選択および遺伝子増幅を行った。樹立した BRMffi胞への核内ガン遺伝f発現フラスミドの導入は高効率1)ン般カ

ルシウム共沈法により行った。各種核内ガン遺伝子発現フラスミドを pSV2-hphと共導入した後の細胞の選択はハイグロマイシンB (0. 1 mg!ml) を添加した50 nMMTXを含む5% dFBS/D阻M巾で14日間行った。なお遺

伝子導入を含めた実験手順はFigure 12-1に示した。

第2項 hIL-6高生産性細胞の検出

各種核内ガン遺伝子を導入した後の形質転換細胞はトリフシン処用

(26)

ぺ::;::ftち)

Selection by Blasticidin S

+

HHh日

pCMV-c・h・.ras

-f....a"""" � 】

pSV2・dh介

十..

_一一 ^、，

I

ー ...hlL・6 Secreting

I rBHK

Gene amplification by Methotrexate

Determination of Productivity Amount of hlし6: ELISA Cell Number: WS下1 assa

Figure 12-1. 他の核内ガン遺伝子のras増幅BHK細胞における生産性

増強を検討するための実験手順

(27)

で細胞を分散した後、 90mm培養器に細胞を1^X103例ずつまきこみ、 6 _{r 1} 後にSCISAl.tによりh1L-6高生産性細胞の検出を行ったc

第3項形質転換細胞のhIL-6生産性の測定

SCISA法で検IHされた高生産性クローンの培養上清中に分泌された hIL-6量をELISA法で測定し、また細胞数をWST-1法で測定し、細胞106例あたりのhIL-6'i:_産性を算出した。

第3節結果

第1項目Aガン遺伝子によるhIL-6産牛ras増幅BHK細胞の生産性増強

E1A、fos、jun、 myb、そしてmycなどの核内ガン遺伝f発現フラスミドを単独で導入した場令、導入ガン遺伝fの遺伝子増幅の有無にかかわらず安定に高生産性を示すクローンは得られなかった。しかしながら、

あらかじめ仰を導入・増幅したBRA-5細胞においてこれら核内ガン遺伝子発現プラスミドを導入することで、 Figure 12-2に示したように、 E1A を導入したBRA-5細胞において、高い生産性を示すクローンが得られた。

このうち最も高い生産性を示したクローンは5.34 �lgl1 06細胞/nの生産性を示した。これはBRA-5細胞より1 0倍高く、 BRA-5細胞の直接の親株で

あるBCI-8細胞の坐産性と比較して55倍hIL-6生産性が増強されていたコ方他の核内ガン遺伝チ、 fos、jun、 myb、そしてmycなどの導入では hIL-6の生産性増強効果は見られなかった。

第4節考察

EIAはATFまたはSP-1を介して様々なフロモーターを活性化することが知られている(Richtぽ， 1989; Pei and Bぽk， 1989; Weintraub and以泡n， 1992)0 E1A

産物の転写活性化ドメインのジンクフインガー領域はTATAボックス結

(28)

。

Conrol

CMV

E1A

fos Jun myb

myc

。

hlし6 Productivity ω9

/106

cells/day)

2 3 4

10 20 30 40

Relative productivity

5

.・ .

•

50

6

60

Figure

12-2核内ガン遺伝子のras増幅BHK細胞における生産性への影響

合タンパク質と複合体を形成しウイルスや細胞のフロモーターを活性化できることが知られている(Geisberg ^et^01.，1994)。またEIAとrosは共[iíJで細胞の形質転換を引き起こすことも知られている (Boyd ^et^01.，1993)

CockettらはCHO細胞においてアデノウイルス5理由来のEIAがCMVフロモーターを活性化する事を報告しているが(Cockett ^et^01.，1990 ^&1991)、 BHK細

胞においてアデノウイルス12型のE1Aを使用した場令に同様の結果は得られなかった。

(29)

ノテ[r可使川した他の核内ガン遺伝子、fos、jun、 myb、そしてmycはヒラメリンハ球、またはヒト・ Tリンハ球の不死化においてその発現が確認されているため(Tamai êra1.，1993; Ôkanoêt^{a1. ，} 1993)、今同のE1A以外の十案内ガン遺伝�rの効果が見られなかったのは以下の点が理巾としてイ考え

られたっ

( 1 )αwフロモーター中の転写活性化肉子結合部位数の不足

(2 )αNプロモータ一中の転写活性化肉子結合部位の位置の不適当 (3)さらに1-_流のシグナル刺激の必要性

第5節小括

本章では、あらかじめrωを導入・増幅したBRA-5細胞へE1A遺伝f発現フラスミドを導入することで高い生産性を示すクローンが得られることをノIミした。最も高い生産性を示したクローンは5.34μgl106細胞/日の生産性をぶした。一方他の核内ガン遺伝子、fos、jun、 myb、そしてmyc などの導入ではBRA-5細胞のhIL-6の生産性増強効果は見られなかった。

(30)

第1 3市 tu\'lW幅BHK 細胞におけるCMVフロモーター活性化機構についての検討ー

第l節絡�1

これまで検付してきた結果、宿主細胞にBHK-21細胞をJHい、 raçを発現するフラスミドpCMV-c-Ha-rasをdhft遺伝子と50 nMMfXによる遺伝子噌幅を行った時、 CMVフロモーターによる組換えタンハク質の発現が増強されることが明らかとなった(Yan o et 01.， 1995; Teruya et 01.， 1995a)。またこの現象はEIAによりさらに組換えタンハク質の生産性が増強されることも示された(Shirahata et 01.， 1995)。本章ではこのraçおよびEIAのCMVプ

ロモーター活性化機構について検討を行った。

第2節実験材料および万法

第l項 αwプロモーター中の転写肉f結合部伎の検索

CMVプロモーター中の転写悶子結合部位の検索は、 Ghoshの作製した転写肉子データベース(第7版) (Ghosh， 1990， 1991a & 1991b)を用い、その

中からコンセンサス配列を抽出し検索に使用した(Table 13-1)。検宗はH 立の遺伝子解析ソフトDNASISの制限酵素切断部位検索機能を利用し、

制限酵素切断部位データファイルの形式にあわせた転写同子結令部位コンセンサス配列データファイjレを作製し検索を行った。なお転写肉子データベース(第7版)はNi食y-sぽveノてイオフォーラムのデータライブラリーより入手した。

第2項細胞培養、各陣薬剤処理および評価系

実験で使用したBHK-21細胞およびBC I-8細胞は5% FBSIDMEM中でよ庁長した。またBCI・8 ^vec.clone ²細胞、 BCI-8 ras clone節目胞、 BCI-8 ^rasclone 8細胞、

(31)

S陶Name Conse岡崎Sequence

AP・1 CS1 STGAC�

AP-1 CS3 TG1Ur.I!MA AP・1 CS4 TG，且S宝MA AP・2 CS1 TCCCCAKGCG AP旬2 CS2 CCCCAGGC AP・2 CS3 CCSCRGGC AP・2 CS4 YCSCOOI'SSS AP-2 CS5 GSSlfGSCC AP・2 CS6 CCCMNSSS AP・3 CS TG哩GGmnf AP-3 RS GGAAAG智CC AP-4 CS YCAGCTG官GG AP5・SV40 CTG哩GGAA哩G 且PP' CS RGTT�YKKCM AR CS AGAACAKKKTG佐官C宮 ARP-1 RS TG晶KCCC宮TGACCCCT An' CS1 GTGACG但MR ATP CS2 TGACGYMR ATP RS TGACG型 B1 CS AAARRGGAAR宜G BPV-E2 CS1 ACCG割前首KCGG空 BPV-E2 CS2 ACC貿前前首KKGGT BSAP CS GACGCAXYGR'HK前首YG c-Myb CS CM伺四

C/EBP CS T但G側棚田C.AAT C/EBP CS1 TXKKGYAAK C/EBP CS2 宮CK':rACTC C.AA冒-box.1 GGYC.AATC宜 CAAT-box.2 TTGGCKK首N1t'GCC.A CAMP RE TGACGTC.A CArG box CS cc:mnnnmGG CArG CS CCAltlI.TlflfGG CBP-1 CS TCACRTGATA cd elem・nt CS ATGCAAATKA

CP' 1 CS AKATGG

CP1 CS Y百羽賀前首剖RRCC.AATCAKYK CP2 CS YAGYKK羽RRCC.AATCKKKR CP2・y-P'BG AGCC.AC宮

CRE.1 CG智C.A

CRE.2 KlfCG司rCA

CREB CS ACG智C.A CREB CS TGACGTYlf

CREB-CMV CCC宮A宮型GACGTC.AATGA dc box.2 TKA官官官GC.AT dc e1・皿・nt CS TKA官官官GC.AT E-a X box CC宮AGC.AAC.AGA宝G E-a Y box TXCTGATTG空軍DCM E-box CS C.AGGTGGC

Table

13-1.転写因子結合部位コンセンサス配列

Site Name ConsensuI Sequence

E 1A-P' CS XGGAYG哩

E2A CS RCAG前':rG

E2A US ':rGGG晶.ATT E2BP CS TGC.AAYAY E2P' CS T官官官SSCGS E2P' CS.2 sCGSGAAAA E4P'1 CS ACG'lMAC EP'-1A CS JUO(GGA'IfGI%

EP'-C CS G哩TGCYHGRC.AAC EGR-1 CS CGCccsCGC enh&ncer cor・ GTGGmnfG Ets-1 CS SMGGAWGY P' SE ₂• 1 GAGAGGA GATA-1 CS 'lfGATAR GATA-1 CS 'lfGATAMS GC-box KJtGGCGKRRY

GCP' _CS _SCGSSSC

GR CS AGAJ\CAlOlN':rGT宮CT GRE _CS1 GG司rACAlOI'首宝G司rYCT GRE _CS2 YGG智lfCAMtt':rG虚YCT GRE CS 3 GGTACAlOI'前':rGT宮CT GRE _CS4 G前KACAAX首':rG哩YC宮 GRE _CS5 SGGTlfCAAKJf':rG司ryc宮 GRE _CS6 YGG智lfCA)(lfllJ':rGTYC哩 GRE CS7 lfC宮G制官CT GRE _CSS _AGA'HCAæf GRE(ー) ATYACKK前賢官GA宮ctf G哩-IIB/Pvu box C.AGCTGTGG H-APP'-1 RS CTGGRAA

H4TP2 CS GG虚宮CTCKKKKCGGTCCG HiKP'・A RS ATTTKKKKA官官官 HKP'-1 CS GTTAA宮前且雷TAAC E調"-1 CS2 RGTTAMTN前官官KKCM HKP'-3 CS TATTGA官官官WG HKP'・4 CS KGCW1RGKYCAY HKP'-5 CS TR宮T':rGY HKP'1-HP1 C現前首':rK首':rKATTG JDlP-1 CS GG智TAATKA宮TAMCA HSTP CB3 KGAAJnI'哩TC別留GAAK 1CP4 CB A宮CG哩CK苛前苛YCGRC 1CSbf CS AG型TTCKK官官官官 ICSBP CS YRGTTTCRYT官官官K Ig-dc.2 宮前且官官官GC.A宮 19/EBP1 CS 'HG剖ATTK':rGYAATR却':rKlf KJtOX2唖CS GCGSGGGCG LBP RS TAACGCCATTT LBP-1 RB 'HCTRG LP'-A1 RS TGRMCC

Site Name Cor融問UI S伺uence

LP'-B1 CS 宜GG哩TATlnf唱rc前首C.A MBP'-1 RS YTAAAAATAAY官官 MBP'-I CS TGCRCRC MEP'-2 CS YTAlQAATAR 路;r CS AK':rTC官官GG前且 MR CS AGAACAK首賢官GTTC型 MRE _CS3 C霊前官GCRCIICGGCCC

Myb CS YAACKG

国yc-PCP' CS RGAAAGGGR.R�

KP' -E 1 CS 1 MYWATClfY KP'-E1 CS2 GA宮AAG KP'-E2 cs 宮GAC哩C.AGC KP'-GMa CS GRGRTTXC.AY KP'-GCb CS 宮C.AGRTA KP'-IL6 CS TXKKG賞品.AJC KP'-IL6 RS AC.ATTGCA�CT KP'-S C自主G司rC.AGC KP'-Y CS TXCTGATTGGYn・4 KP'BX CS 宮GGAAlfSYIfGCCAAA KP'I CS1 TGGMN百羽賀KGCC.AA KP'工 CS2 TGGGMN普賢KKGCC.A KP'I CS3 TGG割前KKKKGCCA KP'I CS唖宮宮GGC宮前前KAGCC.AA KP'1 CS5 TCGNN前首KGCC.AA KP'1 CS6 YGGMN冒賀KKGCCA KP'1 CS7 YGGMN前首KKKGCC.AA KP'1-KP'I AGCC.AA哩 KP'KB CS 1 GGGRH宣言YKC KP'KB CS2 R<iGGRM!r宣言CC KP' KB CS3 GGGRA官官官CC KP'KB CS 4 GGGRK官官官C KP'KB CS5 GGG晶M!rKYCC KRP'-1 CS YGCGC.AYGCGCR oriP CS TAGC.ATATGC虫A p53 CS RRRcmfG'宣言宮 p53 RS AGGC.ATGCCT PEA1 CS TXAGTC.A PEA3 CS AGGAAR pit-1 CS 'H型且官官C.A宮

pit-1 CS TAK':rKC.ATKKl9'.rATKCAT PR _CS AGAACAKKKTG官官CT S1P' core RS CCCGTC SP1 CS3 GGGCGG Sp1 CS1 KGGGCGGRRY Sp1 CS2 GGGCGG Sp1 CS4 KJtGGαCRRK

SRE • 1 ATCYYATTlfTC':rGKTTGTA SRP' CS GATGTCClOIJOOllfGGAC.ATC

Site Name Consensul Sequence

邑Rl' _CS1 GATSBCClnO.T'HlfGGV SV40 pu-box CTG且AAG且GGAA SV40-core GTGG輔lflfGGTCCCC.A SV40-G聖1 GG司rGTGGAAAGT SV40-G聖11 GC宮G司rGGAATG哩 SV40-SPHI1 AAGTATGCAAAG T-antigen RS GAGGCC TAATGARAT TAATG且R.AT TATA-box-cs TATAW1lf 宮CP'-1 C S M>>IlI.G TCP'-2-a CS SAGGAAGY tf-LP' 1 CS ARYCTTTGACC宮C TGGC.A CS1 AKKKK':rGGC.AKK賢官GCC.AA topo1 RS AR.ACT哩AG且宮AAA'Hlf'H 宮R RS AGG但CAAGGTC.A 宮R-TRE1 宮C.AGGTC.ATGACC盟GA TR-TRE2 C.AGGGACG偲GACCGCA T宮P'-1 CS GNNC.ACTC.AAG UAS (G) -pSV3 CGGAGACTC宮CCTCCG uEBP-E CS TKKAKYKKICIIDIMnJATGA USP' CS GGSC.ACRTGAC v-Myb CS YAACKG

XPP'-1 RS CACCTGTCC官官官官CCC XRE _CS1 _CACGctf

XRE _CS2 GNNBMNG割前CKTK':rKCCGCW1

Base Code 7'able R: A/G

Y: C/7' S: C/G W: A/7' K: G/7' M: A/C B: C/G/7' V: A/C/G D: A/G/7' H: A/C/7' N: A/C/G/7'

(32)

TBR-3細胞、 TBR-17細胞、 TBR-18細胞およびTBR-19細胞は50nMMrXを合む5%dFBS!DMEMrt1で培養した。全ての細胞の培養は370C、 5% CO2/95%空気の条件ドで行った。

フロテインキナーゼ、C (PKC)を活性化することが広く知られているホルボールエステル、ホルボール-1 2-ミリスチン酸- 1 3 - アセテート (PMA) (Nishizuka， 1984; Angel ^eta1.， 1987)はGibcoより購入した。 PKCの阻害

剤、 H7およびHAI004 (Hiぬka ^eta1.， 1984; Kawamoto and Hi白ka，1984)は生化学

;業より購入した。フロテインキナーゼ、Aを活性化するジブチルcAMP (DBu-cAMP) (Katho-Semba ^eta1.， 1987)は生化学工業より購入した。アクチノマイシンDはSIGMAより購入した。これらをそれぞれ適当な溶媒を用

いて溶液とし実験に使用した。薬剤の評価系はそれぞれ結果と併せて

FigureI3-2，3にノ示した。ここではアクチノマイシンD処理による不可逆的

な転写問主を利用して薬剤処理の間の細胞内mRNA量の増加、つまり転写活性化を評価できるようにした。

第3項細胞内hIL-6およびRasガ、ンタンパク質の検出

BHK引細胞、 BCI-8細胞、そしてm増幅BCI-8細胞(ras clone 8)を1 6穴チャンパースライドグラス(lntぽMed， Denm紅k)の各穴に1，500個ずつまきこんだ。 2 4時間培養した後、 3.7%(w/v)ホルムアルデヒド/PBSを用い空温で 2 0分間処理し細胞を同定し、残ったホルムアjレデヒドを除くためO.IM グリシン/PBS(pH 7.4)で2同洗い(各1 5分間)、 PBSで1分間洗った。細胞

膜の透過性を上げるため冷エタノール(-200C)で1 5分間処理したM 細胞内hIL-6を検出するためマウスIgG(Zymed)処理を1時間行いブロッキングをした。 PBSで洗った後、ピオチン化マウス抗hIL-6抗体を加え、 3 7 0C で1時間インキュベートし、 PE標識ストレフトアピジン(Moleclular Probes Inc)処理を370Cで1時間行った。 Rasガンタンパク質の検出ではプロッキングをヒツジ血清(Rockland)で行い、ピオチン化ヒツジ抗Rasガンタンハク質抗血清で行い、 PE標識ストレプトアピジン処坪ーを行った。 PE標識細胞の検出は共焦点レーザ一生物顕微鏡(Mol^ecu1訂防namics)を用いて

(33)

行った〉

第4項 ras.t将中国BHK細胞のrωDNAコヒー数の測定

BHK-21細胞およびBHK由来各種組換え細胞のros DNAのコヒー数の測定はBIO-RADのスロットTE!ドットプロッテイング装置バイオドットS Fを使用したサザンゾロッテイング・ハイプリダイゼーション( Sambrook ef

a1.， 1989)により細胞中のm遺伝子の量を測定することで行った。細胞の全DNAの調製は a般に使用されている超遠心法(Sambrooket al.， 1989)により行った。プロッテイングにはAmershamのHybond N+を、またハイブ

リダイゼーションではAmぽshamのAP random prime DNA 1abe1ling and detection systemを別いて行った。

第3節結巣

第l項 CMVプロモーターの構造と関連する転写活性化同f

転写附子データベース(第7版)のコンセンサス配列によりCMVプロモーターの転写閃子結合部位を検索した。その結果をFigure13- 1に示した。その結果CMVプロモーターはCREB/ATF結合部位( Fink et a1.， 1988;

Sassone- Corsi， 1988)およびNF-KB(Gau1die et a1.， 1987; Leung and Nabe1， 1988;

Lenardo and Ba1timore， 1989a; Lenardo et a1.， 1989b; Ma1tぽand Gerber， 1989; Faisst and

Mey民1992)結合部位を共に4カ所ずつ持っていることがわかった。他に

はAP-1 (Lee ^eta1.， 1987 b; Faisst and Mey弘1992)、 AP-2(Mitchell et a1.， 1987; Imagawa

et a1.， 1987; Faisst and Mey民1992)、 Myb(Lüschぽand Eisenman， 1990; Faisst and Meyer， 1992)、 SP-1(町rnan and可ian，1985; Briggs et a1.， 1986; Faisst and Mey民 1992)、

そしてSRE(Tata， 1982)結令部位ををそれぞ、れ1カ所ずつ持っていることが明らかとなった。

(34)

CMV promoter/enhancer in pRc/CMV

CREB/ATF CREB/ATF CREB/ATF

S1E 吋 I I ^APJ1

^CREB/ATF

l W1SP11ず110

N

F

^{KB N}

�

^KB

nu rAU FO nu TAU 』『

₊₁

Transcriptional

Factor Sites

AP

・

¹

AP

・

²

CRE町'ATF myb NFKB SP-1 SRE TFIID

au nu qo nU

4・・ 4..

a品T qd qζ au qU 4E ヲ，

。。

nu au A『

内ζ 4E4・nUA品T nu A『auau

77602532

4En品TauT 4E

凋UT -Rd

・

Figure 13・1. CMVプロモーター・エンハンサーに結合する転写因子

第2項 BCI-8細胞へのPMAの効果

前

項

^の

結

^果^よ ^り ^CM^V^プロモ

^ー

^タ

^ー

^は⁴^つ^のNF

^-

^KB

結

^合

部

^位^を^合 ^ん^で^い

ることが示された。 Tリンパ球細胞へのrω導入がPKCを介してNF-KBの活性を上昇させるという知見(Baldari^efa1.， 1992a & 1992b)があり、そこで m導入・増幅BHK細胞においても、 rasがNF-KB活性をよ幹加させているのではないかと

考

^え

、

^仰^を^導^入して^い ^な^いB^CI

-

^8にPMA処^理^を

行

^う ^こと^で

過性のPKC活性化を誘導した。この項でのPMA処理はPMA-単独でPKC の活性化が生じる濃度で行った。 Figure 13-2に示したように、 BCI-8細胞においてPMA処理は組換えhIL-6の生産を約3倍に増強していた。しかしこのよ慢強値はrωの導入および遺伝子増幅時における20--30倍程度の明強(Yano êfâ1.， 1995; Teruya êf^01.， 1995a)には及ばず、 PKC活性化の不十分、

あるいは他の要同の関与が示唆されたJ

(35)

overnight

culture 6 h. 1 h.

|司 --，-- --r T-

PMA(付与 AMD

^(+，ー)

19 h.

�

Sampling

畠尋llA-1-

A-1--

Wash twice by PBS

Sample hIL・6 production (nglmり Relative Production PMA(ー) PMA(吋 [PMA(吋IPMA(ー)]

AMD (寸 AMD (+)

77.5 21.2

91.8 63.1

1.2 3.0 AMD， actinomycin 0; PMA， phorbol12・myristate13・acetate

Figure 13-2. BCト8細胞へのPMA処理の効果

第3項 PKC問書剤H7および:'pKA活性化剤DBu-cAMPの効果

PKC問書剤H7処理では対照としてH7のアナログでかつ阻害活性の弱いHA1004を使用した。 PKCの阻害剤H7の処理ではBHK6-1細胞のヰミ応性低下は10%程度であったのに対し、 BCI-8およびBCI-8 R8細胞では約、|三分程度まで生産性が低下していた。またBHK6-1、 BCI-8およびBCI-8 R8細胞において、細胞内のcAMPをk昇させPKAを活性化するDBu-cAMPの処理を行うとBCI-8細胞は生産性の変化はなく、 BHK6-1細胞は生産性の低ーが生じたが BCI-8 R8細胞においては生産性が約1.6桁L芥した(Figure 13-3)。

(36)

Sample

5 h. _{， hl} 24 h.

Sampling AMD

ELISA

Wash twice by PBS

Relative Production

Cell Line DBuぐAMP H7

BHK6-1 0.58 0.87

BC卜8 0.99 0.51

BCト8圃R8 1 .61 0.57

Figure 13・3. BHK6・1、 BC卜8および、BCI-8-R8細胞へのDBu-cAMP またはH7処理の効果

第4項細胞内hIL-6および、Rasガ、ンタンパク質の検出

hIL-6高坐産性のms導入・増幅BCI-8細胞(BCI-8 ms c10ne 8)内において hIL-6およびRasタンパク質が高発現しているかどうかを調べるために、

細胞内hIL-6とRasガンタンパク質を共焦点レーザ一生物顕微鏡を用いて検出した。 msガン遺伝子は膜結合タンパク質p21をコードしている。 ras clone 8はFigure 13-4に示したようにhIL-6およびRasの検出において両ノiとも強い蛍光シグナルを示しており、 hIL-6およびRasの細胞内発現レベルが上昇していることが証明された。

第5項 rω増幅BHK細胞のrωDNAコヒー数の測定

サザンプロッテイングの後、 600Cでハイブリダイゼーションを行い、

600Cで0.1 %SDSを含む1X、 0.5X、そして0.1X SSCを用いて各15分ずつ洗

(37)

A

BHK・21 BCト8 ^rasclone 8

B

BHK・21 BCト8 ^rasclone 8

Figure

13-4.共焦点レーザ一生物顕微鏡を用いた細胞内のh1L-6 (A)と

Rasタンパク質(8)の検出

(38)

いを行い、脱へのブロッキング、フロープDNAを際識したフjレオレセインを認識するわL休(アルカリフォスファターゼ標識)処.Ftlを行った。

0.3% Tween 20を合む100 mM Tris・Cl/300 ^mMNaC1 (pH 7.5) で1 0分間ずつ3 111} iJt いを行った後、空温で検出試薬処理を5分間行い、光シグナルをISO

3，000のホラロイドフィルムで検出したヲヒトの細胞1個あたりのDNA出

基数は6X109塩基対であることが知られている。そこでBHK細胞l 例あたりのDNA温基数を同じ量と仮定し、導入したms遺伝子のコヒー数を算出した(Figure 13-5)。その結果、 ras非導入の細胞の、おそらくは細胞

人身のものと与えられるrωのコピー数が約5----7コピーで、 rasを導入・増幅した細胞のコヒー数は約40 ---- 60 コヒーであり、約30 --- 50コヒ一

程度のrasが外来性のものとして考えられた。

第4節考察

マイトジェン刺激を受けたTリンハ球はその刺激を核に伝達しインターロイキンー2(IL-2)を発現する。その時にp21ms'ま刺激の伝達に関わっていることが知られている(Downw訂d et al.， 1990)。またホルボーjレエステルとカルシツムイオノフォアの共同作JUによりマイトジェン刺激と

同等の反応が見られることからPKCがこの刺激伝達に関わっているこ

とが示された(Truneh ^etal.，1985)0 一方でIL-2のプロモーター領域にNF-KB 結合部位が存在していることに注目し、活性型聞をTリンハ細胞に導入し、 NF-KB結合部位を持つレホータープラスミドの活性を調べた結果、活性型rω導入が NF-KB活性化を誘導していることがぶされた( Baldari

et al.， 1992b)。一方でCMVフロモータ- l�流部のエンハンサーはNF-KBに

より活性化されることが示されている(Sam bucetti ^etal.， 1989)(" これらの知見は本研究でぶされた聞を導入・増幅したBHK細胞での't:_定性噌強に

NF-KBが重要な位置を市めていることを示唆するものであったp

本章で検討-したようにPMAにBCI-8細胞のhIL-6生産性増強作用があり、

またPKCßfl 'l-:剤によりCMVプロモーターがSRo.フロモーターより強い1�1l 店を受けていたことから、 rωを導入・増幅したBHK細胞はrω発現上昇

(39)

Standard ras Copy Number Sample Copy Number

298.7 pgー争 72.3 BHK・21ー争 7.2

74.7悶ー争園田 _寸E・・ 18.1 BCI-8 _{____}_静 5.4

18.7 pg--. 4.5 ^vec2--. a-. 6.0

4.7 pg--. 1.1 ^{ras clone}6 --.・L _』園 59.3

1.2 pg--. 0.3 ^rasclone8 _--.Eb

圏

^41.5

ガン遺伝子導入による組換えタンパク質高発現動物 細胞株の育種

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository