博 士 （ 農 学 ） 鶴 田 剛 司
学 位 論 文 題 名
分 泌 型 IgA （ S ― IgA) に よ ル コ ー ト さ れ た 腸内細菌プロフんイルとS ―IgA が腸内細菌を コ ー トす る ことの免 疫学的意義 の解明
学位論文内容の要旨
S‑IgAは 哺乳動物の腸管管腔内に分泌される主要な免疫グロプリンである。S‑IgAの主な機 能として病原性細菌やウイルスに対する防御的機能が広く知られているが、常在性の腸内細菌 に対するS‑IgAの機能研究は少ない。
哺乳動 物の腸管 内には500種100兆個の腸内細菌が存在している。病原性細菌を認識する宿 主のレセプターであるToll like receptor (TLR)は病原微生物のLPS、フラジェリンおよびべプ チドグリカンといった菌体成分を介して炎症応答を誘導する。常在性腸内細菌はこれらの菌体 成分を発現しているにもかかわらず、宿主の炎症応答を誘導することなく宿主と共生している。
さらに、 病原微 生物の排除機能を持つS‑IgAが多量に（腸内細菌数の約107倍）腸管内に分泌 されているにもかかわらず、安定した腸内細菌叢が維持されている。これらの矛盾から、近年、
S―IgAが 腸 内 細菌 に 対 し て排 除 的機 能以外の 働きを している 可能性 が提起さ れている 。 健常成人の糞便中に存在する細菌はすべてではなくその一部（約45％）がS‐IgAにより覆わ れた（コートされた）状態で存在している。また、糞便中のS−IgAによルコートされた腸内細 菌の割合（S―IgAコート率）は炎症性腸疾患患者で上昇し、体重が減少することによって下降 することが報告されている。これらの報告からS￣IgAによる腸内細菌のコートは腸管粘膜免疫 及び宿主の代謝系に影響を与えていることが考えられる。しかし、S￣IgAによる腸内細菌のコ ートに関 する研 究は様々な生理状態においてS‐IgAコート率を測定するという研究に限定さ れており、S‐IgAにコートされた腸内細菌（S‐IgAコート細菌）に関する基礎的な情報は皆無 である。そこで第2章から第5章ではまずS‐IgAコート細菌に関する基礎的な情報を収集した。
さらに、S―IgAによる腸内細菌のコートの生体的意義を解明すべく、第6章においてS‐IgAが 腸内細菌の増殖に与えている影響を、第7章においてS―IgAによる腸内細菌のコートが宿主の 免疫系に与えている影響をそれぞれ検討した。
笠2童；搓々な動物種睦豊ける墨〓！g△ヨニヒ趨菌Q逍iヒ壁内金査
これまで、S＿IgAコート細菌の存在はヒトおよびマウスでしか報告されていない。そこで本章 では様々な動物種におけるSーIgAコート細菌の消化管内分布を検討すべく、マウス（2社のプ リーダーより購入したBalb/cおよびC57BL丿6マウス）、プタおよびウシの各消化管部位のS―IgA コート率を測定した。その結果、S‐IgAコート率は消化管部位間、動物種聞さらにはプリーダ ―1258ー
ー の 異 な る マ ウ ス 間 で 異 な っ て いた 。ま た、 このS‑IgAコ ー ト率 の違 いは 単純 に 消化 管内 に存 在 す るfree‑lgA（ 細 菌 に 結 合 せ ず 遊 離 し て い る IgA)量 に 依 存 し て し ゝ な か っ た 。 筮！童；ヒヒ及埜ヱ空 丞a)糞f更rp細菌をコートし てい墨IgA量Q定量
膨 大 な 量 のS‑IgAが 恒 常 的 に 腸管 内に 分 泌さ れて いる にも 関 わら ず、 全て では な く一 部の 腸内 細 菌 のみ がS‐IgAにコ ー トさ れて いる 。 この 矛盾 をも たら し てい る原 因と して ニ つの 可能 性が 考 え ら れ る 。 一 っ は 、1個 の 腸 内 細 菌 を コ ー ト し て い るIgA量が 多量 であ るた め に腸 管内 に産 生 さ れ て い るIgA量 で は 全 腸 内細 菌を コ ート する ため に不 十 分で ある 可能 性で あ り、 もう ーつ は 腸 内 細 菌 特 異 的 なIgAが 選 択的 に腸 内 細菌 をコ ート して い る可 能性 であ る。 こ れら の可 能性 を 検 証 す る た め に 、 第3章 で は 腸 内 細 菌 を コ ー ト し て い るIgA量 の定 量法 を確 立 し、 ヒ卜 およ び マ ウ ス の 糞 便 細 菌 を コ ー ト し てい るIgA量 を定 量し た。 そ の結 果、 ヒト およ び マウ スの 糞便 細 菌 を コ ー ト し て い るIgA量 は糞 便中 に 分泌 され てい るfree‐IgA量 の5％ 以下 で あっ た。 この 結 果 は 十 分 量 のIgAが 腸 管 内 に 存 在 し て い る に も 関 わ ら ず一 部の 腸 内細 菌（ ヒト ：29土7％、
マ ウ ス ：26土3％ ） の み が コ ート され て いる こと を示 して い る。 この こと からS―IgAは腸 内細 菌を細菌群選択的にコ ートしている可能性が示唆さ れた。
筵 ！ 童 ； 腸 璽 鹵 ！ 三 在 莚 壷 歪S〓 ！g△ 三 ニ ヒ 細 菌 の 細 菌 叢 撞 成 の 検 索 方 法 堕 捻 尅 ． SーIgAが 腸内 細菌 を細 菌 群選 択的 にコ ー トし てい る可 能性 を 検討 すべ く、 本章 で はS‐IgAがコ ー ト して いる 細菌 群の 検 索方 法を 確立 し 、ヒ トお よび マウ ス の糞 便中S，IgAコ ー ト細 菌の 細菌 叢構成を検討した。そ の結果、励fem6ロcfe′fロceロ8がその他の細菌群と比較してS―IgAにコート されやすく、BロcfピrD沈餠ケevD絶ぬグループおよびェロc細6甜ffmゴ伍陀ferDcDccWグループがS−IgA にコ ート さ れに くし ゝこ とが わ かっ た。 この 結果 は 第3章 で 示唆 され た常 在性腸内細菌がS−IgA に よ り 選 択 的 に コ ー ト さ れ て い る 可 能 性 を 強 く 支 持 す る も の で あ る と 考 え ら れ る 。 筮≦童；dニ腿！三在査 壷る墨：！呂△ヨニb麺菌の 性迭
本 章 では 第4章に おし ゝて 確立 し たS‐IgAコー ト細 菌 の免 疫染 色法 を 用い て、 第2章で 他の 消化 管 部 位よ りも 有意 に高 いS―IgAコ ート 率 を示 した マウ ス小 腸 内容 物中 のS‐IgAコ ート 細菌 を視 覚的 に確 認 した 。そ の結 果、 マ ウス 小腸 内容 物中 の ほと んど の細 菌 はS￣Igハ粘液複合体に 覆わ れ た 状 態 で 存 在 し て い た 。 こ の 現象 の意 義は 不明 で ある が、 第2章で 確認 され た マウ ス小 腸内 容物中のS‐IgAコート 率の高さと関係してレゝると 考えられる。
筮≦童；！g△埜腿鹵担 萱Q壇殖能壁皇墨量髮響
S‐IgA欠 損マ ウス にお い て腸 内細 菌が 過 剰に 増殖 する こと か らS．IgAが腸 内細 菌 の増 殖能 に影 響 を 与 え て い る 可 能 性 が 考 え ら れる が、 腸管 内に 分 泌さ れたIgAと細 菌を 共培 養 し、 細菌 の増 殖 能 に与 える 影響 を評 価 した 報告 はな い 。そ こで 、本 章で は マウ ス小 腸の 初代 培 養に より 得た IgAを 用 い てIgAが 細 菌 の 増 殖 能 に 与 え て い る 影 響 を 検討 し た。 その 結果 、マ ウ スの 消化 管よ り 単 離 し たEcD轟 お よ び ム 陀Mfenだ け で な く 、 マ ウ ス の 消 化 管 内 に 存 在 し な いEcD轟 の 増 殖 も促 進し た 。ま た、E．cDぬ はム 陀甜fe灯よ りもIgAによって増 殖がより促進されてしゝたこ とか らIgAに よ る 細 菌 増 殖 促 進 効 果 は 細 菌 種 に よ っ て 異 な っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 墓 2童 ； 墨 〓 ！ g△ t三 よ 塗 腿 内 錮 萱Qコ ー ト が 宿 主Q炎 症 座 筌 睦 豊 墨 墨 髪 饗 IgAに は 炎 症 の 抑 制 作 用 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る が 、IgAに よる 細菌 のコ ー トが 炎症 抑制 作 用 に 寄 与 し て い る か は 検 討 さ れ た こ と が な い 。 そ こ で 本 章 で は 加vf加 でIgAコー ト細 菌を
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作製(in vitroコート細菌）し、in vitroコート細菌をヒト結腸上皮細胞モデルであるCaco‑2細 胞と共培養することにより、IgAによる細菌のコートが上皮細胞の炎症応答にどのような影響 を与えているかを検討した。その結果、腸内細菌がIgAにコートされることにより炎症サイト カイ ンであるILー1pおよ びIL‐8の発現 が有意に 抑制された。この結果からIgAは腸内細菌 の炎症誘導性の菌体成分をコートすることにより腸内細菌に対する腸管上皮細胞の炎症応答 を抑制している可能性が示唆された。
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学位論文審査の要旨
主査 教授 原 博 副査 教授 浅野行蔵
副 査 特 任 教 授 矢 島 高 二 （ 創 成 研 究 機 構 ） 副査 准教授 石塚 敏
副査 講師 井上 亮（京都府立大学大学院）
学 位 論 文 題 名
分 泌 型 IgA （ S ― IgA) に よ ル コ ー ト さ れ た 腸内細菌プロフんイルとS ーIgA が腸内細菌を コー トす るこ との 免疫 学的 意義の解明
本 論 文 は 、93頁 か ら な る 和 論 文 で あ り 、 図16と 表4を 含 み 、 参 考 論 文5編 が 添 え ら れ て い る 。
S‑IgAは 哺 乳 動 物 の 腸 管 管 腔 内 に 分 泌 さ れ る 主 要 な 免 疫 グ ロ ブ リ ン で あ る 。S‑IgAの 主 な 機 能 と し て 病 原 性 細 菌 や ウ イ ル ス に 対 す る 防 御 的 機 能 が 広 く 知 ら れ て い る が 、 常 在 性 の 腸 内 細 菌 に 対 す るSーIgAの 機 能 研 究 は 少 な い 。
病 原 微 生 物 の 排 除 機 能 を 持 つS＿IgAが 多 量 に 腸 管 内 に 分 泌 さ れ て い る に も か か わ ら ず 、 1000種100兆 個 も の 腸 内 細 菌 が 宿 主 と 共 生 し て い る 。 こ の 矛 盾 か ら 、S．IgAが 腸 内 細 菌 に 対 し て 排 除 的 機 能 以 外 の 働 き を し て い る 可 能 性 が 提 起 さ れ て い る 。 健 常 成 人 の 糞 便 中 に 存 在 す る 細 菌 は す べ て で は な く そ の 一 部 がS‐IgAに よ り 覆 わ れ た （ コ ー ト さ れ た ） 状 態 で 存 在 し て い る 。S―IgAコ ー ト 細 菌 の 存 在 は ヒ ト お よ ぴ マ ウ ス で し か 報 告 さ れ て お ら ず 、S−IgAが 細 菌 種 特 異 的 あ る い は 非 特 異 的 に 腸 内 細 菌 に 結 合 し て い る か は 不 明 で あ る 。 そ こ で 本 研 究 で は ま ずS‐IgAコ ー ト 細 菌 に 関 す る 基 礎 的 な 情 報 を 収 集 し た 。 糞 便 中 のS‐IgAコ ー ト 率 （S―IgAに よ ル コ ー ト さ れ た 腸 内 細 菌 の 割 合 ） は 体 重 の 減 少 に 伴 う 菌 叢 構 成 の 大 幅 な 変 化 に よ っ て 下 降 し 、 炎 症 性 腸 疾 患 患 者 の 糞 便 で 上 昇 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 こ の 報 告 か らS‐IgAに よ る 腸 内 細 菌 の コ ー ト は 腸 内 細 菌 叢 構 成 及 ぴ 腸 管 粘 膜 免 疫 に 影 響 を 与 え て い る こ と が 考 え ら れ る 。 し か し 、S‐IgAに よ る 腸 内 細 菌 の コ ー ト が 腸 内 細 菌 側 お よ ぴ 宿 主 免 疫 系 に 与 え て い る 影 響 は 不 明 で あ る 。 こ れ を 検 討 す べ く 、IgAが 腸 内 細 菌 の 増 殖 に 与 え て い る 影 響 お よ びIgAに よ る 腸 内 細 菌 の コ ー ト が 宿 主 上 皮 細 胞 の 炎 症 応 答 に 与 え て い る 影 響 を そ れ ぞ れ 検 討 し て い る 。
1． S‑IgAコート細菌に関する基礎的な情報の収集
こ れ ま で 、S‑IgAコ ー ト 細 菌 の 存 在 は ヒ ト お よ び マ ウ ス で し か 報 告 さ れ て い な い 。 そ こ で 本 章 で は 様 々 な 動 物 種 に お け るS＿IgAコ ー ト 細 菌 の 消 化 管 内 分 布 を 検 討 す べ く 、 マ ウ ス （2 社 の ブ リ ー ダ ー よ り 購 入 し たBむb／cお よ びC57BL／6マ ウ ス ） 、 ブ タ お よ び ウ シ の 各消 化管 部 位 のS‐IgAコ ー ト 率 を 測 定 し て い る 。 そ の 結 果 、S‐IgAコ ー ト 率 は 消 化 管 部 位 間 、 動 物 種 間 さ ら に は ブ リ ー ダ ー の 異 な る マ ウ ス 間 で 異 な っ て い た 。 ま た 、 こ のS−IgAコ ー ト 率 の 違 い は 単 純 に 消 化 管 内 に 存 在 す るfree．IgA（ 細 菌 に 結 合 せ ず 遊 離 し て い るIgA） 量 に 依 存 し て い な か っ た 。 消 化 管 部 位 間 、 動 物 種 間 、 ま た は マ ウ ス ブ リ ー ダ ー 間 で 腸 内 細 菌 叢 構 成 が 異 な る こ と が 報 告 さ れ て い る こ と か ら 、S−IgAコ ー ト 率 は 腸 内 細 菌 叢 構 成 依 存 的 に 決 定 さ れ て い る 、 っ ま り 、S‐IgAは 腸 内 細 菌 を 細 菌 群 選 択 的 に コ ー ト し て い る 可 能 性 を 示 し た 。 次 に 、S‐IgA が コ ー ト し て い る 腸 内 細 菌 の 細 菌 グ ル ー プ の 検 索 方 法 を 確 立 し 、 ヒ ト 船 よ び マ ウ ス の 糞 便 中 S‐IgAコ ート 細 菌の 細菌 叢構 成が 検討 され た。 その 結果 、励 絶m6ロc絶 ′fロcPロPがその他の細菌 群 と 比 較 し てS＿IgAに コ ー ト さ れ や す く 、Bac胞 ′ 〇fぬ 卿 ′Pv〇 絶 〃 口 グ ル ー プ お よ び エロcめ6ロcfZん，鮑門絶′〇cDcc甜sグループがSーIgAにコートされにくいことがわかった。この結果 か ら も 常 在 性 腸 内 細 菌 がS−IgAに よ り 選 択 的 に コ ー ト さ れ て い る 可 能 性 を 示 し た 。
2． 腸 管 鹵IgA埜 腸 内 細 菌 の 増 殖 能 に 与 え る 影 響
S‑IgA欠 損 マ ウ ス に お い て 腸 内 細 菌 が 過 剰 に 増 殖 す る こ と か らS‑IgAが 腸 内 細 菌 の 増 殖 能 に 影 響 を 与 え て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る が 、 腸 管 内 に 分 泌 さ れ たIgAと 細 菌 を 共 培 養 し 、 細 菌 の 増 殖 能 に 与 え る 影 響 を 評 価 し た 報 告 は な い 。 そ こ で 、 本 章 で は マ ウ ス 小 腸 の 初 代 培 養 に よ り 得 たIgAを 用 い てIgAが 細 菌 の 増 殖 能 に 与 え て い る 影 響 が 検 討 さ れ た 。 そ の 結 果 、 マ ウ ス の 消 化 管 よ り 単 離 し たE coliお よ ぴ ムreuterfだ け で な く 、 マ ウ ス の 消 化 管 内 に 存 在 し な いE coliの 増 殖 は 阻 害 さ れ ず 、 む し ろ 増 殖 を 促 進 す る 傾 向 が 見 ら れ た 。 こ の 結 果 か ら 、 腸 管 内 に 産 生 さ れ たIgAは 常 在 菌 の 増 殖 に 影 響 を 与 え て い な い 可 能 性 が 示 さ れ た 。
3． IgA三 よ る 腸 内 細 菌 の コ ー ト が 宿 主 の 炎 症 応 答 に 与 え る 影 響 IgAに は 炎 症 の 抑 制 作 用 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る が 、IgAに よ る 細 菌 の コ ー ト が 炎 症 抑 制 作 用 に 寄 与 し て い る か は 検 討 さ れ た こ と が な い 。 そ こ で 本 章 で はin vitroでIgAコ ー ト 細 菌 を 作 製 （ 加vitroコ ー ト 細 菌 ） し 、 加vitroコ ー ト 細 菌 を ヒ ト 結 腸 上 皮 細 胞 モ デ ル で あ る Caco‑2細 胞 と 共 培 養 す る こ と に よ り 、IgAに よ る 細 菌 の コ ー ト が 上 皮 細 胞 の 炎 症 応 答 に ど の よ う た 影 響 を 与 え て い る か が 検 討 さ れ た 。 そ の 結 果 、 腸 内 細 菌 がIgAに コ ー ト さ れ る こ と に よ り 炎 症 サ イ ト カ イ ン で あ るIL‑ipお よ びIL‑8の 発 現 が 有 意 に 抑 制 さ れ た 。 こ の 結 果 か ら IgAは 腸 内 細 菌 の 炎 症 誘 導 性 の 菌 体 成 分 を コ ー ト す る こ と に よ り 腸 内 細 菌 に 対 す る 腸 管 上 皮 細 胞 の 炎 症 応 答 を 抑 制 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、 鶴 田 剛 司 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た 。
