博 士 （ 歯 学 ） 詫 間 滋
学位 論文 題名
Effect of neonatal capsalClntreatmentonneuralaCtiVity inthemedullarydorSalhornofneonatalratSeVOked
byeleCtriCalStinlulationtothetrigen11nalaf［ ・erentS： anoptiCal， eleCtrophySiologiCal， andquantitatiVeStudy
（幼若ラット三叉神経求心路電気刺激により三叉神経脊髄路核尾側亜核内に 惹 起 さ れ る 神 経 活 動 に 対 し て 新 生 仔Capsaicin処 理 の 及 ぼ す 影 響 ： 光学 的、 電気 生理 学的 、数 量的 研究 ）
学位論文内容の要旨
三叉神経脊髄路核尾側亜核（延髄後角）は口腔顔面領域における侵害情報伝達の一次中 継核として機能し、一次求心線維を介した痛みの情報はここで二次ニューロンへと伝達される。
無髄求心線維を介した入カやグルタミン酸受容体が、Wind‑upやLTPといった一次中継核に おける可塑的変化に深く関わることが微小電極を用いた手法によって示唆されており、三叉神 経脊髄路核尾側亜核においても同様にこれらの可塑的変化が報告されている。しかし、これま での単一微小電極を用いた電気生理学的な研究手法では、細胞集団として機能する神経核 の活動を広範囲にわたって同時記録することは極めて困難である。近年、これを補完するもの として膜電位感受性色素を用いた光学測定の手法が中枢神経系の様々な領域で用いられる ようになってきたが、三叉神経脊髄路核に関しては哺乳類の生後動物での報告は今のところ 見当たらない。一方、無髄線維の永続的な脱落を引き起こす新生仔Capsaicin処理は侵害情 報伝達機構の研究に広く用いられており、組織学的にはCapsaicin処理後数十分後から後根 神経節もしくは三叉神経節のB細胞に形態学的変化を生じることが報告されているが、処理後 数日の間に侵害情報伝達の一次中継核を対象とした電気生理学的実験に用いた報告は数少 なく、侵害情報伝達系における短期的な機能的変化の有無については十分明らかにはされて いない。以上のような背景を踏まえ本研究は、無髄求心線維を介して幼若ラット三叉神経脊 髄路 核尾 側亜 核に 惹起 され るシナ プス伝達において、NMDA型、非NMDA型グルタミン酸受 容体のいずれが主要な役割を果たしているかを明らかにし、さらに新生仔Capsaicin処理後数 日での尾側亜核内神経伝達における機能的変化について検討することを目的として、電位感 受性色素を用いた光学記録および電場電位同時記録を行った。また、新生仔Capsaicin処理 に よ る 三 叉 神 経 根 の 形 態 的 変 化 を 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 を 用 い て 検 証 し た 。
5−7日 齢Wisterラ ット から 摘出 し た脳 幹よ り水 平断 スラ イス 標本 （厚 さ400pm)ない し傍 矢 状 断 ブ ロ ッ ク 標 本 を4℃Krebs標 準 液(NaCl 128，KC1 1.7，KH2P04 1.24，MgS04 1.3，CaCl2 2.4，NaHC03 26，glucose lO(mM)，pH7.4)下 に 作 成 し 、 電 位 感 受 性 色 素RH482ま た は RH795で 染色 した 。三 叉神 経脊髄路（水平断スライス 標本）もしくは三叉神経根（傍矢状断ブロ ッ ク標 本） をそ れぞ れ 幅O.lms、強 度0.5mAも しく は5．OmAにて電気刺激することにより尾側亜 核 に惹起きれる光学応答をDeltaronー1700システムに て0．6ミリ秒毎に記録し、ガラス微小電極 を 用 い た 電 場 電 位同 時記 録を 行っ た 。標 準液 、低Mg゜ ＋灌 流液 、非NMDA型グ ルタ ミン 酸受 容 体遮断薬6−cyanoー7―nitro−quinoxaline−2，3ーdione（CNQX）投与、NMDA型グルタミン酸受容 体 遮断 薬DL−2一amino−5―phosphonovalericacid（AP5）投与の各条件下における記録を比較 検討した。 さらに、生後2日および3日後の2度にわたってCapsaicin（8ーmethyトN−vanyllyト6ー nonnenamide）50mgを皮下 投与（新生仔Capsaicin処理 ）した幼若ラットより作成した標本から記 録 し た 光 学 シ グ ナ ル をNomal標 本 の 記 録 と 比 較し た。 また 透過 型電 子顕 微鏡 写真 より 三叉 神 経 根に おけ る無 髄線 維 数／ 有髄 線維 数、 およ ぴ無 髄線 維数 ／Schwanncellsubunitsを対照群、
Capsaicin処理群について算出し、比較 検討した。
水平 断ス ライ ス標 本 にお いて は脊 髄路 電気 刺激 （刺 激幅0．1ms、強度0．5mA）後、光学シグ ナ ルは まず 刺激 部位 近 傍に0．．6msec以内の潜時をもって起こり、引き続き同部 位より約500皿 m内 側 に 進 ん だ 後 、 刺 激 か ら 約4msecの 潜 時 を も っ て 吻 尾 側 に 広 が っ た 後 約200ミ リ 秒 間 持 続した。一 方、傍矢状断ブロック標本では、三叉神経根電気刺激（ 刺激幅O．lms、強度5．01nA） 後 、 光 学 シ グ ナ ルは 約8msecの 潜時 をも って 吻側 に起 こり 、約4msecの問 に尾 側へ 至っ た後 、 ス ライ ス標 本と 同様 に 約200ミ リ秒 間持 続し た。 光 学シ グナ ルの 強さ は通 常尾 側の方が吻側に 比 較 し て よ り 大 き く 、 長 持 続 性 の 応 答 は 尾 側 領 域 に 観 察 さ れ る 傾 向 に あ っ た 。 尾 側 亜 核 に お け る 光 学 シ グ ナ ル は 短 潜 時 高 振 幅 の 速 成 分 と そ れ に 引 き続 く長 持続 性の 遅 成 分 と か ら 構 成 さ れ 、 同 一 標 本 に お い て 同 時に 記録 した 電場 電 位d頭似 の時 空間 特性 を示 し た 。 速 成 分 は 非NMDA型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 遮 断 薬CNQX（10皿M） に よ り 消 失 し 、 遅 成 分 は 低Mず 十 灌 流 液 下 で 著 明 に 増 強 し 、 ま たNMDA型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 遮 断 薬AP5（30弘M） で 著 し く 減 少 し た 。そ れに 対し て刺 激 部位 近傍 の光 学シ グナ ルは 極め て潜 時の 短い 一過 性の 成 分 の み か ら な り 、 低Mヂ 十 灌 流 液 お よ びCNQX、AP5投 与 の 各 条 件 下 に お いて 著明 な変 化を 認 め なか った 。一 方、Capsaicin前処理ラットから作成 した標本では、脊髄路核尾側亜核の光学シ グ ナ ル に お い て 遅 成 分 が 著 明 に 減 弱 し 、 対 照群 でAP5を投 与し た場 合と 極め て類 似し た時 間 経 過を 示し た。 電子 顕 微鏡 学的 検討 では 、同 日齢Capsaicin前処 理ラ ット 三叉 神経根において 無 髄 線 維 数 ／ 有 髄 線 維 数 、 お よ び 無 髄 線 維 数 ／Schwanncellsubunitsの 値 に 有 意 な 減 少 が 確認された 。
従 っ て 、 三 叉 神 経 一 次 求 心 線 維 を 介 し て 三 叉 神 経 脊 髄 路 核 尾 側 亜 核 に惹 起さ れる 神経 活 動 は 、 速 成 分 に は 非NMDA型 受 容 体 、 遅 成 分 に はNMDA型 受 容 体 を 介 し た 伝 達 が 深 く 関 与 す ることが示され、特に無髄求心線維を介した入カは 後者に深く関与していること、さらに新生 仔Capsaicin処 理 後 数 日 以 内 に 、 脊 髄 路 核 内 の 神 経 伝 達 に お い て 機 能 的 な 変 化 が 既 に 生 じ
ていることが間接的に示唆された。三叉神経脊髄路核は吻尾方向に長い構造であり、一次求 心 線維から の入カは三叉神経脊髄路を吻側から尾側ヘ進みながら各レベルで脊髄路核に入 カするという解剖学的特性から、三叉神経脊髄路核に脊髄後角を対象とした研究に用いられ るような冠状断スライスを適用することは困難である。本研究で用いた標本ならぴに実験手法 は、対象が発育途上の幼若動物であることを考慮する必要はあるが、三叉神経脊髄路核にお ける侵害情報伝達を検索する際の有用な手段と成り得るものと考えられる。さらに、単一ニュー ロンを対象とした微小電極を用いた電気生理学的手法をこれに組み合わせることにより、より詳 細な情報が得られる可能性があるものと思われる。
学位論文審査の要旨
学位論 文題名
Effect of neonatal capsalClntreatmentonneuralaCtiVity inthemedullarydorSalhornofneonatalratSeVOked
byeleCtriCalStimulationtothetrigemlnalafE・ erentS： anoptiCal， eleCtrophySiologiCal， andquantitatiVeStudy
（幼若 ラット三叉 神経求心 路電気刺 激により三叉神経脊髄路核尾側亜核内に
惹 起 さ れ る 神 経 活 動 に 対 し て 新 生 仔Capsaicin処 理の 及 ぼす 影 響 ： 光学的 、電気生理 学的、数 量的研究 ）
審査 は，赤池 ，福島お よび脇田 の各審査担当者が学位申請者に対して提出論文の内容 なら びにそれ に関連す る事項に っいて口頭試問により行った．はじめに学位申請者が本 研究を構想した経緯，本研究に関連する歴史的背景，本研究の目的・材料と方法・結果・
考察 ，および 今後の研 究の展望 などを説明した後，提出論文の内容ならびにそれに関連 する事項にっいて試問した・
三叉神経脊髄路核尾側亜核（延髄後角）は口腔顔面領域における侵害情報伝達の一次中 継核として機能し，一次求心線維を介した痛みの情報はここで二次ニューロンヘと伝達される．
無髄求心線維を介した入カやグルタミン酸受容体が，Wind一upやLTPといった一次中継核に おける可塑的変化に深く関わることが微小電極を用いた手法によって示唆されており，三又神 経脊髄路核尾側亜核においても同様にこれらの可塑的変化が報告されている．しかし，これま での単一微小電極を用いた電気生理学的な研究手法では，細胞集団として機能する神経核 の活動を広範囲にわたって同時記録することは極めて困難である．近年，これを補完するもの として膜電位感受性色素を用いた光学測定の手法が中枢神経系の様々な領域で用いられる ようになってきたが，三叉神経脊髄路核に関しては哺乳類の生後動物での報告は今のところ 見当たらなぃ．一方，無髄線維の永統的な脱落を引き起こす新生仔Capsaicin処理は侵害情 報伝達機構の研究に広く用いられているが，処理後数日の間に侵害情報伝達の一次中継核 を対象とした電気生理学的実験に用いた報告は数少なく，侵害情報伝達系における短期的な 機能的変化の有無については十分明らかにはされていない．
以上のような背景を踏まえ学位申請者は，無髄求心線維を介して幼若ラット三叉神経脊髄 路核 尾側亜核 に惹起さ れるシナ プス伝達 において，NMDA型，非NMDA型グルタミン酸受容
忠 昭
稔
和
池 島
田
赤 福
脇
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
体 のい ずれ が主 要な 役割 を果 たし てい るか を明らかにし，さらに新生仔Capsaicin処理後数日 で の尾 側亜 核内 神経 伝達 にお ける 機能 的変 化に っい て検 討 する こと を目的として，電位感受 性 色素 を用 いた 光学 記録 およ ぴ電 場電 位同 時記録を行った．まナこ 新生仔Capsaicin処理に よ る 三 叉 神 経 根 の 形 態 的 変 化 を 透 過 型 電 子 顕 微 鏡 を 用 い て 検 証 し た ． 5−7日齢Wisterラ ット から 摘出 した 脳幹 より水平断スライス標本（厚さ400ルm)ないし傍矢 状 断 ブ ロ ッ ク 標 本 を4℃Krebs標 準 液 下 に 作 成 し ， 電 位 感 受 性 色 素RH482ま た はRH795で 染色した．三叉神経脊髄路（水平断スライス標本）もしくは三叉神経根（傍矢状断ブロック標本）
を電気刺激することにより尾 側亜核に惹起される光学応答をDeltaron−1700システムにて0．6ミ リ秒毎に記録し，ガラス微小 電極を用いた電場電位同時記録を行った．低Mg2゛やグルタミン酸 受 容体 遮断 薬投 与の 各条 件下 にお ける 記録 を比較検討し，さらに新生仔Capsaicin処理ヲット
（ 生後2日 およ ぴ3日 後の2度 に わた ってCapsaicin 50mgを皮下投 与）より作成した標本から記 録 した 光学 シグ ナル をNormal標本 の記 録と 比較 した ．ま た 透過 型電 子顕微鏡写真より三叉神 経 根 に お け る 無 髄 線 維 数 ／ 有 髄 線維 数， およ ぴ無 髄線 維数7Schwann cell subunitsを対 照 群，Capsaicin処理群について算出し，比較検討した．
尾 側 亜 核 に お け る 光 学 シ グ ナ ルは 短潜 時高 振幅 の速 成分 と それ に引 き続 く長 持続 性の 遅 成 分と から 構成 され ，同 一標 本に おい て同 時に 記録 した 電 場電 位と 類似の時空間特性を示し た ． 速 成 分 は 非NMDA型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 遮 断 薬CNTQX (10ルM)によ り消 失し ，遅 成分 は 低Mg2+灌 流 液 下 で 著 明 に 増 強 し ， ま たNMDA型 グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 遮 断 薬AP5 (30ルM)で 著 しく 減少 した ．そ れに 対し て刺 激部 位近 傍の 光学 シグ ナ ルは 極め て潜時の短い一過性の成 分 の み か ら な り ， 低Mg2+灌 流 液 お よ びCNQX，AP5投 与 の 各 条 件下 にお いて 著明 な変 化を 認 めなかった．一方，Capsaicin前処理ラットから作成した 標本では，脊髄路核尾側亜核の光学シ グ ナ ルに おい て遅 成分 が著 明に 減 弱し ，対 照群 でAP5を 投与 し た場 合と 極め て類 似し た時 間 経 過を 示し た． 電子 顕微 鏡学 的検 討で は， 同日齢Capsaicin前処 理ラット三叉神経根において 無 髄 線 維 数 ／ 有 髄 線 維 数 ， お よ び無 髄線 維数/Schwann cell subunitsの値 に有 意な 減少 が 確認された．
従 っ て ， 三 叉 神 経 一 次 求 心 線 維を 介し て三 叉神 経脊 髄路 核 尾側 亜核 に惹 起さ れる 神経 活 動 は ， 速 成 分 に は 非NMDA型 受 容 体 ， 遅 成 分 に はNMDA型 受 容 体 を 介 し た 伝 達 が 深 く 関 与 することが示され，特に無髄 求心線維を介した入カは後者に深く関与していること，さらに新生 仔Capsaicin処 理 後 数 日 以 内 に ， 脊 髄 路 核 内 の 神 経 伝 達 に お いて 機能 的な 変化 が既 に生 じ ていることが示唆された．
以 上 の よ う な 概 要 説 明 が な さ れ た 後 ， 審 査 担 当 者 よ り 論 文 内 容 お よ び そ の関 連事 項，
す な わ ち 電 気 刺 激 等 の 実 験 条 件 ， 単 一 微 小 電 極 に よ る 電 気 生 理 学 的 手 法 と 光学 記録 法の 相 違 点 ， 侵 害 受 容 系 に お け る グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 の 役 割 ， 新 生 仔Capsaicin処 理 の 具 体 的 手 法 な ら び に 電 頭 を 用 い た 数 量 的 検 討 の 妥 当 性 な ど に つ い て 種 々 の 試 問 がな され た‐
学 位 申 請 者 は こ れ ら の 質 疑 に 対 し て 明 快 か つ 適 切 な 説 明 を も っ て 回 答 し ， 本研 究に 関連 す る 事 項 の み な ら ず ， 専 門 お よ び 関 連 領 域 に つ い て も 十 分 な 学 識 と 理 解 を 有し てい るこ と が 認 め ら れ た ． ま た 本 研 究 は 三 叉 神 経 脊 髄 路 核 尾 側 亜 核 に 惹 起 さ れ る 神 経活 動に 対す る グ ル タ ミ ン 酸 受 容 体 ， お よ び 無 髄 求 心 線 維 入 カ の 関 与 を 多 角 的 ， 総 合 的 に検 討し てお り ， 今 後 の 発 展 性 も 期 待 で き る ． 特 に 本 研 究 で 採 用 し た 傍 矢 状 断 ブ ロ ッ ク ，水 平断 スラ イ ス の 両 標 本 を 用 い た 光 学 記 録 法 は 脊 髄 路 核 の 解 剖 学 的 形 態 を 考 慮 し た も ので あり ，尾 側 亜 核 に お け る 可 塑 的 変 化 の 記 録 等 ， 今 後 さ ら に 発 展 し て ゆ く 可 能 性 が 高 いと 思わ れ，
三 叉 神 経 領 域 に お け る 侵 害 受 容 系 の 研 究 に 大 き く 寄 与 す る こ と が 期 待 で き る と 認 め ら れ た 。
以上より，主査ならびに副査は，本研究論文が学位論文として認められ，本学位申請 者は博士（歯学）の学位を授与されるに値すると認定した．
