35 食用動物における動物用抗菌薬の使用状況の調査結果について 実験材料及び方法 1 被検物質は 製剤 1g 中イソプロチオランとして 250mg 含有する顆粒剤であるフジックス ( 日本農薬 ( 株 ) 製 製造番号 : B6512) を用いた 2 試験方法 (1) 供試動物ホルスタイン種の牛 (

〔技術資料〕

牛 に イ ソ プ ロ チ オ ラ ン 製 剤 を 飼 料 添 加 投 与 後 の 残 留 確 認 試 験

小 池 （ 浜 本 ） 好 子 、 臼 井

優 、 峯 戸 松 勝 秀 、

１ １ １

下 山

晃 、 園 部 研 一 、 飯 塚 智 美

（平成 年１月 日受付、平成 年４月７日受理）21 30 21

〔

TECHNICAL REPORT

〕

A Residue Determination Test of Isoprothiolane-added Cattle Feed Additive

Koko Koike-Hamamoto, Masaru Usui, Katsuhide Minetomatsu,

１ １ １

Akira Shimoyama , Kenichi Sonobe , Tomomi Iizuka

National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries 1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511, Japan

(Received: 30th January 2009; Accepted: 18th June 2009)

A feed additive which contained isoprothiolane as an active ingredient was added to a cattle feed at the highest approved level and was continuously administered to three cows for four weeks. After a 14 day withdrawal period, the cows were sacrificed and quantitative analyses of isoprothiolane concentration in fat, the liver and small intestines were carried out by GC-MS/MS.

イ ソ プ ロ チ オ ラ ン を 有 効 成 分 と す る 飼 料 添 加 剤 を 、 承 認 さ れ た 用 法 及 び 用 量 の 最 高 用 量 と な る よ う に 飼 料 に 添 加 し 、 ３ 頭 の 牛 に ４ 週 間 連 続 投 与 し た 。 こ れ ら の 牛 を 使 用 禁 止 期 間 （14 日 間 ） 経 過 後 に 屠 殺 採 材 し 、 脂 肪 、 肝 臓 及 び 小 腸 の 中 の イ ソ プ ロ チ オ ラ ン 濃 度 を 質 量 分 析 装 置 付 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （GC/MS/MS） を 用 い て 測 定 し た 。 緒 言 こ の 試 験 の 目 的 は 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン を 有 効 成 分 と す る 飼 料 添 加 剤 の 使 用 基 準 の 妥 当 性 を 確 認 す る こ と で あ る 。 暫 定 残 留 基 準 値 （ 暫 定 Ｍ Ｒ Ｌ ） が 設 定 さ れ て い る 成 分 で あ る が 、 当 該 成 分 の 使 用 基 準 作 成 時 に は 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン の 牛 へ の 強 制 経 口 投 与 で の 残 留 試 験 の 結 果 し か な か っ た た め 、 本 試 験 を 実 施 し た 。 本 試 験 で は 、 ３ 頭 の 牛 に イ ソ プ ロ チ オ ラ （ 財 ） 日 本 冷 凍 食 品 検 査 協 会 １

Japan Frozen Foods Inspection Corporation

ン を 有 効 成 分 と す る 飼 料 添 加 剤 を 、 使 用 基 準 の 用 法 及 び 用 量 の 最 高 用 量 と な る よ う に 飼 料 に 添 加 し 、 承 認 さ れ て い る 最 長 投 与 期 間 で あ る ４ 週 間 の 連 続 投 与 を 行 っ た 。 投 与 終 了 か ら 使 用 禁 止 期 間 （14 日 間 ） 経 過 後 に こ れ ら の 牛 を 屠 殺 採 材 し 、 臓 器 ・ 組 織 中 の イ ソ プ ロ チ オ ラ ン 濃 度 を 質 量 分 析 装 置 付 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （GC/MS/MS） を 用 い て 測 定 し た 。 臓 器 ・ 組 織 と し て は 、 牛 へ の 強 制 経 口 投 与 に よ る 残 留 試 験 の デ ー タ か ら イ ソ プ ロ チ オ ラ ン が 最 も 多 く 残 留 す る こ と が 想 定 さ れ る 肝 臓 及 び 脂 肪 の 他 、 そ の 他 の 内 臓 と し て 小 腸 を 選 択 し た 。

実 験 材 料 及 び 方 法 被 検 物 質 は 、 製 剤 １ ｇ 中 イ ソ プ ロ チ オ １ ラ ン と し て 250mg 含 有 す る 顆 粒 剤 で あ る フ ジ ッ ク ス （ 日 本 農 薬 （ 株 ） 製 、 製 造 番 号 ：B6512） を 用 い た 。 試 験 方 法 ２ （ １ ） 供 試 動 物 （ 、 ホ ル ス タ イ ン 種 の 牛 雄 ２ 頭 雌 １ 頭 導 入 時 体 重 73 ～ 120 ｋ g） を 室 温 で 飼 育 し た （20 日 間 。 馴 化 期 間 中 は 、 濃 厚 飼） 料 及 び ヘ イ キ ュ ー ブ を ２ 回 日 給 餌 し 、/ 。 、 自 由 飲 水 と し た 休 薬 期 間 中 に お い て は 馴 化 期 間 と 同 様 に 飼 育 し た 。 コ ン ト ロ ー ル （ 無 投 薬 の 臓 器 ・ 組 織 ） は 、 動 物 医 薬 品 検 査 所 に お い て 投 与 群 と 同 様 に 飼 育 し た 牛 か ら 別 途 採 材 し た 。 （ ２ ） 投 薬 量 及 び 投 薬 方 法 薬 剤 は 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン と し て と な る よ う に 濃 厚 飼 料 に 混 合 50mg/kgBW し 、 朝 ９ 時 に 投 薬 し た 。 牛 が 薬 剤 を 添 加 し た 濃 厚 飼 料 を 全 て 食 べ 終 え た 後 、 ヘ イ キ ュ ー ブ を 与 え た 。 水 は 、 自 由 飲 水 と し 。 、 、 た 投 薬 時 は １ 週 間 毎 に 体 重 を 測 定 し 製 剤 の 投 与 量 を 補 正 し た 。 こ の よ う な 飼 料 添 加 に よ る 投 薬 を 、 ４ 週 間 連 続 で 行 っ た 。 （ ３ ） 分 析 用 試 料 の 採 材 休 薬 14 日 目 に 屠 殺 し 、 肝 臓 、 脂 肪 及 び 小 腸 （ 牛 海 綿 状 脳 症 の 危 険 部 位 を 除 く 食 用 部 分 ） を 採 材 し た 。 採 材 し た 臓 器 g 80 ・ 組 織 は、５ ず つ に わ け、分 析 ま で － ℃ で 凍 結 保 存 し た 。 試 料 中 の イ ソ プ ロ チ オ ラ ン の 残 留 分 析 ３ （ １ ） 牛 の 各 臓 器 ・ 組 織 中 の イ ソ プ ロ チ オ ラ ン 濃 度 の 測 定 は 、 平 成 17 年 １ 月 24 日 付 け 食 安 発 第 0124001 号 厚 生 労 働 省 医 薬 食 品 局 食 品 安 全 部 長 通 知 の 一 斉 試 験 法 （ 畜 水 産 物 ） に よ り 行 っ た 。 具 体 的 な 方 法 を 、 ス キ ー ム １ に 示 し た 。 こ の 分 析 方 法 で 使 用 し た ゲ ル 浸 透 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー （GPC）、 固 相 抽 出 （PSA） 及 び GC/MS/MS の 条 件 等 は 、 下 記 に 示 し た 。 ①GPC条 件 機 種 名 ：GL-Science G-Prep-8150（GLサ イ エ ン ス 製 ） カ ラ ム ： × （ 製 ） に

GPC CLNpak EV-2000, 20mm i.d. 300mm shodex

× （ 製 ） を 接 続 し た 物 。

CLNpak EV-G, 20mm i.d. 100mm shodex 移 動 相 ： ア セ ト ン ： シ ク ロ ヘ キ サ ン （1:4） 5mL/min 流 速 ： カ ラ ム 温 度 ：40℃ UV254nm 検 出 波 長 ： 5mL 注 入 量 ： の 分 取 範 囲 は 、 と し た 。 GPC 16.01-23.4min ②PSAカ ラ ム （ 製 ）

Bond elute PSA 500mg Varian ③GC/MS/MS条 件 装 置 ： タ ン デ ム 型GC/MS/MS（Varian製 ） ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ （Cp-3800型 ） 質 量 分 析 計 （300MS） 条 件 GC カ ラ ム ：VF-5MS（30m×0.25mm、 膜 厚 0.25μm、Varian製 ） カ ラ ム 温 度 ： 注 入 後1分 間50℃ に 保 ち 、 そ の 後125℃ ま で25℃/minで 昇 温 し 、 次 い で300℃ ま で10℃/minで 昇 温 し 、300℃ を 10分 間 保 持 す る 。 キ ャ リ ア ガ ス ： 高 純 度 ヘ リ ウ ム 1.2mL/min キ ャ リ ア ガ ス 流 量 ： 注 入 口 温 度 ：250℃ 注 入 方 式 ： ス プ リ ッ ト レ ス （40psi,1mL） 1 L 注 入 量 ： μ 条 件 MS/MS EI イ オ ン 化 モ ー ド ： イ オ ン 化 エ ネ ル ギ ー ： (70eV) ト ラ ン ス フ ァ ー ラ イ ン 温 度 ：300℃ イ オ ン 源 温 度 ：250℃ 25V コ リ ジ ョ ン エ ネ ル ギ ー ： コ リ ジ ョ ン ガ ス ： ア ル ゴ ン 2m torr コ リ ジ ョ ン ガ ス 圧 ： 定 量 イ オ ン ： プ ロ ダ ク ト イ オ ン85.0m/ｚ （ プ レ カ ー サ ー イ オ ン ：162.0m/z） 45 34-40 (2008) 動薬検年報 第 号

45 34-40 (2008) 動薬検年報 第 号 （ ２ ） 検 量 線 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン 標 準 品 （ 和 光 純 薬 、 、 ） 工 業 製 残 留 農 薬 試 験 用 純 度 ：99.0％ を 量 り 、 ア セ ト ン で 溶 解 し 、 標 準 20.0mg 原 液 （200mg/L） を 作 成 し た 。 こ の 標 準 原 液 を 5 ～ 100ｎ g/mL の 濃 度 と な る よ う に ア セ ト ン ： ヘ キ サ ン （ １ ： １ ） で 希 釈 し た 標 準 溶 液 を 用 い て 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン の ピ ー ク 面 積 を 測 定 し 検 量 線 を 求 め た 結 果 、 イ ソ プ ロ チ オ ラ ン の 検 量 線 は 良 好 。（ 、 ） な 直 線 性 を 示 し た r=0.995 以 上 図 １ （ ３ ） 添 加 回 収 率 及 び 検 出 限 界 牛 の 各 コ ン ト ロ ー ル に イ ソ プ ロ チ オ ラ ン の 暫 定 MRL 相 当 の 0.02ppm と な る よ う に 、 ( ) の 標 準 原 液 （1 200mg/L） を ア セ ト ン ： ヘ キ サ ン （ １ ： １ ） で 0.1mg/L の 濃 度 に 希 釈 し 、 試 料 ５ g に こ の 希 釈 液 １ を 添 加 し て 、 添 加 回 収 率 を 求 め た 。 mL

Table1 Recovery of Isoprotiolane from bovine tissues

Spike ｌeveｌ

Recovery（％）

CV

(0.02ppm)

1

2

3

Mean

（％）

Liver

84.0

98.1

88.4

90.2

8.0

Fat

96.0

99.9

102.1

99.3

3.1

Intestines

89.0

97.4

96.7

94.4

4.9

イソプロチオラン標準溶液、コントロール、添 加回収及び検体の各クロマトグラムを図２～４に 示す。イソプロチオランの保持時間は、約 16 分で あった。添加回収率は、全ての臓器・組織で平均 以上であり、変動係数は 以下であった。 90% 10% これらの結果は、残留に関する試験ガイドライン 12 （動物用医薬品関係事務の取扱について、平成 年３月 31 日、12-33 農林水産省畜産局衛生課薬事 室長通知）を満足していた。 イソプロチオランの検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）及 び定量限界（Ｓ／Ｎ＝ 10）は、肝臓及び小腸でそ れ ぞ れ 0.85ng/ｇ 及 び 2.8ng/ｇ 、 脂 肪 でそ れ ぞ れ 及び ｇであった。肝臓及び小腸の定 1.7ng/g 5.7ng/ 量限界は、暫定 MRL 20ng/g（ ）の１／７以下であ り、脂肪の定量限界は１／３以下であったことか ら、この残留分析法の感度は十分であると考えら れた。 結果 １ 供試動物 （１）試験期間中、投薬期間以外の休日を除く毎 日一般状態を観察した。その結果、異常は観察 されなかった。 （２）導入時、投薬時、投薬後及び屠殺時に体重 を測定した。その結果を表１に示した。牛の平 均の体重増加は、投薬期間中は 0.6kg/日、休薬 期間中は1.2ｋg/日であった。

Table2 Body weights of the three cattle

Body weight at each time point（ｋｇ）

Cattle No.

Induction

Pre-administration

Post-administration

Pre-sacrifice

120 124 142 153

1

73 83 100 115

2

95 108 123 142

3

96 105 122 137

Mean

23.5 20.7 21.0 19.6

SD

45 34-40 (2008)

２ 試料中のイソプロチオランの残留分析 （１）試料分析結果 牛の各臓器・組織におけるイソプロチオラ ン濃度の分析結果を表３に示した。イソプロチ オランは肝臓で５～９ ppb、脂肪で検出限界付 近の量が検出されたが、小腸では検出限界以下 であり、全て暫定MRL以下であった。

ND Not detected

Table3 Residue levels of Isoprotiolene in each tissue ＊

：

(A) Liver (B) Fat

Cattle No. Residue level Cattle No. Residue level

（ppm) （ppm) 1 0.005 1 (0.002) 2 0.004 2 (0.002) 3 0.009 3 (0.002) Mean±SD 0.006±0.003 Mean±SD (0.002) (C) Intestines

Cattle No. Residue level （ppm) 1 ND 2 ND 3 ND Mean±SD ND まとめ 牛にイソプロチオランを有効成分とする飼料添 加 剤 を 使 用 基 準 の 用 法 及 び 用 量 の 最 高 用 量 50mg/kg/ 14 （ 日）で４週間投与し、使用禁止期間（ 日間）経過後に屠殺採材し、肝臓、脂肪及び小腸 のイソプロチオランを GC/MS/MS 法で定量した。 その結果、すべての臓器・組織で、イソプロチオ ランは暫定MRL以下であった。 この結果より、イソプロチオランを有効成分と 。 する飼料添加剤の使用基準の妥当性が確認された 引用文献 １）厚生労働省： 食品に残留する農薬、飼料添加「 物又は動物用医薬品の成分である物質の試験法 に つ い て （ 平成」 17年１月24日 付 け 食 安 発 第 号厚生労働省医薬食品局食品安全部長通 0124001 知）別添