Colony
assay法
を 用 い た 肺 癌 化 学 療 法 に お け る
Anthracycline-anthraquinone系
薬 剤 の
有 効 性 に 関 す る 研 究
第2編 ヒ ト肺 癌 腫 瘍 材 料 に お け る anthracycline-anthraquinone系 薬 剤 の 抗 腫 瘍 効 果 の 比 較 岡 山 大 学 医 学 部 第 二 内 科 学 教 室(指 導:木 村 郁 郎 教 授) 沼 田 健 之 (平成4年11月17日 受 稿)Key words:肺 癌 腫 瘍 材 料, colony assay, anthracycline, anthraquinone
緒 言 近 年,各 種 悪 性 腫 瘍 に 対 す る化 学 療 法 は,新 しい 薬 剤 の 開 発 と そ れ を 導 入 し た 多剤 併 用 療 法 に よ り進 歩 して き た が,宿 主 に 対 す る毒 性,腫 瘍 に お け る 薬 剤 耐 性 の 発 現 な ど,な お 多 くの 問 題 が 残 さ れ て い る. anthracycline系 抗 生 剤 で あ るadriamycinは,そ の 強 い 抗 腫 瘍 活 性 と広 い 抗 腫 瘍 ス ペ ク トラ ム か ら,種 々 の 悪 性 腫 瘍 の 治 療 の な か で重 要 な 役 割 を 果 た して きた1).し か し, 蓄 積 性 に 発 現 す る 心 毒 性 が しば しば 致 死 的 とな る こ とか ら,毒 性 が よ り軽 微 で よ り活 性 の 高 い 化 合 物 を指 向 す る なか で,い くつ か の 新 し い誘 導 体 が 開 発 さ れ て き た. 著 者 は,新 し い 誘 導 体 で あ る aclarubicin (ACR) 2), tetrahydropyranyl adriamycin (THP-ADM) 3), mitoxantrone (MIT) 4) 5)の 肺 癌 化 学 療 法 に お け る有 用 性 を予 測 す る 目的 で, 5種 類 の 肺 癌 細 胞 株 に お け る 抗 腫 瘍 活 性 を, col ony assay法 を 用 い て 母 化 合 物 で あ る adriamycinの そ れ と比 較 し,そ の 成 績 を 第1編 に お い て 報 告 し た6).本 編 で は,そ れ を さ ら に 進 め,第1編 に お い て得 られ た 所 見 を確 認 す る 目 的 で, Salmonら に よ り個 々 の 患 者 に お け る 制 癌 剤 感 受 性 試 験 と して 有 用 性 が 高 い と報 告 さ れ
て い るhuman tumor clonogenic assay 法7)8)9)10)を用 い て,直 接 に 患 者 か ら得 られ る肺 癌 腫 瘍 材 料 につ い て これ らanthracycline-anth raquinone系 薬 剤 の抗 腫 瘍 活 性 を比 較 検 討 した. 材 料 と 方 法 1. 薬 剤 お よ び 薬 剤 濃 度 今 回 実 験 に用 い たadriamycin (ADM)は 協 和 発 酵 工 業 よ り, aclarubicin (ACR)は 山 之 内 製 薬 よ り, THP-adriamycin (THP-ADM)は 明 治 製 菓 よ り, mitoxantrone (MIT)は 日本 レ ダ リー よ り供 与 を受 け た.そ の 薬 剤 濃 度 は,実 際 の 臨 床 投 与 量 に お け る血 中 濃 度 を指 標 と して 定 め た.す な わ ち,各 薬 剤 の 通 常 投 与 量 あ る い は 臨 床 第II相 試 験 に お け るrecommended dose をone shot静 注 し た場 合 の 血 中 濃 度 曲 線 の β-phase起 始 部 の 濃 度(多 くの 場 合,こ れ は 最 高 血 中 濃 度 の ほ ぼ1/10に 相 当す る)を 基 準 と し, 臨 床 的 に 到 達 可 能 な 血 中 濃 度 の 範 囲 内 の2-3 薬 剤 濃 度 (Table 1)を 用 い検 討 し た. 2. Colony assay法
Salmonら に よ っ て報 告 さ れ たhuman tumor clonogenic assay法 に 準 じ て 行 な っ た7) 8).実 験
方 法 の 概 略 をFig. 1に 示 す.実 験 材 料 と して は, 肺 癌 患 者 の 手 術 あ る い は生 検 で 得 ら れ た 腫 瘍 組 81
Table 1 Concentration of anthracycline-anth-raquinone 4 drugs used for in vitro sensitivity testing
* Peak plasma concentrations which were achiev able pharmacologically in vivo
Fig. 1 Method for human tumor clonogenic assay and in vitro chemosensitivity test
織,細 胞 診 に よ り悪 性 腫 瘍 細 胞 の 存 在 が 証 明 さ れ た胸 ・腹 水,心 嚢 貯 留 液,骨 髄 穿 刺 液 を用 い た.手 術,生 検 な ど で 得 ら れ た 腫 瘍 組 織 は,無 菌 条 件 下 で 可 及 的 す み や か に 耳 鼻 科 用 剪 刀 を 用
い て 細 切 し, 37℃, 5%二 酸 化 炭 素 下 で2時 間, 0.8% collagenase (Sigma製)を 含
むRPMI-1640中 で酵 素 処 理 を加 え,最 終 的 に stainless meshで 濾 過 す る こ とに よ り単 一 細 胞 浮 遊 液 を得 た.ま た,胸 水 な ど の 体 腔 内貯 留 液,骨 髄 穿 刺 液 の 場 合 に は, heparinを 加 え 無 菌 的 に 採 取 し, Ficoll-Conray比 重 遠 沈 法 にて 赤 血 球 を 除 去 し, 細 胞 浮 遊 液 を 作 製 し た.細 胞 浮 遊 液 は, 0.5% trypan blue液 に て 生 細 胞 数 を 算 定 し,生 細 胞 数 が5×105個/mlの 細 胞 密 度 に な る よ う に 調 整 し, 37℃ 恒 温 層 内 に て 各 薬 剤 と前 述 の 濃 度 で1 時 間 接 触 させ た.続 い てRPMI-1640に て2回 洗 浄 し,二 層 軟 寒 天 培 地 を用 い 培 養 し た.す な わ ち,径35mmの グ リ ッ ド付 き プ ラ ス チ ッ ク製 ペ ト リデ ィ ッ シ ュ(Lux製, #5217)に あ らか じめ0.5 % agar (Marine Calloids製)と15%牛 胎 児 血 清 を含 むRPMI-1640(総 量1ml)に てfeeder layer(下 層)を 作 製 して お き,こ の上 に 前 述 の 細 胞 を0.3% agar と15%牛 胎 児 血 清 を 含 む RPMI-1640に5×105個/mlの 割 で 浮 遊 させ,そ の1mlをplating layer(上 層)と し て 重 層 させ た.コ ロ ニ ー の 算 定 は,37℃,5%二 酸 化 炭 素 培 養 器 内 で2週 間 静 置 培 養 し た の ち,倒 立 顕 微 鏡 下 で 行 な っ た.形 成 され た 細 胞 集 塊 が 腫 瘍 コ ロニ ー で あ る こ との 確 認 は,数 コ ロ ニ ー をパ ス ツ ー ル ピペ ッ トに て 吸 引 採 取 し,そ の 塗 抹 標 本 をMay-Giemsa染 色 あ るい はPapanicoloau染 色 す る こ とに よ り行 な っ た. 各 薬 剤 濃 度 に つ い て い ず れ もduplicateの 測 定 を行 な い,評 価 可 能 の 可 否,薬 剤 感 受 性 の 有 無 は 以 下 の 基 準 に し た が っ て 判 定 し た.す な わ ち,①30個 以 上 の 細 胞 集 塊 を コ ロ ニー と し,② 薬 剤 非 接 触(対 照)プ レー トに お け る コ ロニ ー 数 が30個 以 上 認 め られ た 場 合 を評 価 可 能 とした. ③ 各 薬 剤 濃 度 に お け る生 細 胞 率(surviving frac tion)を 両 対 数 方 眼 紙 に プ ロ ッ ト し てdose response curveを 作 成 し,こ れ よ り70%殺 細 胞
Table 2 Correlation between tumor type and colony growth
* Numbers in parentheses indicate the percentage to the number of specimens tested
濃 度(LD70)を 求 め,そ の 濃 度 が 各 薬 剤 の ヒ ト 血 中 最 高 濃 度 以 下 に あ る場 合 を感 受 性 あ り と し た. 成 績 本assayを 用 い て 前 記4薬 剤 の 抗 腫 瘍 効 果 を 検 討 し た 肺 癌 症 例 の 組 織 型 の コ ロ ニ ー 形 成 の 成 績 をTable 2に 示 す.100例 の 症 例 に 薬 剤 感 受 性 試 験 を 試 み,67例(67%)に5個 以 上 の コ ロ ニ ー 形 成 が 認 め ら れ た .そ の うち,45例(45%) に30個 以 上 の コ ロ ニ ー 形 成 が 認 め られ,感 受 性 の 評 価 が 可 能 で あ っ た. 前 述 の 判 定 基 準 に従 ってanthracycline-anth raquinone系4薬 剤 に 対 す る肺 癌 症 例 の 感 受 性 を総 括 し た成 績 をTable 3に 示 す.ADMに 対 し て は43例 中7例(16%)が 感 受 性 あ り と 判 定 さ れ た.ACRに 対 して は31例 中14例(45%)が 感 受 性 あ り と判 定 さ れ,THP-ADMに 対 して は 35例 中15例(43%)が 感 受 性 あ り と判 定 さ れ た. ま た,MITに 対 して は30例 中10例(33%)が 感 受 性 あ り と判 定 さ れ た.さ ら に,組 織 型 別 に anthracycline-anthraquinone系4薬 剤 に 対 す る感 受 性 を 比 較 し て み る と(Table 3, Fig. 2), ADMに 対 し て は 腺 癌20例 中1例(5%),扁 平 上 皮 癌11例 中2例(18%),小 細 胞 癌11例 中3例 (27%),大 細 胞 癌1例 中1例 に 感 受 性 が 認 め ら れ た.ACRに 対 して は 腺 癌15例 中9例(18%), 扁 平 上 皮 癌9例 中2例(22%),小 細 胞 癌6例 中 2例(33%),大 細 胞 癌1例 中1例,THP-ADM に 対 して は,そ れ ぞ れ16例 中7例(44%),10例 中2例(20%),8例 中5例(63%),1例 中l 例 が 感 受 性 を示 し た.ま た,MITに 対 し て は,
Table 3 In vitro chemosensitivity of anthracycline-anthraquinone 4 drugs
* No. of patients judged as sensitive/No.
of patients tested
腺 癌14例 中6例(43%),扁 平 上 皮 癌9例 中2例 (22%),小 細 胞 癌6例 中2例(33%)に 感 受 性 が 認 め られ た が,大 細 胞 癌 の1例 に は 無 効 で あ っ た.以 上 の 所 見 は,肺 癌 に 対 す るanthracycline -anthraquinone系 薬 剤 の 効 果 は ,ACRとTHP -ADMが 最 も高 く,MITが こ れ に 続 き,ADM で は や や 乏 し い こ と を 示 す も の で あ っ た. 一 方,4薬 剤 す べ て の 感 受 性 を 測 定 し得 た29 症 例 に つ い て 検 討 を加 え た 結 果 で は(Fig. 2), 腺 癌 の14例 中10例(71%),扁 平 上 皮 癌 で は8例 中3例(34%),小 細 胞 癌 で は6例 中3例(50%) が い ず れ か の 薬 剤 に 感 受 性 を示 して お り,組 織 型 別 の 感 受 性 に は 明 らか な 差 異 は 認 め られ な か っ た.ま た,4薬 剤 の 効 果 の 相 互 関 係 を み る と, い ず れ か の 薬 剤 に 感 受 性 を 示 し た16例 の う ち, 1例 の み に 感 受 性 を示 し た も の は5例 で あ り, 他 の11例 は2剤 な い し4剤 す べ て に 感 受 性 を示 した. 考 察 癌 化 学 療 法 は,個 々 の 患 者 に 対 し最 も有 効 な 制 癌 剤 を選 択 し使 用 す る こ とが 理 想 的 で あ り, そ の た め に は,臨 床 効 果 の 予 知 性 に 優 れ た制 癌 剤 感 受 性 試 験 が 必 要 で あ る.今 回,著 者 が 用 い たcolony assay法 は,そ の 成 績 をみ る と,感 受 性 試 験 を行 な っ た100例 の うち薬 剤 感 受 性 の 評 価 が 可 能 で あ っ た の は45例(45%)で あ り,今 後 の コ ロ ニ ー 形 成 率 の 改 善 が 望 ま れ る.し た が っ て,現 時 点 で はcolony assay法 を用 い た 制 癌 剤 感 受 性 試 験 は,個 々 の 患 者 に 対 し用 い る よ り も,新 制 癌 剤 の ス ク リー ニ ン グ と し て 薬 剤 指 向 性 の 検 索 に 用 い るの が 実 用 的 で あ る と思 わ れ る. 肺 癌 化 学 療 法 に お い てADMは,既 に 臨 床 で 一 定 の 評 価 を得 て い る薬 剤 で あ るが1),そ れ に対 しACR, THP-ADM, MITは,今 だ 臨 床 で は 評 価 が 定 ま っ て い な い.今 回,著 者 は 肺 癌 の 臨 床 材 料 を 用 い,そ れ ら に 対 す るanthracycline-anthraquinone系4薬 剤 のin vitroに お け る抗 腫 瘍 効 果 を比 較 検 討 し た.そ の 結 果,ACRと THP-ADMは 類 似 し た 傾 向 を示 し,ADMに 比 べ て や や 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を有 し,MITの 抗 腫 瘍 効 果 はADMとACRお よ びTHP-ADMの 中 間 に 位 置 す る もの と思 わ れ た.ま た,こ れ ら の 結 果 は,第1編 で 著 者 が ヒ ト肺 癌 細 胞 株 を用 い たcolony assay法 に よ り比 較 検 討 し た 結 果 とほ ぼ 同様 で あ っ た.ま た,個 々 の 腫 瘍 に つ い て み る と,同 じ組 織 型 の もの で あ っ て も こ れ ら 薬 剤 に 対 しそ れ ぞ れ 異 な る感 受 性 を示 して お り, こ の こ と は 本assayが 新 制 癌 剤 の 薬 剤 指 向 性 の 検 索 に お い て 有 用 な 方 法 で あ る こ と を示 唆 す る 所 見 で あ っ た. 今 後,本assayが 臨 床 材 料 を用 い て の 制 癌 剤 の 薬 剤 指 向 性 の 検 索 方 法 と して 頻 用 され る よ う に な る た め に は,コ ロ ニ ー 形 成 率 を さ ら に 改 善 す る こ と が 必 須 で あ る と 思 わ れ, epidermal growth factor, insulinな どの 増 殖 促 進 因子11)12)
の 添 加,培 養 液 の 改 善 な ど の 方 法 で 腫 瘍 細 胞 を 増 や し,十 分 量 の 細 胞 数 に 達 し て か ち 感 受 性 試 験 を行 な う等 の 方 法 を考 え な け れ ば な らず,今 後 さ ら に 検 討 を加 え て ゆ くべ き で あ る と考 え ら れ た. 結 論 肺 癌 の 臨 床 材 料 を用 いてanthracycline-anth raquinone系4薬 剤 (ADM, ACR, THP-ADM, MIT)に 対 す るin vitro薬 剤 感 受 性 試 験 をcolony assay法 を用 い て 検 討 し た 結 果, 抗 腫 瘍 効 果 はACR, THP-ADM, MIT, ADM の 順 に 高 い こ と が 示 さ れ た.そ の 結 果,本assay は 新 制 癌 剤 の 臨 床 第II相 試 験 を 開 始 す るに あ た り,そ の 制 癌 剤 の 薬 剤 指 向 性 を検 索 す るの に 有 用 な 方 法 と思 わ れ た.し か し,現 行 の 方 法 で は, 薬 剤 感 受 性 を 評 価 で き る症 例 数 は 全 症 例 の45% に す ぎ ず,今 後 臨 床 材 料 を 用 い て 新 制 癌 剤 の 薬 剤 指 向 性 を検 索 す る場 合,コ ロ ニ ー 形 成 率 を さ ら に 改 善 す る 必 要 が あ る と思 わ れ た. 本 論 文 を擱筆 す るに あ た り,御 懇 篤 な る御 指 導 な らび に御 校 閲 を賜 った恩 師木 村 郁 郎教 授 に深 甚 の謝 意 を表 わ します.ま た,終 始 御 懇 篤 な る御 指 導 を賜 っ た大 熨 泰 亮助 教 授,平 木俊 吉 先 生 に深 謝 し ます. な お 本 論 文 の 要 旨 は 第22回 日本 癌 治 療 学 会 総 会 (昭和59年 東京)に お い て発 表 した.
文 献
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6) 沼 田 健 之: Colony assay法 を 用 い た 肺 癌 化 学 療 法 に お け るAnthracycline-anthraquinone系 薬 剤 の 有 効 性 に 関 す る 研 究 第1編 ヒ ト肺 癌 細 胞 株 に 対 す るanthracycline-anthraquinone系 薬 剤 の 殺 細 胞 効 果 の 比 較.岡 山 医 誌 105, 73-80.
