審 査 論 文 要 旨（日本文） 論文提出者氏名： 高橋 広樹 審査論文

審 査 論 文 要 旨（日本文）

論文提出者氏名： 高橋 広樹 審査論文

題 名：

Novel primary epithelial cell toxicity assay using porcine corneal explants (豚角膜を用いた新規角膜上皮毒性試験)

著 者：

Hiroki Takahashi, Kazuki Tajima, Takaaki Hattori, Naoyuki Yamakawa, Norihiko Ito, Hiroshi Goto

掲載誌：

（審査論文要旨：日本語論文の場合

字以内・英語論文の場合

）

【背景と目的】

従来、in vivo の点眼毒性試験は主にウサギを用いたドレイズ試験が行われていたが、疼痛や 不快感などの倫理的問題、また毒性の定量化が困難であった。そこで、我々は豚角膜を用い て新規角膜上皮毒性試験の開発を試み、点眼薬に防腐剤として広く用いられている塩化ベン ザルコニウム(BAK)を用いて毒性評価を行った。

【方法】

豚角膜から 2mm の生検トレパンを用いて円形角膜片を採取した。角膜片は 6 well 細胞培養 用プレートに静置し、液体培地を加えて培養した。培養 12 時間後に各 well に PBS、被検薬と して各種濃度 BAK（0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01％）をそれぞれ 50μl ずつ滴下し、2 分間 曝露した。PBS で 3 回洗浄した後、さらに 24 時間培養し、角膜片から伸展する角膜上皮細胞 を写真撮影し、Image J を用いて面積を測定した。PBS 曝露群での伸展面積を 100%として各種 溶液における伸展率を算出した。角膜上皮細胞の免疫組織科学染色は Cytokeratin (CK) 3, CK12, ZO-1 を用いて行った。細胞毒性は WST-8 assay、Ki-67 染色、TUNEL assay を用いて行 った。

【結果】

角膜上皮細胞は時間経過とともに角膜片から同心円状に伸展していった。伸展した角膜上 皮細胞は CK3、CK12、ZO-1 陽性であった。細胞伸展率は PBS 暴露群と比較し、0.0001, 0.001, 0.01％ BAK 曝露群で濃度依存的に有意に減少した(

< 0.01)。生細胞数と Ki-67 陽性細胞数 は PBS 曝露群と比較し、0.01% BAK 曝露群で有意に減少していた(

< 0.05)。TUNEL 陽性細胞 密度は 0.01% BAK 曝露群と比較し、PBS 曝露群(

= 0.14)と 0.00001% BAK 曝露群(

= 0.081) で減少する傾向がみられた。

【結論】

我々の豚角膜を用いた新規角膜上皮毒性試験は簡便、且つ点眼薬の短時間曝露の影響を反 映していた。また、本角膜上皮毒性試験は低濃度の

における角膜毒性評価に有用である。

東 京 医 科 大 学