細胞 培 養 お よ び ウ イ ル ス
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(2) 336. 赤. 塚. 和. 也. 10%牛 胎 児 血 清 加 イー グルMEM/YLE(7:2)の. 一で 試 験 管 壁 よ り剥 離 し,低 速 遠 沈(1 ,000rpm,. 増 殖 培 地 に浮 遊 させ,そ の1mlを. 分 間)し て 細 胞 お よ び細 胞 片 を落 し, 30,000rpmで. 培 養試 験管(観 察. 10. の 目 的 に よ って は カバ ース1)ッ プ を入 れ た もの)に. 60分 間 超 遠 沈 し,出 来 た ペ レ ッ トを再 浮 遊 して再 び. 分 注 し た後37℃ で静 置 培 養 した.こ の場 合 培 養3日. 低 速遠 沈 と超 遠 沈 を繰 り返 して精 製 ウ イル ス 液 と し. 後 に は単 細 胞 層 を形 成 す るの で,リ ン酸 緩 衝 液(PBS). た.最 後 に ウ イル ス を蒸留 水 に浮 遊 し,2%酢. で こ れ を洗滌 し,つ. ラ ン, 2%リ. TCID. 50/ml)を. ぎに ウ イル ス液0.1ml(約106.). 接 種 して, 37℃ で1時 間 吸着 させ,. そ の後 ウ イ ル ス液 を捨 て 再 びPBSで2回 さ らに維 持 培 地(2%牛. 洗 濃 し,. 胎 児 血 清加 イー グ ルMEM. /YLE(7:2)液)1mlを. 加 えて37℃ で培養 した.. %モ リブ デ ン酸 ア ン モ ン(pH7.4)で. 染 色 して 観 察 し. た.用 い た電 子 顕 微 鏡 はH‑500(日. 立)で あ る.. その 他 の 実 験 法 の 詳 細 は その 都 度 記述 す る こ とに す る.. 以 後 は4日 毎 に新 し い維 持 培 地 に交 換 し,経 時 的 に. 第3章. 材 料 を採 取 して観 察 試 料 と し た. 光 学 顕微 鏡 用 染 色 は ヘ マ トキ シ リン ・エ オ シ ン染 色 法 を 行 って観 察 した. 第3節. PBSで20分. 牛 疫 ウィ ル ス感 染MDCK細. 胞 が示 す 病 理 形 態 学. 子顕 微 鏡 で,一 般 染 色標 本 を光 学 顕 微 鏡 に よ り観 察. 走 査電 子 顕 微 鏡 用 試 料 作 製 法. 却 した2.5%グ. 実験結果. 的 微 細 構 造 の 変 化 を走 査 電 子 顕 微 鏡 お よ び透 過 電. カバ ー ス リッ プ入 り試 験 管 で培 養 後,ウ 接 種 した 感 染MDCK細. 酸ウ. ン タ ン グ ステ ン酸(pH 7.2)あ るい は1. イ ルス を. 胞 ス リ ップ を取 り出 し,冷. ル タ ー ル アル デ ヒ ドで60分 間 固 定 し 間毎 に3回 液 替 え洗 糠 後, 1%オ. ク酸 で 後 固 定 を施 した.つ. ス ミッ. ぎに ア ル コー ル系 列 で脱. した. 第1節. 走 査 電 子顕 微 鏡 に よ る観 察. ウ イル ス 非接 種 正 常MDCK細. 胞 は 各 々 丸 味 を帯. びて 高 く も りあが って お り,細 胞 表面 に は 多数 の マ イ ク ロ ビ リが存 在 し,こ れ で一 様 に被 わ れ て い る.. 水 し,酢 酸 イ ソ ァ ミル アル コー ル に置 換 した後,直. 各 マ イ ク ロ ビ リは 総 体 的 に細 長 く,い つ れ も一 定 の. ちに臨 界 点 乾 燥 法 で 乾 燥 した.乾 燥 後 は これ にPt. 太 さ を有 して い る.更 に この よ うな マ イ ク ロ ビ リ間. Pdを 蒸 着 して観 察 試 料 とし た.用 い た 走 査 電 子. の 細 胞 表 面 に はblebsも. 所 々 に存 在 す る の が 認 め. 顕 微 鏡 はHHS‑2R. られ る.図1は. と して 培 養5日. 第4節.. (日立)で. あ る.. MDCK細. 透 過 電 子 顕微 鏡 用 試 料 作 製 法. 第1項. 培 養 試 験 管 内壁 に増 殖 して い る ウ イル ス感 染MD 洗 條 し, 4℃ に冷 却 し た2.5. %グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドを加 えて ア イス ボ ッ クス 中 で約5分. 間軽 く固 定 し た後,ラ バ ー ク リー ナ ー で細. 胞 を管 壁 か ら剥 離 し, 2,500rpmで10分 び2.5%グ. 胞 像 を示 す もの で,各 細 胞 は それ ぞれ 個 々. こ の よ うな正 常MDCK細. 胞 単 層 に牛 疫 ウ イ ル ス. を接 種 す る と,ウ イ ル ス感 染 細 胞 は接 種 後3〜4日 頃か ら細 胞 融 合 像 を示 す よ うに な り,多 核 巨大 細 胞 を形 成 す る.図2は. ウ イ ル ス接 種 後5日 目 のMDCK. 間遠 沈 し,再. 細 胞 で あ り,多 くの細 胞 が 融 合 を起 して 多 核 巨 大細. ル ター ル アル デ ヒ ドで30分 間 固 定 し た.そ. 胞 を形 成 し,い ず れ も形 態 が ウ イル ス 非 接 種 正 常細. の後,冷 却 し たPBSで20分 1%オ. 目の 正 常. に独 立 配 列 し て い る.. 超薄切片の作製法. CK細 胞 をPBSで1回. その1例. 間 隔 で3回 洗 濃 を行 い,. ス ミック酸 を加 え,ア イ ス ボ ック ス 中 で30分. 胞 と異 な って 扁平 で あ り,さ らに 収縮 しか け た部 分 も観 察 す る こ とが で き る.ちなみ に 図1の 正常MDCK. 間,後 固 定 を行 った.固 定 終 了後 は ア ル コ ー ル系 列. 細胞 像 に お い て は 核 が 細 胞 の 中 心 に 存 在 す る もの で. で 脱 水 し, Epon812に. あ ろ うか ら細 胞 が よ く膨 隆 し,し か も多 数 の マ イ ク. 包 埋 し た.超 薄切 片 作 製 には. ガ ラス ナ イ フ を用 い, Porter‑Blume(MT‑1型). ロ ビ リが存 在 す る た め核 の認 識 は困 難 で あ る.し か. ミク トー ロ ムで 切片 を作 製 し,切 片 は2%酢. 酸ウラ. し融 合 細 胞 では 表 層 の マ イ ク ロ ビ リの 数 が 総 体 的 に. ン と クエ ン酸 鉛 で二 重 染色 を施 して観 察 用 切 片 試 料. 減 少 し,し か も残 存 す る ご く小 数 の マ イ ク ロ ビ リの. と した.用 い た電 子 顕 微鏡 はJEM‑7(日. 長 さ は長 短 不 均 一 で あ って,細 胞 表 面 を広 く露 出 し. HU‑11(日. 立)お. 第2項. よ びHS‑8(日. 立)で. 本 電 子), あ る.. ネガ テ ィブ染 色試 料 の作 製 法. ウイ ル ス粒 子 の観 察 は専 ら ネガ テ ィブ染 色標 本 に よ り観 察 した. ま ず ウ イル ス 感 染MDCK細. て お り,さ らに細 胞 全 体 が扁 平 化 す る こ と と合 ま っ て 図2aお. よ び図2bの. 如 く,多 数 の 核 を 細 胞 外 か. ら確 認 で き る もの もあ る.ウ ィ ル ス未 感 染 の細 胞 層 部 分 とウ イル ス 感 染 に よ る多 核 巨大 細 胞 部 分 との 境. 胞 を ラバ ー ク リー ナ. 界 線 は 図2cで. は は っ き り区 別 で きる が,多. 核 巨大.
(3) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細 細 胞 は後,次 第 に収縮 す るた め ガ ラス面 を一 部 露 出 す るよ うにな って くる.図2dで. は ウ ィル ス未 感 染. 胞 の 電 子顕 微 鏡 的研 究. 337. まず 核 内 封 入 体 に つ い て 述 べ れ ば そ の 形 成 初 期 に は 核 内 で,ク. ロ マチ ン顆 粒 が減 少 す るか,ま. たは そ. 細 胞 層,多 核 巨大細 胞 お よ び露 出 した ガ ラ ス面 を明. れ らが 核膜 の 方へ お しや られ た 如 き像 を呈 し,封 入. 瞭 にみ る こ とが で きる.な お収 縮 し始 め た多 核 巨大. 体域 は電 子 密 度 の低 い楕 円形 を した. 細 胞 の一 部 を拡 大 して み る と図3の 如 く扁 平 に な っ. して 認 め られ る(図9a).こ. た細 胞 表 面 に長 短不 同 の マ イ ク ロ ビ リが 混 在 し,長. に比 較 的電 子密 度 の高 い 巾 の一 定 した フ ィ ラ メ ン ト. cleararea"と. の 封 入 体 域 の 中 の所 々. い もの は蛇 行 して存 在 して お り,さ らに その 周辺 に. 状 構 造 物 の 束状 配 列 は切 片 の方 向 に よ り,斜 断 面 を. は球 形 の粒 子 が 認 め られ る.細 胞 の辺 縁 部 で は 特 に. 示 した り(図9b),一. マ イ ク ロ ビ リが い り くみ,そ の周 辺 に も同 様 に球 形. す るわ け で これ らの 断面 口 か ら各 フ ィ ラメ ン ト状 構. の粒 子 が認 め られ る.細 胞 表 面 の一 部 分 を さ らに拡. 造物 は 明 らか に管 状 構 造 を もっ て い る こと が認 め ら. 大 した もの が図4で あ る.マ イク ロ ビ リの 所 々に 大. れ る.こ の管 状 構 造 物 の 巾 は一 定 し て お り約15〜17. 小 不 同 の球 形 粒 子 が 多 数 附 着 して い る像 や,こ れ と. nmで,中. は別 に孤 立 して 存 在 す る同 様 の粒 子 が認 め られ る.. さに つ い て は そ の走 り方 が不 規 則 な た め に切 片 像 で. 部 横 断 面 を示 し た り(図9c). 空 が 約6〜7nmで. あ る.こ の構 造 物 の長. ま た別 の視 野 では 細 胞 変性 に よ り収 縮 し た細 胞 の 周. の測 定 は で きな い.封 入 体 の形 成 末 期 ま たは 完 成 さ. 辺 で ガ ラ ス面 にか な り直 線 的 に配 列 した球 形 の 粒 子. れ た 封 入体 は これ らの管 状 構 造 物 で充 満 され,形 成. 群 を認 め る こ と が あ る.つ ま り図5の 上 部 にみ られ. 初 期 に み られ た. るガ ラ ス面 上 の粒 子 の 配 列 像 の 如 きで あ る.こ の 一. った.. 部 を強 拡 大 し た図6で,粒. 子 が球 状 を呈 してい る こ. cleararea. は 全 くみ られ な くな. つ ぎは細 胞 質 内封 入 体 に つ い て で あ るが,図10a.. とが一 層 よ く判 り連 鎖 状 に配 列 した 粒子 の大 きさ は. b. cは 細胞 質 内封 入体 の一 部 を示 す もの で あ る.封. 約150〜340nmで,牛. 疫 ウ ィル ス の 大 き さにほぼ一 致. 入体 は形 が不 整 形 で細 胞 質 と比 較 して 電 子 密 度 が 高. して い る.そ こ で これ らの 粒 子 が ウ イル ス粒 子 で あ. くな って い るの が特 徴 で あ る.そ して 細 胞質 内 封 入. るか否 か を知 る た め に次 の 如 き実験 を行 っ た.す な. 体 の形 態 構 造 は3種 類 に大 別 す る こ とが で き る.す. わ ち,ウ イ ル ス感 染MDCK細. 胞 を ガ ラス 面 か ら静. な わ ち,一 つ は細 胞 質 内 に毛 球 の よ うに配 列 し た フ. か に剥 離 し,そ の浮 遊 液 を撹 絆 せ ず そ の ま ま一 部 を ネ ガ テ ィブ染 色 して 連 鎖状 に 配 列 した粒 子 群 を求 め. ィラ メ ン ト状 構造 物 の集 塊 像(図10a)で あ り,他 の 一 つ は 図10aで 認 め られ た構 造 物 よ りは っ き りし た. て観 察 す る方 法 お よ び この系 か ら産 生 され た精 製 ウ. フ ィラ メ ン ト状 構 造 物 の集 塊(図10b)で. イ ル ス粒 子 の ネ ガ テ ィブ染 色 像 と走 査 電 顕 像 と を同 一 視 野 の 同 一 粒 子 に つ い て比 較 観 察 す る方 法 と を行. らに 一 つ は細 胞膜 下 に み られ る フ ィラ メ ン ト状 構 造 物 の 粗 な る集 合像 で,そ れ らは 明瞭 な管 状 構 造 を呈. った.図7は. す る もの で あ り(厳 密 に は封 入 体 と い うこ とは で き. 連 鎖状 に 配 列 して い る粒 子 の ネ ガ テ ィ. ブ染 色 像 で あ り,大 きさは約190〜200nmを. 呈 し,図. な い か も しれ な い が)(図10c),ま. あ る.さ. た迂 曲 して走 り束. 6で 観 察 され た粒 子 と同 じた ぐい の もの を観 察 して. 状 配 列 を示 さず,い ず れ もそ の 巾 は約16〜18nmで. い る もの であ る.ま た 図8aは. 核 内 の もの よ りは 若干 太 くな って い る.以 上 が細 胞. 精 製 ウ イ ル ス粒 子 の. ネ ガ テ ィブ染 色 像 を示 し,図8bそ. の 粒 子 自 体 を走. 質 内 封 入 体 に 関 す る所 見 で あ る.. 査 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 した もの で あ る.こ れ らの 比 較. つ ぎは 細 胞 膜 部 の 変 化 で あ るが管 状 構 造物 が 次 第. か らウ イ ル ス粒 子 の ネ ガテ ィブ染 色 像 と走 査 電 子 顕. に 集 合 して くる部 分 附近 の細 胞 膜 に更 に 一 層 の 電 子. 微 鏡 像 の 一 致 して い る こ とが わ か り走 査 電 子 顕 微 鏡. 密 度 の 高 い 膜 様構 造 が 出来 上 り(図11),ま. で観 察 され た粒 子 は牛 疫 ウイル ス粒 子 で あ る こ と が. ロ ビ リの先 端 部 に も類 似 の 膜様 構 造 が観 察 され(図. 確 認 で きた と考 え る.な お,ウ イ ル ス非 感 染 細 胞 試. 12)こ の 直 下 の細 胞 質 に も図10cで 示 し た と類 似 の. 料 には この よ うな 粒 子 をみ る こ とが で きなか っ たの. 管状 構 造物 が 認 め られ る.マ イ ク ロ ビ リの 多 くが 観. は 勿 論 で あ る.. 察 で きる が(図11),こ. 第2節. た マイク. れ は さ きに み られ た走 査 電 子. 透 過電 子 顕微 鏡 に よ る観 察. 顕 微 鏡 像 の連 鎖 状 粒 子 と一 致 す る もの で あ る .そ し. 牛 疫 ウ ィル ス感 染 細 胞 内 に認 め られ る光 学 顕 微 鏡. て マ イ ク ロ ビ リの 中央 部 か ら球 形 粒 子 が 出芽 して い. レベ ル で の特 異 的所 見 は,核 内封 入 体 お よ び細 胞 質. る像 が認 め られ るが これ も走 査 電 子 顕 微 鏡 像 の所 見. 内 封 入 体 の形 成 で あ り,こ れ らの超 薄 切 片 像 を観 察. と一 致 し て い る.. した結 果 は 次 の 如 くで あ る.. 細 胞 膜 面 や マ イ ク ロ ビ リか ら出芽 して放 出 され た.
(4) 338. 赤. 塚. 球 形 粒 子 つ ま り ウ イル ス粒 子 を拡 大 して図13に 示 し て い る.こ れ らウ イ ル ス粒 子 の 形 態 は 大 小不 同 の 凹. 和. 也. 部 分 に相 当 す る もの で あ る. 図19は ウイ ル ス接 種 後5日 目 のMDCK細. 胞 の核. 凸類 球 形 で一 部弯 曲 を呈 す る もの も認 め られ るが,. 内 に み られ る封 入 体 で,細 胞 質 内封 入 体 と同 様,エ. 矢 印 の ウ イル ス は 円形 に近 い もの と思 われ る(図13).. オ ジ ン好 性 で あ り,形 は 楕 円 形 に 近 く,封 入 体 周辺. 成 熟 ウ イ ル スの 大 き さ も100〜400nmで. に は明 量 を示 して い る.こ れ に対 応 す る切 片 像 は 図. かな りの多 形. 9a,. 性 を示 す. 以 上 は超 薄 切 片 に よ り得 られ た ウ イル ス 粒 子 の形 態 で あ るが,こ れ らウ イ ル ス粒 子 を1%モ 酸 ア ンモ ン で ネ ガテ ィ ブ染 色 した像,図14は が約450nmで. リブデ ン 大 きさ. あ り,粒 子 表 面 に は長 さ約8nmの. ス. b, cに 示 し て い る.. 光 学 顕 微 鏡 に み られ る封 入 体 周 辺 の 明暈 は電 顕 像 で はみ られ な い.封 入 体 に対 す る光 学 像 と電 顕 像 の 相 違 点 で あ る. 以 上,走. 査 電 顕 像,透. 過 電 顕 像 お よ び光 顕 像. パ イ ク が観 察 され る 上正 常 な ウイ ル ス粒 子 像 を示 す.. で 得 られ た 諸 性 状 を 総 括 し た もの が 表1で. 変 っ た形 態 を示 す もの と して は 図15aに み られ る如. さ らに牛疫 ウイ ルス に よ る培養 細胞 の感 染 スペ. き長 さ約1μmの. フ ィラ メ ン ト状 を示 す ウイルス粒 子. 像 も認 め られ る.こ の ウ イ ル ス粒 子 内部 に は 図15b. あ る.. ク トル を教室 保 存 の7種 類 の細 胞 に つ い て 行 って み た.犬 由 来 の細 胞 で あ るMDCK細. に示 す如 き ヌ ク レオ カ プ シ ドが くみ 込 まれ て お り, この 構 造 物 は 中 空 で 綾 杉状 配 列 を した カ プ ソ メ ア が. PS細 胞,サ. み られ,カ. 示 した.し か し マ ウ ス由 来 のL細 胞 の み は,他 の細. プ シ ドの 巾 は 約17nmで. 中 空 が6nmで. あ. る.こ の よ うに ネ ガ テ ィブ染 色 像 に よれ ば,そ の 多 形 態 性 は よ り 著明 とな り大 きさ も100〜450nmで に600nm以. FLお. 胞 は勿 論 の こ と,. 人 由 来 のHeLa,. よ びJTC‑3細. ル 由来 のVer0細. 胞,豚 由来 の. 胞の全てに感 受 性 を. 胞 種 よ り も感 受 性 が 低 い.. 時. 第4章. 考. 察. 上 の大 きさの もの が 見 られ る こ と もあ る.. 第3節. 牛 疫 ウ イ ル ス は麻 疹 ウ イ ル ス や ジ ス テ ンパ ー ウ イ. 光学 顕 微 鏡 に よ る観 察. つ ぎに 光 学顕 微鏡 で牛 疫 ウ イ ル ス感 染MDCK細 胞 の変 性 効 果 を ヘ マ トキ シ リン･エ オ ジ ン染 色 を し. ル ス と共 通 抗 原 を持 つ1〜3)ウイ ル ス群 で あ る. これ らウ イ ル ス粒 子 そ の もの の微 細 構 造7.10)や ウ. て観 察 した.染 色 試 料 の 採 取 は電 子 顕微 鏡 試 料 採 取. イル ス の成 熟,放. と 同様,経. は 多 い.そ. 時 的 に行 った.. 図16は 非 感 染MDCK細. 胞 を示 して お り,この 細胞. の形 は,走 査 電 顕 像(図1)で. み られ た もの と類 似. の形 が観 察 され る. この正 常MDCK細. 出 の過 程 に 関 す る形 態 学 的 な報 告11脚. して 牛疫 ウイ ル ス の形 態 はPlowrightら7）. やTawaraら10)の. 研 究 が あ り,大 き さは150〜600. nmで ヌ ク レ オ カ プ シ ドは16〜18nmと の ウ イ ル ス と麻 疹,ジ. 胞 単 層 に牛 疫 ウ イ ル ス を接 種. 認 め たが,こ. ス テ ンパ ー ウ イ ル ス との 比 較. 研 究 で は 区 別 がつ きに くい とTawaraは. 結 論 してい. す る と3〜4日. で 多核 巨大 細 胞 を形 成 し,ウ イ ル ス. る.10)また ウイ ル ス の成 熟,放. 出 に 関 す る研 究8.‑1. 接 種 後4〜5日. 頃 か らエ オ ジ ン好 性 の細 胞質 内 お よ. では い ずれ も感 染 細 胞 に核 内 お よ び細 胞 質 内 封 入 体. び核 内封 入 体 を作 る よ うにな る.こ れ が 牛 疫 ウ イル. を認 め て い る が成 熟,放. ス感 染 細 胞 が示 す 細 胞 変 性 効 果 の 主 な もの で あ り,. べ て が 明 らか に な って い る とは言 い難 い .そ れ は こ. MDCK細. れ ま で細 胞 表 面 に み られ る事 象 を 外側 か ら立 体 的 に. 胞 で は特 に著 明に み られ る傾 向 が あ る.. 図17は ウ イル ス接 種 後5日. 目 のMDCK細. 胞 であ. るが,細 胞 は融 合 を起 して多 核 巨大 細 胞 を形 成 し, 細 胞 単 層 の か な りの領 域 を 占 め,ま た か な りの数 の 細 胞 か らな りた って い る こ とが よ く観 察 され る.さ. 出 な どの過 程 に 関 し て はす. 観 察 す る こ とが極 め て 困難 で あ っ 仁 こ と にそ の 一 理 が あ る と言 え る. そ こで著 者 は 近 年 か な り普 及 して き た走 査 電 子 顕 微 鏡 を使 用 す る こ とに よ り表 面 を立 体 的 に観 察 す る. らに この 時 期 に な る と多 核 巨 大 細 胞 の 細 胞 質 内 に エ. こ と と従 来 か ら使 われ て い る透 過 電 子 顕 微 鏡 に よ り. オ ジ ン好 性 の封 入 体(矢. 得 られ る内 部 か らの 所 見 とを対 比 しつ つ 新 知 見 を与. 印)も 同 時 に観 察 され る.. 図18は ウ イ ル ス接 種 後5日. 目 のMDCK細. 胞中に. え よ うと し た わ け で あ る.. み られ る細 胞 質 内封 入 体(矢 印)を 示 し,こ の 封 入 体. まず 第 一 の 問題 は マ イ ク ロ ビ リに 関 す る もの で あ. の 形 は大 小 不 同 で封 入 体 周 辺 に は 明量 を持 ち,不 定. る.牛 疫 ウ イ ル ス感 染 細 胞 で は細 胞 融 合 を起 し多 核. 形 を して い る.こ の像 は 図2cの. 巨大 細 胞 を形 成 す る こ とは す で に 光 学 顕 微 鏡 に よ り. 走査電顕 鏡 の 多核. 巨大 細 胞 中 に少 し も り上 った個 所 と して観 察 され る. 確 認 され,こ れ が 細 胞 変 性(CPE)の. 標 識 とな って い.
(5) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細 表1. 牛 疫 ウ イ ル ス感 染MDCK細. 胞の電子顕微鏡的研究. 339. 胞 の走 査 電 顕,透 過 電 顕 お よ び光 顕 レベ ル に お け る観 察 結 果 の 総 括. る.こ の多 核 巨大 細 胞 を走 査 電 子 顕微 鏡 で観 察 す る. 第 に集 合 し,こ の部 分 の細 胞 膜 が修 飾 され て電 子 密. と,正 常 細 胞 と多 核 巨大 細 胞 との境 界 は は っ き り区. 度 の 高 い膜 に変 化 して い るの が み られ る.そ して こ. 別 が で き多 核 巨大 細 胞 を形成 した細 胞 は扁 平 にな り. の 変 化 した 細 胞 膜 の 表 面 は さ らに一 層 の 膜 で被 れ る. マ イク ロ ビ リの減 少 が み られ た が この 所 見 は 麻疹 ウ. が,こ の 膜 は スパ イ ク層 が 膜様 に み え る もの で あ り,. イル ス27)やRSウ. その 部 分 が ウ イ ル ス粒 子 の 出 芽域 とな る.こ の 知 見. イ ル ス29)で も同様 の こ と がみ ら. れ て い る.し か しHVJ感. 染 細 胞 の 場 合 には逆 に細 胞. は マ イ ク ロ ビ リ内部 で も観 察 され るが,連 鎖 状 に配. 表 面 の マ イ ク ロ ビ リが発 達 し肥 厚 し て くる とい う報. 列 した ウ ィ ル ス粒 子 は マ イ ク ロ ビ リか ら徐 々 に引 続. 告30)が あ り,細胞 融 合 を お こす 点 で は い ず れ の ウ イ. き出芽 した結 果 この よ うな配 列 を示 し て い るも の と. ル ス も一 致 して い るが 表 層 の マ イ ク ロ ビ リの行 動 は. 思 わ れ る.. 逆 の現 象 を示 して い る.こ の こ とは牛 疫 ウ イ ル ス の 場合 は. fusion from. 合 は"fusion. from. with. with. in"で あ り, HVJの. out"で. さ らに 核 内 お よ び細胞 質 内 封 入体 部 に み られ る管. 場. 状 構 造 物 の 相 互 関 係 に つ い て で あ るが,い ず れ もヌ. あ る こ との相違 に. ク レ オカ プ シ ド様 の 構 造 物 で あ り,た だ それ の大 き. よ るの か,ま た は感 染 実 験 に用 い た細 胞 の 種 類 の違. さ が異 な っ て いて,核. い に よ るの か も しれ な い と考 え る.ま た マ イ ク ロ ビ. の が僅 か に大 きい,こ の こ とか ら核 内 の もの が核 膜. 内 の もの よ り も細 胞 質 内 の も. リは多 核 巨大 細 胞 を形 成 し た部 分 で は 明 らか に減 少. の核 孔 を通 じて細 胞 質 内 に移 動 し細 胞 質 内 に封 入 体. し ては い るが完 全 に 消失 して い る わ け で な く一 部 残. が形 成 され るの で は な い か と い う考 え が お こ る.し. 存 して い る.そ して ウ イル ス に感 染 して も多核 巨大. か し,両 者 間 の 形 態 学 的 な移 行 像 が認 め られ な い の. 細 胞 を作 らな い 単 一 感 染細 胞 の場 合 に は正 常細 胞 よ. で,少 な くと も形 態 学 上,両 者 の関 連 性 に つ い て は. り僅 か に減 少 して い るに す ぎず,こ の理 由 に つ い て. い ま な お確 定 的 な こ とは言 え な い.. は全 くわ か らな い.. 最 後 に ウイ ル ス感 染 細 胞辺 縁 の マ イ ク ロ ビ リか ら. つ ぎに は細 胞 質 内 で形 成 され た管 状 構 造 物 と細 胞. 出芽 した 成 熟 ウ イル スの 電 子 顕 微 鏡 的 同 定 に は蛍 光. 膜 の関 係 につ い て で あ る が,こ れ らは細 胞 膜 下 に次. 抗 体 法24と 併 行観 察 を行 う方 法,そ れ と近年普 及 し.
(6) 340. 赤. 塚. つつ あ る免疫 走査 電顕法 で知 る方法 とがあ る. Kumon ら28)は イ ン フル エ ンザ ウ ィル ス感 染MDCK細 で の ウ イ ル ス抗 原 の局 在 をT4フ. イル ス 感 染Vero細. 分 布 をpolymethyl. 也 以上,得. 胞. ァー ジ を マー カ ー. と し た免 疫 走 査 電 顕 法 で 明 らか に し, Fuchss29)は RSウ. 和. られ た所 見 に考 察 を加 え た の で あ る が,. マ イ ク ロ ビ リ,融 合 細 胞 表 面,連 鎖 状 配 列 粒 子 その 他,細 胞 表面 微細 構 造 の観 察 結 果 は,走 査 電 子 顕 微 鏡 な しに は 得 られ な い もの で あ る.. 胞 表 面 の ウ イル ス抗 原 の. methacrylic. 第5章. plastic(PMP)粒. 子 を マ ー カ −に つ か って 同定 報 告 して い る.こ れ ら の 方 法 は い ず れ もウ イル ス抗 原,ウ. イル ス の 出芽 域. お よ び成 熟 ウ イ ル スの 同 定 に応 用 し得 るす ぐれ た方. 結. 語. 牛 疫 ウ ィル ス を接 種 したMDCK細. 胞 の示 す変 化. を細 胞 の 表 面 お よび 内面 か ら究 明す るた め に走 査 お よ び透 過 電 子 顕 微鏡 で観 察 し,次 の結 果 を得 た.. 法 で あ る.し か し著 者 は これ とは別 の 方 法 と して ウ. (1) ウ ィ ル ス感 染 に よ り生 じた 多 核 巨大 細胞 は扁. イ ル ス液 か らウ イ ル ス を精 製 し,ネ ガ テ ィブ染 色 を. 平 で対 照 の正 常 細 胞 と容 易 に 区別 出 来 得 た.ま た こ. して,そ の構 造 像 か らウ イル ス粒 子 で あ る こ とを確. の 多核 巨大 細 胞 表 面 の マ イ ク ロ ビ リは 正 常 細 胞 の そ. 認 した後 に,同 一 視 野 を走 査電 顕 で観 察 し同 定 す る. れ と比 較 し た場 合,減 少 は 著 しい が,し か し完 全 に. 方 法 を とっ た.す な わ ち,ネ ガテ ィブ染 色 す る際 に. 消 失 して しま う もの で もな か っ た.. マ ー クの 入 っ た グ リ ッ ドを使 用 して ネガ テ ィブ染 色. (2) ウ イル ス に感 染 して も多 核 巨大 細 胞 を作 らな. 像 で ま ず ウ イル ス粒 子 で あ る こ とを確 認 し て お き,. い 単 一 感 染細 胞 は幾 分 収 縮 す る以 外 は正 常 細 胞 と比. そ の 後 そ の 粒子 を走 査 電 顕 用 試 料 に 作 製 し,同 一 物. べ て 外 面 的 に は それ 程 大 きな変 化 を示 さ な か っ た .. を観 察 した か ら これ で 同定 し た こ とに な る.た だ し. (3) 細 胞 内面 の変 化 の 観 察 で は 核 内 と細 胞 質 内 封. この 場 合 は ネ ガ テ ィブ染 色 像 にな る ウ イル ス粒 子 の. 入 体 との形 態 学 的 相 互 関 係 は 明 らか に で きな か った.. 形 態 が す で に確 認 され て い る場 合 に お い て の み有 効 で あ る.. (4) ウ イ ル ス粒 子 の 放 出 は 感 染 細 胞 表 面 お よ び そ の辺 縁 の マ イ ク ロ ビ リか ら も出芽 して い るの を確 認. もう一 つ 注意 す べ き点 は ウ イ ル ス粒 子 の大 き さが ネ ガテ ィブ染 色 像 と走 査 電 顕 像 では 若干 異 な る こ と で あ る.す な わ ち厳密 に 言 え ば走 査 電 顕 像 の場 合 に. した. (5) 走査 電 子顕 微 鏡 像 でみ られ た150〜340nm粒 子 の 連 鎖状 配 列粒 子 は感 染 細 胞 を 剥 離 した標 本 の ネ. は 金 属 の 蒸 着 とい う過 程 が入 る た めに 蒸 着 した 分 だ. ガテ ィブ染色像 と精 製 したウ イル ス 粒 子 の ネ ガ テ ィブ. け大 き くな る こ とで あ る.. 染 色 像 と を同 一 視 野 で比 較 観 察 す る こ とに よ り,牛. 尚,光 学 顕 微 鏡 像 で 封 入体 周 辺 にみ られ る明量 が, 電 子 顕 微 鏡 に よ る切片 像 で は全 くみ られ な い.こ れ. 疫 ウ イ ル ス で あ る こ と を同 定 した, (6) 成 熟 ウ イル ス粒 子 の形 態 は走 査電 顕 像 切 片像. は それ ぞれ 固 定 法 の 相違 に よ る もの で あ って,光 学. お よ び ネ ガ テ ィブ染 色像 か ら,大 小 不 同 の不 整 形 で. 顕 微 鏡 用 染 色 標 本 作 製 時 の 固定 法 に よ る人 工 産 物 に. 多 形 態 性 を示 し,大 き さは 約150〜340nmで. 外 な らず 電 子 顕 微 鏡 像 の 固定 法 が正 しいの で あ る.. き らに ネ ガ テ ィブ染 色 像 か らウ イ ル ス表 面 に約8nm. ま た, Twara31)は ジ ステ ンパ ー ウ イル ス感 染 細 胞. の ス パ イ ク が存 在 し,内 部 には 直 径17nm,中. あ っ た.. 空が. 細 核 内 封 入 体 が 存 在 す る核 に お い て,感 染 して い る. 6nmの. に もか か わ らず,細 胞 分 裂 を く り返 して行 っ て い る. メ ン ト状 の長 さ約1μmの ウ イ ル ス様 の もの も認 め られ. こ とを報 告 して い る.著 者 も同 様 の所 見 が牛 疫 ウ イ. た.し か し走査電 子顕微 鏡で これ らの微細 構造 を観 察す. ル ス感 染MDCK細. る こ とは,現 時 点 で は無 理 で あ った.. 胞 に お いて み られ るの で は な い. か と注 意 深 く観 察 し た が確 認 す る こ とが 出来 な か っ た.し か し走 査 電 顕 像,透 過 電 顕 像 お よ び光 顕 像 に よ る所 見 か らこの 牛 疫 ウ ィル ス は ジス テ ンパ ー ウ ィ ル ス と類 似 す る点 が あ ま りに も多 く当 然,牛 疫 ウ ィ. ヌ ク レ オカ プ シ ドが認 め られ た.ま た フ ィラ. (7) ウ イ ル ス粒 子 出芽 部 位 の細 胞 膜 は,電 子 密度 の高 い膜 とな る こ とを観 察 した. (8) 光学 的染 色標 本 で み られ る封 入 体 周 辺 の 明量 は固 定 法 に よ る人 為 的 な もの で あ っ た.. ル ス感 染 細 胞 中 に お い て も細 胞 分 裂 が お こな わ れ て 謝. い る とい うこ とは充 分 考 え られ る こ とで あ る.. 辞. 感 染 ス ペ ク トル に関 して, L細 胞 の み が 他 の細 胞. この 稿 を終 る に あ た り,ウ イ ル ス株 を特 別 に 分 与. よ り も感 受 性 が低 い が大 量 接 種 し た場 合 に は 感 染 が. して 下 さ っ た故 中村〓 治 先 生 に は衷 心 よ り感 謝 の 意. 成 立 す る よ うで あ る.. を捧 げ ます.ま. た こ の実 験 に終 始 御 懇 篤 な る御 指 導.
(7) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細. 胞 の 電子 顕 微 鏡 的研 究. 341. を賜 った俵寿太郎教授 および走査電顕 でひとかたな. 院 長,金 重 浩 彰 副 所 長 お よ び弓 削風 見 子,白 神 睦 子. らぬお世 話にな った中央病院附属研究所の金重哲爾. 両 研 究 員 に も深 甚 の 謝 意 を 表 しま す.. (本論文 の要 旨 は第22, 25, 30回 日本細 菌 学 会 中 四 国 支 部総 会 に お い て発 表 し た.). 文. 1). Imagawa. D.. T.. 2). Imagawa. D.. T.,. 3). Shishido. A.,. ,. Progr.. 22,. 4). Plowright. 5). Plowright. 6). Tajima. 7). Plowright. 8). Breese. S.. 9). Tajima. M.,. 10). Tawara. J.,. 11). Breese. M.. P.,. and. Med.. Yamanouchi. Virusforsch.,. 82,. Goret. W.,. and. W.,. J.. , W. ,. ,. 10,. Hikita. R.. Comp.. Proc.. N.. 160-193,. M.,. D.,. Path.. A.. S.,. 46,. 1119-1123,. 1960.. 1968.. Sato. 62,. Virology,. 17,. Carl. ,. Ushijima. T.. ,. Hayashi. H.,. Nature,. , 69,. Path.,. J.. 135-138,. M.,. T.. ,. Fukuda. A.,. and. Kobune. F.,. Arch.. ges.. 1967.. J.. and. ,. Ferris. Amer.. J.. Virol.,. K.. 3•]4,. Adams. 献. 179,. 152-172,. 1957.. 1959.. 221-228,. 1971.. 118-122,. 1962.. Virology,. 19,. Kishi. 316,. S.. 340-348,. , and. Akatsuka. 1963.. Nakamura. K.,. J.,. Kanemasa. Y.. Virology,. , Okabe. A.,. 31,. 92-100,. and. Hayami. 1967. Y.,. Med.. Biol.,. 1971.. S.. , J.. Gen.. 12). Waterson. 13). Tawara. J.,Goodman. A.,. 14). Tawara. J.,. 15). Tawara. J.. 16). Norrby. E.,. 17). Waterson. 18). Matsumoto. 19). Nakai. 20). Cedric. Virology,. Laurence. ,. R.. 14,. and. N.. Arch. ,. R.,. L.. T.,. P.. , Arch.. F.. ,. Ges.. Virusforsch.,. , 16,. 57-80,. Med.,. 13,. Howatson. A.. and. Lawrence. J.. Adams. J.. G..,. M.,. Virology,. 15,. Virology,. 14,. 379-382,. 410-416,. 1961. 1961. .. 1965.. Virusforsch.. ,. Cruicshank and. 1964.. Yamaguchi. F.. and. D.. 322-323,. Ges.. Bull.. Shand. S.. 25,. 1973.. A.,. Imagawa. Magnusson. ,. 121-125,. Kanarek. ,. 84-88,. Virology,. A.. T.,. G., J.. Virus,. 20,. Rachel. D.. 17,. 167-189, F.,. S.,. 1965.. 1966.. Virology,. and. 443-447,. 1965.. 38,. Murray. 50-67,. B.. B.. ,. J.. 1969. Virology,. 8,. 318-329,. 1971. 21). Bussell. R.. 22). Bussell. R.,. 23). Imagawa. 24). Karzon. 25). Bussell. 26). Yamanouchi 29,. ,. D.. and. Karzon. D.. T.. and. Karzon. D.. T.,. T.. D.. T.. R.. ,. , Arch. , and. and K.. 90-100,. Ges. Bussell. Karzon ,. D.. Shishido. A.. ,. Arch.. Ges.. Virusforsch.. Arch.. Ges.. Virusforsch.,17,. Virusforsch.. ,. R.. 130,. , Science,. T.. 17,. , Virology,. , Kobune. 203-215,. Fukuda. 163-182,. 1965. 1965.. 1965. 1959.. 589-600, A.,. 17,. 183-202,. 1708-1709, 18,. F.,. ,. 1962. and. Sato. T.,. Arch.. 1970.. 27). Tawara. 28). Kumon. H.. J. ,. ,. 29). Fusch. H.. ,. 30). Sugiyama. 31). Tawara. Electron-Microscopy, Virology, and. Bachi. K.,and J.,岡. 74, T.. Amano. 11, 93-103, , J.. Ultrast.. Y.,第32回. 山 医 学 会 雑 誌,. 95-103,. 80,. 1976.. 1976 Research,. 52,. 114-119,. 日本 電 子 顕 微 鏡 学 会 抄 録,. 875‑880,. 1968.. 1975.. 133,. 1976.. Ges.. Virusforsch. .,.
(8) 342. 赤. 塚. 写 図1. 培 養5日. 目の 正 常MDCK細. 和. 真 説. 也. 明. 胞 の走査 電子. (9a:×40,000,. 顕 微 鏡 像 を示 し,こ の 細 胞 表 面 に は マ イ ク ロ ビ リや. 図10 a, b,. blebsが 多数 認 め られ る.. 染MDCK細. 疫 ウ イル ス接 種 後5日. 目の 感. 胞 の 走 査 電 子 顕 微鏡 像 で 多 核 巨大 細 胞. を形 成 して い る.特 に2c, dは 多 核 巨大 細 胞 を形 成 した部 分 と正 常 細 胞 の 境 界 が よ く観 察 され る.2bの 矢 印 は核,. 2cの 矢 印 は ガ ラス 面,白 の 矢 印 は細 胞. 質 内封 入 体 を示 す. (2a:×1.000, 図3. 2b:×800, 2c:×300,. 感 染MDCK細. 9c:×140,000). 胞 質 内 封 入 体(CI)を. 示 し て お り10. aは 毛 球 状 配 列 し た フ ィ ラ メ ン ト状 構 造 物 を 示 し,. (×4,000) 図2 a, b, c, d牛. 9b:×140,000, c細. 2d:×1000). 胞 の 多核 巨大 細 胞形 成 部 分. 10bは10aで 10cは. 認 め ら れ た も の よ り は っ き り し て い る.. 明 瞭 な 管 状 構 造 物 を示 し,巾. は 約16‑18nmで. あ る. (10a:×86,000, 図11,. 10b:×86,000,. 12出. 10c:×82,000). 芽 に よ り放 出 さ れ た ウ イ ル ス 粒 子 と. マ イ ク ロ ビ リ を 示 し て い る .電. 子 密度 の 高 い 膜 を有. す る 粒 子 が ウ イ ル ス 粒 子 で あ り,マ. イ ク ロ ビ リか ら. 出 芽 し て い る粒 子(図12の. 観 察 さ れ,連. 鎖. 認 め られ る.ま. た. 状 に な っ た 粒 子(図11の. 矢 印)が 矢 印)も. の拡 大 像 で あ り,正 常 細 胞 に比 べ て マ イ ク ロ ピ リの. 細 胞 表 面 に は 電 子 密 度 の 高 い 部 分(図11,. 減 少 が認 め られ る.(×10,000). が 認 め られ る.. 図4. (11 :×50,000,. さ らに拡 大 し た像 で,こ れ ら細 胞 表 面 には. ウ イル ス様 球 形 粒 子 が散 在 して い る.. 図13遊. (×20,000) 図5. で あ る. (13:×100:000) 図14. 1%モ. リブ デ ン酸 ア ン モ ン に よ る ネ ガ テ ィ. れ ず,辺 縁 部 に は多 数 の 連 鎖状 に配 列 した ウ イ ル ス. ブ 染 色 像 で あ る.大. 様 粒 子(大. に は 長 さ約8nmの. き さ約150〜340nm)が. 認 め られ る.. 12:×50,000). 離 ウ イ ル ス 粒 子 と マ イ ク ロ ビ リの 切 片 像. ウ イ ル ス感 染 単 一細 胞 を示 して い る.こ の. 細 胞 で は それ 程 激 し い マ イ ク ロ ビ リの減 少 が認 め ら. き さ は 約450nmで. 強 拡 大 像 で連 鎖 状 に 配 列 して い る ウ イ ル ス. (14:×175,000). (×50,000) 図7. 連 鎖 状 配 列 し た ウ イル ス粒 子 の1%モ. リブ. デ ン酸 ア ン モ ン に よ る ネ ガテ ィブ染 色像 で あ る.. b粗. bフ. で,. 15bは2%リ. 長 さ約1μmも 観 察 で き る.. (×111,000) 図8a,. 図15 a,. し て い る.染. 粒 子 を示 す.. 精 製 し た同 一 ウ イル ス粒 子 の ネ ガ テ. nmで あ り,8bの. 走 査 電 子 顕 微 鏡 像 と大 き さは ほ ぼ. 同 一 で あ る(矢 印).. 図9a, 9aは. 有 す る核 内封 入 体 を示 し,. 分 的 に何 本 か が 束状 に な って い る(矢 印). 9bは. フ. ィ ラメ ン ト状 構 造 物 の拡 大像 で あ り,縦 断 面 を示 し, 9cで. は一 部 横 断 面 像 で 明 らか な 管 状 構 造 を示 し, 空 が 約6‑7nmで. あ る.. 15aは. あ り両 側 に不 定形 の ウイ ル ス 粒 子 が 15bは. ウイ ル ス 粒 子 内部 に あ る ヌク レ は 約17nm,中. 空 が 約6nmで. あ る.. 図16. 15b:. ウ イ ル ス 非 感 染MDCK細. ×235,000) 胞(培 養5日. 目). の ヘ マ トキ シ リ ン ・エ オ ジ ン染 色 像 で あ る. 図17. この 内 部 に は フ ィ ラ メ ン ト状 構造 物 が認 め られ,部. 直 径 は約15〜17nm,中. リブ デ ン酸 ア ンモ ン. ン タ ン グ ス テ ン 酸 で あ る.. 牛 疫 ウ イ ル ス 接 種 後5日. の ヘ マ トキ シ リ ン.エ. 8b:×50,000). b, c核 内 封 入 体 を示 す超 薄 切 片 像 で あ る. clear area"を. 色 は15aが1%モ. (15a:×50,000,. 酸 ウランで 染 色 した像 で大 きさ約190. (8a:×100,000,. ィ ラ メ ン ト状 を 呈 し た ウ イ ル ス を 示. オ カ プ シ ドを 示 し,巾. ィブ染 色 像 と走 査 電 子 顕 微 鏡 像 で あ る. 8aは2%酢. ウ イ ル ス表 面. ス パ イ ク が 認 め ら れ る.. (×10,000) 図6. 12の 矢 印). 目 のMDCK細. オ ジ ン染 色 像 で,細. 胞 胞単層の. か な り の 部 分 を 占 め る 多 核 巨 大 細 胞 が 観 察 で き る. 矢 印 は 細 胞 質 内 封 入 体 を示 す. 図18. 多 核 巨 大 細 胞 を形 成 し て い る 細 胞 中 に 明 量. を持 った エ オ ジ ン好 性 の 細 胞 質 内 封 入 体 が認 め られ る(矢 図19. 印). 感 染MDCK細. 胞 の核 内 に エ オ ジ ン好 性 の. 核 内 封 入 体 が 認 め られ る(矢. 印)..
(9) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細. 赤. 塚 和 也. 胞 の 電 子 顕 微 的 的研 究. 論 文. 附. 図. 343.
(10) 344. 赤. 赤 塚 和. 塚. 和. 也 論. 也. 文. 附 図.
(11) 牛 疫 ウ ィル ス感 染MDCK細. 赤. 塚 和. 胞 の電 子 顕 微 的 的 研 究. 也 論 文. 附 図. 345.
(12) 346. 赤. 赤. 塚 和. 塚. 和. 也 論. 也. 文 附. 図.
(13) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細. 赤 塚 和. 胞 の電 子 顕微 的 的研 究. 也 論 文. 附 図. 347.
(14) 348. 赤. 赤 塚 和. 塚. 和. 也 論. 也. 文. 附 図.
(15) 牛 疫 ウ イ ル ス感 染MDCK細. 赤. 塚 和. 胞 の電 子 顕 微鏡 的研 究. 也 論 文. 附. 図. 349.
(16) 350. 赤. 赤 塚 和. 塚. 和. 也 論. 也. 文 附. 図.
(17) 牛 疫 ウ イル ス感 染MDCK細. 赤 塚 和. 也. 胞 の電 子 顕 微 鏡 的 研 究. 論 文. 附 図. 351.
(18) 352. 赤. 赤 塚 和. 塚. 和. 也 論. 也. 文 附. 図.
(19) 牛 疫 ウ イ ルス 感 染MDCK細. 赤 塚 和. 胞 の 電 子 顕 微鏡 的研 究. 也 論 文. 附 図. 353.
(20) 354. 赤. Electron. 塚. microscopic. 和. 也. studies. with. in MDCK. rinderpest. cells. infected. virus. by Kazuya Department. AKATSUKA. of Virology, Okayama University (Director:. For. the. purpose. to. electron. microscopic. rinderpest. virus. transmission lated. with. structures'in. these. (1). It. is. virus. microvilli on. (2). Even. with. the. normal. As. morphological inclusion It. surface. was as. (5). of. (6) by. cell. so. much. produced. by. Moreover,. markedly. less. the. than. those. completely.. that. changes. does. not. change. transform. exteriorly. it. was. not. into as. possible. inclusion. in. 6. be nm.. length.. (7). It tends. to has to. a. compared. to. body. clarify. and. any. cytoplasmic. The. specimen. halo is. artifact.. same. such. the. dense. out. in. a. the. field. 150•\340. by. of seen. also. scanning. electron. the. infected. formation. cell. with. scanning. In. about. purified. is. of. virus. irregular. in. and. parti. in 17. the size. on. nm. filamentous. in. and stained. negatively the. virus. diameter. virus-like. microscopy. shape. negatively. addition,. nm. been. picture. microscopy.. that. 8. have. stained. sections, nm.. about. chain. cells. morphology. spikes. from. negatively. infected. ultrathin. be. with. particles on. the. stain surface, the. about present. 1 stage. ultrastructures.. demonstrated. observable an. the. nucleocapsids can by. electron. arranged. the. of. budding cell.. comparing. the. about. there. detect. been be. in reveal. observed. However,. impossible. size by. from. presence. And. are the. microscopy,. ranged. the. can. of. in. virus. particles. size. shows. these. nm. electron. whose. particles surrounding. isolated. virus. picture. (8). the. intranuclear. virus. specimen. scanning. specimen,. lumen. 150-340 rinderpest. stained. Mature. size. out. virus. cells shape.. shrinkage.. microvilli. specimen. negatively. is. are. inocu. intracellular. follows.. flat. disappear. and. cells and. giant. surface. show. MDCK. as. their. scanning. surface. presented. of. cell. intracellular. that. from. be. particles. cles. ed. as. to. virus. it. little. between. confirmed. well. Particles. identified. ,um. a on. the. multinucleated. necessarily. the. with. in. briefly. giant. except. conducted. because. not. virus,. body.. (4). and. cells. by. correlation. be. not. rinderpest. changes. readily. does. observation. of. were. may. do. cell. cell. for. results distinguish. infected. giant. (3). The. microvilli. when. multinucleated. properties. studies. multinucleated. Yet. Prof. J. Tawara). observing. normal. these. cells.. the. by. to from. on. normal. ed. cells.. possible. rinderpest. evalute. Medical School, Okayama. that. the. cell. membrane. where. virus. particles. bud. membrane. around. the. inclusion. body. in. hematoxylin-eosin. stain.
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