バイオ分野のラマン分光法自由度の高い測定非破壊非接触非染色 ( プローブ不要 ) 細胞組織豊富な情報化学組成の情報分子レベルの詳しい構造情報 ( 二次構造官能基単位 ) Length Y (µm) 蛋白質製薬高い空間分解能

(1)

JASIS2015 新技術説明会

ここでしか聞けない！

バイオライフサイエンス分野における

（株）堀場製作所開発本部

2015年9月2日

(2)

バイオ分野のラマン分光法

■自由度の高い測定

・非破壊

・非接触

・非染色（プローブ不要）

■豊富な情報

・化学組成の情報

・分子レベルの詳しい構造情報

（二次構造、官能基単位

）

■高い空間分解能

・マッピング測定

20 25 30 35 Length Y (µm) 28 30 32 34 36 38 40 Length X (µm) 20 15 10 5 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 Y (µ m) -50 0 50 X (µm) 10 µm 10 µm 10 µm

製薬

蛋白質

細胞・組織

(3)

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

(4)

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

(5)

Ｅ

= hν

Ｅ：エネルギー

h ：プランク定数

ν：振動数

入射光

h

ν

₀

分子振動

エネルギー

h

ν

_i

ν

₀

レイリｰ散乱

ν

₀

＋

ν

_i

ラマン散乱

（ｱﾝﾁｽﾄｰｸｽ散乱）

レイリー散乱とラマン散乱

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50 Int

ens

ity

800 1 000

1 200

1 400

1 600

Raman shift / cm

-1

1416.7

882.0 1062.0

1128.0

1294.0

1370.0

1440.0

1642.0

1459.1

1169.7

分子構造に対応する特有のスペクトルパターンが得られる。

ν

₀

－

ν

_i

ラマン散乱

（ｽﾄｰｸｽ散乱）

(6)

分子

細胞

組織

蛋白質

脂質

バイオ系サンプルの階層

大きさ

nm

µ

_m

mm

(7)

600

800 1 000

1 200

1 400

1 600

1 800

Raman shift / cm

-1

1335.1

1660.4

1552.4

506.2

760.2 1012.4

1445.4

877.1 1361.1

545.3 ・分子固有のスペクトル→化学組成の情報

・分子の2次構造から官能基単位の知見

分子構造を反映するラマンスペクトル

Lysozymeのラマンスペクトル

S-S

Trp

Phe

Trp

δ

CH

2 _Trp

AmideI

(8)

細胞を構成する化学物質

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Int

ens

ity

/ c

nt

600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800

Raman shift / cm

-1

606.7 1646.2

1433.0

1566.0

1327.6

1303.7

1241.4

1197.1

1161.2

1114.5

991.1 1017.5

1051.0

1079.8

919.3

837.8

770.8

732.5

707.3

655.8

628.3 細胞のラマンスペクトル測定

細胞のラマンスペクトル

各成分のラマンスペクトルが重なって表れる。

蛋白質

_脂質

DNA

etc..

(9)

500 1 000

1 500

Raman shift / cm

-1

-4

-2

0

2 -5

0

1 1 1 1 1 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 Y (µ m) -10 -5 0 5 10 X (µm) 1 µm

細胞の化学成分の分布をラマンイメージングとして

可視化できる。

各イメージを構築するモデルスペクトル

観察画像とラマンイ

メージの重ね書き

細胞のラマンイメージング

ﾐｴﾛｰﾏ細胞

各点の特徴的なラマンスペクトルを固有の

成分として定義したモデルスペクトル

色の濃さが濃度に

対応する

(10)

人甲状腺腫瘍のラマンスペクトル

初期腫瘍化組織

小さなコブ

/ 甲状腺腫

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Intensity (a.u.) 600 800 1000 1200 1400 1600 Wavenumber (cm-1) 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Intensity (a.u.) 600 800 1000 1200 1400 1600 Wavenumber (cm-1)

悪性腫瘍化組織

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Intensity (a.u.) 600 800 1000 1200 1400 1600 Wavenumber (cm-1)

Data courtesy of Prof. M. Manfait Laboratoire de Spectroscopie

Biomoleculaire, UFR de Pharmacie, Reims, France.

(11)

人甲状腺の正常組織と腫瘍化組織の

薄片化試料（厚さ 7 µm）のラマンスペクトル

正常組織

腫瘍化組織

0.25

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00 In

te

ns

ity

(a

.u

.)

600

800 1000

1200

1400

1600

Wavenumber (cm

-1

₎

C-OH

Glucids

A

T

A/G

C-C

Lipids

CH

3 Lipids

CO-O-C

Phospholipids

C-S

S-S

Phe

Amide III

Amide I

Tyr

Trp

Data courtesy of Prof. M. Manfait Laboratoire de Spectroscopie Biomoleculaire, UFR de Pharmacie, Reims, France.

(12)

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

(13)

励起波長の選択→長波長励起の活用

共焦点光学系→深さ方向分析

DuoScan（レーザ走査）→水面の揺れを防止

倒立顕微鏡→培養細胞観察に最適

バイオ系試料の測定手法のポイント

(14)

35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 Intensity (a.u.) 500 1000 1500 2000 2500 3000 Wavenumber (cm-1)

633 nm

25000 20000 15000 10000 5000 0 Intensity (a.u.) 500 1000 1500 2000 2500 3000 Wavenumber (cm-1)

785 nm

70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 Intensity (a.u.) 500 1000 1500 2000 2500 3000 Wavenumber (cm-1)

532 nm

レーザ～励起波長の選択～

Raman shift / cm

-1

Raman shift

/ cm

-1

Raman shift

/ cm

-1

■問題点

蛍光による妨害により明瞭なラマンスペ

クトルが得られないことがある。

■解決方法

NIR のレーザを使うことで、蛍光のバック

グラウンドの干渉をさけることができる。

ただし、ラマン散乱強度

は1/λ

4 に比例

する。

最適なスペクトルを得るために、レーザ

の選択は非常に重要

(15)

ピンホールのサイズを制御する

事により、分析されるポイントの

空間的広がりをコントロールする

ことができる。

共焦点ピンホール

レンズ

対物レンズ

共焦点性～共焦点光学系の説明～

焦点位置より下層からの発光は、

ピンホールの後ろで焦点を結ぶ。

焦点位置より上層からの発光は、

ピンホールの手前で焦点を結ぶ。

焦点位置付近からの発光のみが、

ピンホールを通り抜けることができる。

(16)

角質層水分含量の深さ方向分析

- ラマンスペクトルによる

水分含量の測定

:

3400cm

-1

_{の水酸基（－}

_{OH）のピー}

クと

2950cm

-1

の脂質のピークとの強

度比を用いて、水分含量を評価する

ことができます。

In vivo 測定で、保湿クリーム塗布前後で

の水分含量を、皮膚下深さ方向の分布を

評価しました。

(17)

角質層水分含量の深さ方向分析

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8

Water Ra

nge Area (a.u.

)

0 100 200 300 Depth (µm) 1.3 1.2 1.1 1.0

Wate

r Ra

nge Ar

ea

(a.

u.)

0 100 200 300 Depth (µm)

Non hydrated skin

Hydrated skin

v

(OH) バンド領域

の面積強度変化

↓

ν

(OH) ,ν(NH)

↓

aromatic ν (CH）

未処理の皮膚

_{保湿クリームを塗布した皮膚}

深さ方向

↓

水分含量

0

100

200

300 Depth / mm

0

100

300 Depth / mm

200

(18)

３Dイメージングによる細胞内物質の可視化

Raman shift (cm-¹)

Int

ens

ity

(

count

s/

s)

500 1 000

1 500

4 000

6 000

8 000

10 000

クチナシの

葉表面

水浸レンズ

共焦点性を活かすことで

3次元のラマンイメージが取得可能

(19)

ポイントマッピング

１回のレーザ照射で１つのポイントから１つのスペクトルを測定する。

ステージを２次元的に走査しながら測定を続けることで、ラマンスペクトルイメージ

を得る事ができる。

ステージを動かし、各点からスペクトルを取る。

Sample

CCD

Spectral Image

レーザ

グレーティング

(20)

ムービング

ミラー

CCD

Spectral Image

グレーティング

DuoScan

ステージを動かすのではなく、

レーザーを走査して測定する。

水面の揺れを防止

(21)

Human Reproduction, 2011, 26, 1641–1649

各イメージを構成する

スペクトル

精子の各部分で化学

組成が異なることが分

かった。

主成分分析などの詳しい解析

の結果、損傷を受けた精子頭

部を可視化することができた。

正常部位

損傷部位

ヒト精子頭部のラマンイメージング

(22)

倒立型ラマン顕微鏡 XploRA-INV

生細胞

レーザ走査

レーザ

検出器

DuoScan

倒立顕微鏡

ラマン分光器

XploRA-INV

(23)

倒立型ラマン顕微鏡実際の測定の様子

Data courtesy of Prof. Igor Chourpa, Université de Tours, France.

・

Working Spaceが広い→マニュピレーションしやすい

・培養細胞観察がラク →ピント合わせなく、サンプル交換可能

生細胞

観察画像

Hyperspectraｌ

蛍光イメージ

(24)

SERS分光のアプリケーション

～

ガン細胞に取り込まれた薬物の分布～

2 µm

DNA

銀粒子に吸着

した薬物

極性細胞質領域

細胞膜と

オルガネラ

全イメージ

の重ね書き

SERS

薬物複合体からの蛍光

Courtesy of Igor Chourpa, Pharmacy Faculty, University of Tours

Intensity (a.u.)

650

700

750

800

850 Wavelength (nm)

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 SERS

Intens

ity

(a.u.)

650

700

750

800

850 Wavelength / nm

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

0.8 ガン細胞に取り込まれた薬物

からの

SERSスペクトルを観測

することができた。

細胞内の薬物の分布情報をラ

マンイメージとして得ることが

可能である。

(25)

ラマン分光光学系を利用した

共焦点蛍光分光イメージング

-10 0 10 20 Y (µ m ) -20 0 X (µm)

4 µm

光学顕微鏡

イメージ

蛍光強度

（非分光）

共焦点

蛍光スペクトル

マップ

-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 Y (µ m) -50 0 50 X (µm) 10 µm 10 µm 10 µm -50 0 50 Y ( µ m) -50 0 50 X (µm) 23.7 µm 10 µm -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 Y (µ m) -50 0 50 X (µm) 10 µm

Courtesy of Igor Chourpa,

Pharmacy Faculty,

University of Tours

核のみ

細胞内物質と薬物との

相互作用の様子が

可視化されている。

がん細胞中の抗がん剤 (doxorubicine)

ナイルレッド（NR）染色された牛体外受精胚

色の違いは

NR分子が

異なる極性の環境に

存在していることに

対応する。

(26)

-80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 Y (µ m) -50 0 50 X (µm) 10 µm 10 µm 10 µm

ラマン分光法によるバイオ系試料の測定～まとめ～

・非破壊・非接触で、細胞や組織の化学組成を

可視化できる。

・蛍光観察のような染色が必要なく、無標識で

測定可能。

・共焦点光学系、イメージング機構を用いて、

高精細なラマンイメージが取得可能。

(27)

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

(28)

非破壊・非接触で測定できるラマン分光は医薬品

開発・製造現場など、様々な場面で活躍している。

低分子医薬品をはじめとする医薬品

製薬分野におけるラマン分光法

Distribution of three components

Starch

-

Cellulose

-

MgStearate

(29)

合成

結晶化

製粉

混合

造粒

乾燥

カプセル充填

打錠

コーティング

包装

完成

結晶多形

成分分布

品質管理

0 2 000 4 000 6 000 Y (µ m) 0 5 000 10 000 15 000 X (µm) 500 µm 500 µm 500 µm 500 µm

→透過ラマン

→ラマンイメージング

→スペクトル解析

医薬品の製造プロセス

■合成～乾燥

■充填～包装

(30)

合成

結晶化

製粉

混合

造粒

乾燥

カプセル充填

打錠

コーティング

包装

完成

結晶多形

→スペクトル解析

医薬品の製造プロセス

■合成～乾燥

■充填～包装

(31)

■ラマンの優位性

・ラマンスペクトルは結晶構造を敏感に反映するため、

結晶多形の違いを調べるのに有効な手法

・X線回折法（XRD）と比較して微量で測定が可能

（顕微ラマンの高い空間分解能が活かせる）

■背景

・結晶多形は薬効性に関わることから、それを制御する

ことが重要な課題とされている。

G. L. Bourdon, F. Adar, Readout, 2003, 27, 50-53

(32)

結晶化～ラマン分光による結晶多形解析～

異なる多形を持つタイレノール（解熱鎮痛剤）のラマンスペクトル

多形の違いがスペクトルの違いに反映される

(33)

合成

結晶化

製粉

混合

造粒

乾燥

カプセル充填

打錠

コーティング

包装

完成

成分分布

0 2 000 4 000 6 000 Y (µ m) 0 5 000 10 000 15 000 X (µm) 500 µm 500 µm 500 µm 500 µm

→ラマンイメージング

医薬品の製造プロセス

■合成～乾燥

■充填～包装

(34)

混合過程

～医薬品成分分布～

■背景

・薬剤の混合では、成分を均一に混ぜることが１つ

の課題となっている。

■ラマンの優位性

・光学顕微鏡画像では、化学組成の分布を可視化

することができない。

・ラマン分光では、化学組成の分布を可視化できる。

・顕微ラマン分光法の高い空間分解能(

1 µm)を活

かして小さな粒子まで可視化できる。

(35)

35 (1) 50µm ステップ

マップ面積 7 x 18 mm

2 _,

アスピリン (赤),

paracetamol (緑)、

カフェイン(青) 、

錠剤コーティング部（紫）

(２) 10µm ステップ

第４の微量成分であるセルロース（黄）が

検出され、錠剤全領域に分布していること

がわかる。

(3) 2 µm ステップ

セルロース粒の形と大きさが明瞭に観察

できる。

医薬全錠と微小領域のラマンイメージング比較

0 2 000

4 000

6 000

Y

(µ

m)

0 5 000

10 000

15 000

X (µm)

500 µm

-300 -200 -100 0 100 200 300 Y (µ m) -200 0 200 X (µm) 40 µm 40 µm 40 µm 40 µm -1 500 -1 000 -500 0 500 1 000 1 500 Y (µ m) -1 000 0 1 000 X (µm) 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm

(1)

(2)

(3)

薬効成分の分布、粒子の大きさを知ることができる。

混合過程

～医薬品成分分布～

(36)

合成

結晶化

製粉

混合

造粒

乾燥

カプセル充填

打錠

コーティング

包装

完成

品質管理

→透過ラマン

医薬品の製造プロセス

■合成～乾燥

■充填～包装

(37)

錠剤の品質管理

~APIの定量分析~

■背景

・原薬の濃度管理は品質管理の現場で重要

■ラマンの優位性

・ラマンスペクトルから定性・定量測定が可能。

・近赤外吸収分光と比較して、ラマン分光ではシャープな

スペクトルが得られるため、高い定性性を持つ。（測定感

度は相対的に低い）

・成分変更時のライブラリー編成の時間が近赤外と比較

して短い。

(38)

Illumination

Collection

Illumination

Collection

顕微ラマン分光法と透過ラマン分光法

顕微ラマン分光装置（後方散乱）

•高空間分解能

•各成分の分布状態が測定可能（マッピング）

•表面近傍の測定

透過ラマン分光装置

•空間分解能なし

•マクロ測定試料の全体の構造を反映

錠剤の一部しかスペク

トルに反映されない。

錠剤全体がスペクトルに反映される。

(39)

分光器へ

Laser

透過ラマン測定ユニット

Laser

サンプル

透過ラマンユニット

模式図

レーザ照射径3～7mmφ

拡大

顕微ラマン分光装置のオプションとして搭載可能

(40)

2層より構成された錠剤のラマンスペクトル比較

（1層目：propranolol 2層目：mannitol）

200

0

400

600

800 1000 1200 1400 1600 1800

500 1000

1500

2000

2500

3000

3500

Raman shift (cm

-1

)

Ar

bi

tra

ry sca

le

backscatter

200

0

400

600

800 1000 1200 1400 1600 1800

500 1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Raman shift (cm

-1

)

Ar

bi

tra

ry sca

le

transmission

顕微ラマンによる

各表層から測定したラマンスペクトル

透過型ラマンにより測定

透過ラマンでは錠剤全体を反映したスペクトルを測定可能

顕微

透過

顕微ラマンと透過ラマンの錠剤の測定

(41)

透過ラマンによるAPIの定量分析

41 6.3 %

2.3 %

1.0 %

0.3 %

スペクトル強度の測定

から線形性を確認

濃度の異なるAPIを

容易し、それぞれの

API由来のスペクトル

の強度を比較した。

(42)

製薬分野におけるラマン分光法～まとめ～

・非破壊・非接触かつ高い定性・定量性を持つ

ラマン分光法は医薬品の分析手法として有効

・医薬品合成から生産の現場まで幅広い範囲

でラマンが活躍

・顕微ラマン、透過ラマン分光法を使い分け、

現場のニーズに対応

(43)

バイオ分野で活躍するラマン分光法

非破壊・非接触・無標識で測定が可能なラマン分光法は

今後、バイオ分野でますます活躍することが期待される。

アプリケーション例



組織・細胞・・・化学組成、成分分布



医薬品・・・結晶多形、成分分布、定量分析



蛋白質・・・構造解析、相互作用解析

アプリケーション掲載Website（英文）

http://www.horiba.com/scientific/products/raman-spectroscopy/applications/application-notes-articles/

バイオ分野のラマン分光法 自由度の高い測定 非破壊 非接触 非染色 ( プローブ不要 ) 細胞 組織 豊富な情報 化学組成の情報 分子レベルの詳しい構造情報 ( 二次構造 官能基単位 ) Length Y (µm) 蛋白質 製薬 高い空間分解能

JASIS2015 新技術説明会

ここでしか聞けない！

バイオライフサイエンス分野における

最新ラマン・アプリケーションと分析の実際

（株）堀場製作所 開発本部

2015年9月2日

バイオ分野のラマン分光法

■自由度の高い測定

・非破壊

・非接触

・非染色 （プローブ不要）

■豊富な情報

・化学組成の情報

・分子レベルの詳しい構造情報

（二次構造、官能基単位

）

■高い空間分解能

・マッピング測定

製薬

蛋白質

細胞・組織

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

1. ラマン分光の基礎

・得られる情報

・蛋白質、細胞、組織切片のラマンスペクトル

2. バイオ系試料の測定手法のポイント

・長波長励起、共焦点、レーザ走査、倒立型の利点

・測定事例の紹介

3.医薬品分野でのラマン分光法の活躍

・医薬品製造現場でのニーズ

・測定事例のご紹介

講演内容

Ｅ

= hν

Ｅ ：エネルギー

h ：プランク定数

ν：振動数

入射光

h

ν

0

分子振動

エネルギー

h

ν

i

ν

0

レイリｰ散乱

ν

0

＋

ν

i

ラマン散乱

（ｱﾝﾁｽﾄｰｸｽ散乱）

レイリー散乱とラマン散乱

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

Int

ens

ity

800

1 000

1 200

1 400

1 600

バイオ分野のラマン分光法自由度の高い測定非破壊非接触非染色 ( プローブ不要 ) 細胞組織豊富な情報化学組成の情報分子レベルの詳しい構造情報 ( 二次構造官能基単位 ) Length Y (µm) 蛋白質製薬高い空間分解能

（株）堀場製作所開発本部

・非染色（プローブ不要）

Ｅ：エネルギー

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