カナグル
®
錠
100mg
製造販売承認申請書添付資料
第
2 部（モジュール 2）
2.6 非臨床試験の概要文及び概要表
2.6.6 毒性試験の概要文
田辺三菱製薬株式会社
2.6.6 毒性試験の概要文 2
目次
略語・略号一覧 ... 3 2.6.6 毒性試験の概要文 ... 5 2.6.6.1 まとめ ... 5 2.6.6.2 単回投与毒性試験 ... 11 2.6.6.2.1 マウスを用いた単回経口投与及び単回腹腔内投与毒性試験 ... 11 2.6.6.2.2 ラットを用いた単回経口投与及び単回腹腔内投与毒性試験 ... 11 2.6.6.2.3 非げっ歯類を用いた急性毒性評価... 12 2.6.6.3 反復投与毒性試験 ... 12 2.6.6.3.1 マウスを用いた反復経口投与毒性試験 ... 12 2.6.6.3.2 ラットを用いた反復経口投与毒性試験 ... 14 2.6.6.3.3 イヌを用いた反復経口投与毒性試験... 19 2.6.6.4 遺伝毒性試験 ... 23 2.6.6.4.1 In vitro 遺伝毒性試験 ... 23 2.6.6.4.2 In vivo 遺伝毒性試験 ... 24 2.6.6.5 がん原性試験 ... 25 2.6.6.5.1 長期がん原性試験 ... 25 2.6.6.6 生殖発生毒性試験 ... 30 2.6.6.6.1 受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験 ... 30 2.6.6.6.2 胚・胎児発生に関する試験 ... 31 2.6.6.6.3 出生前及び出生後の発生並びに母体の機能に関する試験 ... 34 2.6.6.6.4 新生児を用いた試験 ... 35 2.6.6.7 局所刺激性試験 ... 37 2.6.6.8 その他の毒性試験 ... 37 2.6.6.8.1 免疫毒性試験 ... 37 2.6.6.8.2 毒性発現の機序に関する試験 ... 37 2.6.6.8.3 依存性試験 ... 49 2.6.6.8.4 代謝物の毒性試験 ... 49 2.6.6.8.5 不純物の毒性試験 ... 49 2.6.6.8.6 その他の試験 ... 50 2.6.6.9 考察及び結論 ... 54 2.6.6.10 図表 ... 68 参考文献 ... 69略語・略号一覧
略語・略号 略していない表現（英語） 略していない表現（日本語） 1,25(OH)2D 1,25-Dihydroxyvitamin D 1,25-ジヒドロキシビタミン D 25(OH)D 25-hydroxyvitamin D 25-ヒドロキシビタミン D 3-OMG 3-O-Methyl-D-Glucose 3-O-メチル-D-グルコース ALP alkaline phosphatase アルカリホスファターゼ
ALT alanine aminotransferase アラニンアミノトランスフェラー ゼ
APTT activated partial thromboplastin time 活性化部分トロンボプラスチン時 間
AST aspartate aminotransferase アスパラギン酸アミノトランスフ ェラーゼ
AUC area under the plasma concentration curve
血漿中濃度-時間曲線下面積 AUC0-∞ area under the plasma concentration vs.
time from zero to infinity
0 時間から無限大時間まで外挿した 血漿中濃度-時間曲線下面積 AUC0-24h area under the concentration-time curve
from time zero to 24 h
0 時間から 24 時間までの血漿中濃 度-時間曲線下面積
BAP bone-type alkaline phosphatase 骨型アルカリホスファターゼ b.i.d. bis die, twice a day 1 日 2 回
BrdU bromodeoxyuridine ブロムデオキシウリジン CK creatine kinase クレアチンキナーゼ Cmax maximum plasma concentration 最高血漿中薬物濃度
Cre creatinine クレアチニン
CPN chronic progressive nephropathy 慢性進行性腎症 CTX C-terminal cross-linked telopeptide of
type 1 collagen
I 型コラーゲン架橋 C-テロペプチド DNA deoxyribo Nucleic Acid デオキシリボ核酸
DPD deoxypyridinoline デオキシピリジノリン
DXA dual energy X-ray absorptiometry 二重エネルギーX 線吸収測定法 FDA Food and Drug Administration 米国食品医薬品局
GLP Good Laboratory Practice 医薬品の安全性に関する非臨床試 験の実施の基準
GLUT facilitative glucose transporter 促進拡散型糖輸送担体
GGT γ-glutamyltransferase γ グルタミルトランスフェラーゼ h hour 時間 HP-β-CD hydroxypropyl-β-cyclodextrin ヒドロキシプロピル-β-シクロデキ ストリン HPMC hydroxypropyl methylcellulose ヒドロキシプロピルメチルセルロ ース
2.6.6 毒性試験の概要文
4 略語・略号一覧（続き）
略語・略号 略していない表現（英語） 略していない表現（日本語） ICH International Conference on
Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
日米EU 医薬品規制調和国際会議
KIM-1 kidney injury molecule-1 ―
LH luteinizing hormone 黄体形成ホルモン MCH mean corpuscular hemoglobin 平均赤血球色素量 MCV mean corpuscular volume 平均赤血球容量 MPE mean photo effect ―
NAG β-N acetyl D glucosaminidase N-アセチルグルコサミニダーゼ PIF photo irradiation factor ―
PINP procollagen type I N-terminal propeptide
I 型プロコラーゲン N-プロペプチド PTH parathyroid hormone 副甲状腺ホルモン
q.d. quaque die, once a day 1 日 1 回
SGLT sodium glucose co-transporter ナトリウム-グルコース共輸送体 TK toxicokinetics トキシコキネティクス
tmax time to reach Cmax 最高濃度到達時間 TRAP5b tartrate-resistant acid phosphatase from
5b
酒石酸耐性酸性ホスファターゼb5 UV ultraviolet radiation 紫外線
2.6.6 毒性試験の概要文 6 表 2.6.6.1－1 カナグリフロジン水和物の毒性試験一覧（続き） 試験の種類及び期間 投 与 経 路 （処理） 動物種 GLP 適用 生殖発生毒性試験 受胎能及び着床までの初期胚発生 経口 ラット 適用 胚・胎児発生（用量設定試験） 経口 ラット 非適用 胚・胎児発生 経口 ラット 適用 5 日間（用量設定試験） 経口 ウサギ 非適用 胚・胎児発生（用量設定試験） 経口 ウサギ 非適用 胚・胎児発生 経口 ウサギ 適用 出生前後の発生並びに母体機能（用量設定試験） 経口 ラット 非適用 出生前後の発生並びに母体機能 経口 ラット 適用 新生児を用いた試験 経口 ラット（幼若） 適用 その他の毒性試験 毒性発現の機序に関する試験 胃のびらんの機序検討 経口 ラット 非適用 骨関連マーカー経時変動に関する検討 経口 ラット 非適用 過骨症のラットの週齢差に関する検討 経口 ラット 非適用 45Ca 吸収と排泄に関する試験 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，4 週間（フルクトース予備検討） 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，4 週間（フルクトース予備検討 2） 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，4 週間（低カルシウム予備検討） 経口，又は 皮下 ラット 非適用 発がん機序検討，4 週間（摂餌条件予備検討） 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，6 ヶ月間（フルクトース） 経口 ラット 適用 発がん機序検討，6 ヶ月間（低カルシウム） 経口 ラット 適用 発がん機序検討，2 週間（消化管内グルコース量） 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，2 週間（消化管内 pH） 経口 ラット 非適用 発がん機序検討，7 ヶ月間（ホルモン濃度測定） 経口 ラット 適用 不純物の毒性試験 細菌を用いた復帰突然変異試験 in vitro ネズミチフス菌 非適用 その他の試験 眼刺激性試験 in vitro ウシ角膜 非適用 局所リンパ節試験 経皮 マウス 非適用 光細胞毒性試験 in vitro Balb/c 3T3 細胞 非適用 光毒性試験 経口 有色ラット 適用 光遺伝毒性試験 in vitro ネズミチフス菌，大腸菌 適用 単回投与TK 試験 経口 ラット 適用 単回投与TK 試験 経口 イヌ 適用 反復投与TK 試験 経口 ラット（妊娠） 適用 単回投与毒性 ICR マウス，SD ラット及びビーグル犬を用いて急性毒性を評価した．単回経口投与試験に おいて，マウスでは2000 mg/kg の投与量まで死亡例は認められず，ラットでは 2000 mg/kg の雌で死亡例が認められた．したがって，カナグリフロジン水和物の単回経口投与による概 略の致死量はマウスでは2000 mg/kg 超，ラットでは 2000 mg/kg であった．単回腹腔内投与 試験において，マウスでは500 mg/kg まで死亡例が認められず，ラットでは 250 及び 500 mg/kg 群の雄で死亡例が認められた．したがって，カナグリフロジン水和物の腹腔内投与による概 略の致死量は，マウスでは500 mg/kg 超，ラットでは 250 mg/kg であった．単回投与による 主な毒性変化は，経口投与及び腹腔内投与ともに軟便，水様便などの消化器症状であった．
ビーグル犬を用いた5 日間反復経口投与試験において，初回投与時には死亡／瀕死例はみ られなかったことから，単回投与における概略の致死量は800 mg/kg 超と推定された．初回 投与時にはすべての投薬群で嘔吐及び便の異常がみられ，単回投与による主な毒性変化は消 化器症状であると判断された． 反復投与毒性 ICR マウスを用いた反復経口投与毒性試験として，2 週間及び 13 週間の反復投与試験を実 施した．2 週間投与用量設定試験（50，250，500 及び 1000 mg/kg/日）では，500 mg/kg/日以 上の群において投薬に起因する死亡がみられた．250 mg/kg/日以上の群では軟便などの消化 器症状，貧血傾向，並びにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下，AST），アラニ ンアミノトランスフェラーゼ（以下，ALT）及び尿素窒素の高値などの所見がみられた．250 mg/kg/日群でみられた変化は軽度であったため，13 週間投与試験は 30，100 及び 300 mg/kg/ 日の投与量で実施した．その結果，300 mg/kg/日群の雄 1 例で瀕死となり剖検したほか，軟 便などの消化器症状，並びに貧血傾向などの所見が認められた．100 mg/kg/日群でみられた 変化は変動の程度が軽微であり毒性学的な意義が低いと判断し，無毒性量は100 mg/kg/日と 結論した． SD ラットを用いた反復経口投与毒性試験として，2 週間，13 週間及び 6 ヶ月間の反復投 与試験を実施した．2 週間投与試験（3，20 及び 150 mg/kg/日）では，薬理作用に基づく変化 として，尿中グルコース排泄量，尿量及び尿比重の高値，並びに血清中グルコースの低値も 認められた．そのほか，血清中のAST，ALT 及び尿素窒素の高値，尿中カルシウム排泄量の 高値などが認められた．なお，剖検及び病理組織学的検査において胃のびらん（変色・赤色 巣／領域）が認められたが，投薬による血糖値の低下と剖検前の絶食が組み合わさることに よって誘発されたもので，本薬の胃への直接作用に起因するものでないと判断した．150 mg/kg/日群では過骨症が認められ，無毒性量は 20 mg/kg/日と結論した．13 週間投与試験（4， 20 及び 100 mg/kg/日）では，2 週間投与試験と同様の所見に加え，尿検査では，γ グルタミ ルトランスフェラーゼ（以下，GGT），N-アセチルグルコサミニダーゼ（以下，NAG）及び たん白排泄量の高値，並びにカルシウムを含む電解質排泄量の高値などの変化がみられたが， これらのパラメータのうち GGT 及びカルシウムを除き，尿中濃度は対照群と同等か若しく は低い濃度であったことから，これらの変化は尿量の増加に伴った二次的変化であると判断 した．また，2 週間投与試験において過骨症がみられたことから，骨代謝に関連するバイオ マーカーを測定した．測定したすべてのパラメータが低値であったことから，ラットでみら れた過骨症は，骨代謝回転が低下した中で骨吸収が骨形成よりも相対的に低下したことによ り，発現した可能性が示唆された．無毒性量は明らかな過骨症が認められなかった雄の 4 mg/kg/日及び雌の 20 mg/kg/日と結論した．なお，本試験で認められた変化はおおむね 8 週間 の休薬により回復した．6 ヶ月間投与試験（4，20 及び 100 mg/kg/日）では，2 週間及び 13 週間投与試験と同様の所見がみられた．過骨症に関連してDual energy x-ray absorptiometry（以
2.6.6 毒性試験の概要文 8 て大腿骨及び腰椎の骨塩量の低下が認められたものの骨密度に変化はなく，本変化は体重増 加抑制に伴う骨の成長抑制を示唆する変化であると考えられた．なお，20 mg/kg/日以上の群 で明らかな過骨症が認められたこと，4 mg/kg/日群でみられた変化はいずれも毒性学的意義 が乏しいと判断し，無毒性量は雌雄とも4 mg/kg/日と結論した． ビーグル犬を用いた反復経口投与毒性試験として，5 日間，2 週間，13 週間及び 12 ヶ月間 の毒性試験を実施した．なお，用量設定試験として実施した5 日間投与用量設定試験（25， 100，400 及び 800 mg/kg/日）では，800 mg/kg/日投与の雌 1 例で状態悪化（ケトーシス及び 脱水を伴う低血糖）が認められたため瀕死期解剖を行った．そのほか，薬理作用に起因した 尿中グルコース排泄量の高値などの変化がみられたが，400 mg/kg/日まで忍容性に問題がな かったことから，2 週間投与試験は 4，40 及び 400 mg/kg/日の投与量で実施した．その結果， 薬理作用に基づく尿中グルコース排泄量，尿量及び尿中カルシウム排泄量の高値，並びに血 清中グルコースの低値などの変化が認められた．これらは薬理作用に起因した変化，又は組 織学的所見を伴わない軽微な変化であり，無毒性量は雌雄とも400 mg/kg/日と結論した．13 週間投与試験は，4，30 及び 200 mg/kg/日の投与量で開始したが，200 mg/kg/日群において一 般状態が著しく悪化したため，途中で100 mg/kg/日に投与量を減じた．200 mg/kg/日投与時に は活動性低下，脱水，血便及び紅斑などの症状が認められたが，投与量を100 mg/kg/日に減 じて以降，これらの症状は消失した．30 mg/kg/日群で認められた変化は，2 週間投与試験と 同様の薬理作用に起因した変化，又は組織学的所見を伴わない軽微な変化であり，無毒性量 は雌雄とも30 mg/kg/日と結論した．なお，本試験で認められた変化はいずれも 4 週間の休薬 期間中に回復した．12 ヶ月間投与試験（4，30 及び 100 mg/kg/日）で認められた変化は 13 週 間投与試験とおおむね同様であった．ラットに過骨症がみられたことから，イヌでの骨への 影響を評価するために骨代謝に関連するバイオマーカーを測定した．測定したパラメータに わずかな変動がみられたが，骨密度，骨強度及び骨形態計測において明らかな所見は認めら れなかったことから，これらの変化に毒性学的意義はないと判断し，無毒性量は100 mg/kg/ 日と結論した． 遺伝毒性 細菌を用いた復帰突然変異試験，マウスリンフォーマアッセイ，ラット骨髄小核試験及び ラット肝コメットアッセイにて評価した．マウスリンフォーマアッセイの代謝活性化法にお いて突然変異頻度の増加が認められたが，被験物質の析出がみられる用量のみでの変化であ ったことから，本結果の毒性学的意義は低いと考えられた．他の試験では陰性であったこと から，カナグリフロジン水和物は遺伝毒性を有しないと結論した． がん原性 ICR マウスを用いた 2 年間反復経口投与がん原性試験（10，30 及び 100 mg/kg/日）では， 投薬に起因した腫瘍所見は認められなかった．
SD ラットを用いた 2 年間反復経口投与がん原性試験（10，30 及び 100 mg/kg/日）では， 投薬に起因して，副腎褐色細胞腫，腎尿細管腫瘍及び精巣間細胞腫の発現頻度が増加したが， いずれの腫瘍も以下の理由でラット特有の現象であると考えている．①カナグリフロジン水 和物は遺伝毒性試験バッテリーにおいて非遺伝毒性物質と判断されており，ラットにおける 腫瘍発生増加は非遺伝毒性メカニズムによるものであると考えられる．②マウスがん原性試 験では，薬物曝露レベルはラットがん原性試験と同等であったが，投薬に起因する腫瘍は認 められなかった．③いずれの腫瘍もラット特異的に腫瘍を発生させるメカニズムが存在する と考えられる．したがって，カナグリフロジン水和物は非遺伝毒性的な機序によりラットに がん原性を示すものの，いずれの腫瘍についてもヒトへの外挿性は低いと考えられる． ラットにみられた腫瘍発生メカニズムを検証するために機序検討試験を実施した結果，ラ ットがん原性試験でみられた3 種の腫瘍発生には，投薬に起因した糖質吸収不全に続発する カルシウムインバランスが関与しており，精巣間細胞腫については，更にホルモンインバラ ンスが関与していることが示唆された． 生殖発生毒性 雌雄ラットを用いた受胎能及び着床までの初期胚発生に関する試験（4，20 及び 100 mg/kg/ 日）では，100 mg/kg/日まで雌雄親動物の生殖機能及び初期胚発生に影響は認められなかっ た．ラット（10，30 及び 100 mg/kg/日）及びウサギ（10，40 及び 160 mg/kg/日）を用いた胚・ 胎児発生に関する試験では，いずれも高用量まで胚・胎児毒性や催奇形性を示す所見はみら れなかった．ラットを用いた出生前及び出生後の発生並びに母体の機能に関する試験（10， 30 及び 100 mg/kg/日）では，30 及び 100 mg/kg/日群で妊娠期間中に母動物の体重増加抑制， 又は体重減少が，哺育期間中に出生児の体重増加抑制がみられた．出生児に対する無毒性量 は10 mg/kg/日と結論した．幼若ラットを用いた 10 週間反復投与毒性試験では，ラットを用 いた反復投与毒性試験と同様の変化が認められ，幼若動物に特異的な毒性の発現は認められ なかった．また，尺骨長の発育，性成熟の指標は遅延したものの，体重増加の抑制に伴うも のと判断され，器官・機能の発達に対する直接的な影響ではないと判断した．幼若ラットに おける無毒性量は4 mg/kg/日と結論した． その他の毒性試験 カナグリフロジン水和物の取扱者の安全性に配慮する目的で，ウシ摘出角膜を用いた眼刺 激性試験を実施し，局所刺激性を評価した．カナグリフロジン水和物の眼刺激性は，非眼刺 激性又は軽度の眼刺激性に分類された．同様にCBA/J マウスを用いて耳介リンパ節のリンパ 球増殖反応を指標にした局所リンパ節試験を実施し，皮膚感作性を評価した．カナグリフロ ジン水和物は皮膚感作物質ではないと結論した．
光安全性評価として，Balb/c 3T3 細胞を用いた光細胞毒性試験を実施した結果，Mean photo effect（以下，MPE）が 0.28 であったことから，カナグリフロジン水和物は光毒性のポテン
2.6.6.2 単回投与毒性試験 2.6.6.2.1 マウスを用いた単回経口投与及び単回腹腔内投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.1-1，試験番号：TOX7636］ ICR マウスの雌雄各群 5 例にカナグリフロジン水和物の 250，500，1000 及び 2000 mg/kg （無水物として245，490，979 及び 1959 mg/kg）を単回経口投与，又は 62.5，125，250 及び 500 mg/kg（無水物として 61.2，122，245 及び 490 mg/kg）を単回腹腔内投与し，その影響を 14 日間観察した後に剖検を行った．いずれの投与経路についても対照群には 0.5% ヒドロキ シプロピルメチルセルロース水溶液（以下，0.5% HPMC）を投与した［2.6.7.5A］． いずれの投薬群にも死亡はなかった． 経口投与では，一般状態変化としてすべての投薬群で軟便及び被毛の粗剛化が，500 mg/kg 以上の群で水様便及び水様便ないし軟便による被毛の汚染が，2000 mg/kg 群では粘液便，便 の減少，腹部膨満，眼瞼下垂，被毛の尿による汚染などの所見が認められた．すべての投薬 群で体重に変化はみられなかった． 腹腔内投与では，一般状態変化として500 mg/kg 群で眼瞼下垂，活動性低下，軟便，被毛 の便汚染，被毛の粗剛化などの所見がみられた．すべての投薬群で体重に変化はみられなか った．また，剖検時にみられた肝臓と横隔膜の癒着は，本薬の直接的な刺激作用によるもの と考えられた． 以上の結果より，概略の致死量は，経口投与では2000 mg/kg 超，腹腔内投与では 500 mg/kg 超と結論した． 2.6.6.2.2 ラットを用いた単回経口投与及び単回腹腔内投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.1-2，試験番号：TOX7635］ SD ラットの雌雄各群 5 例にカナグリフロジン水和物の 250，500，1000 及び 2000 mg/kg（無 水物として245，490，979 及び 1959 mg/kg）を単回経口投与，又は 62.5，125，250 及び 500 mg/kg（無水物として 61.2，122，245 及び 490 mg/kg）を単回腹腔内投与し，その影響を 14 日間観察した後に剖検を行った．いずれの投与経路についても対照群には0.5% HPMC を投 与した［2.6.7.5B］． 経口投与では，2000 mg/kg 群の雌 1 例が Day 6 に死亡した．死亡前には眼瞼下垂などの所 見が観察され，同群の生存例では鼻周囲汚染，腹部膨満，円背位，立毛，活動性低下などの 所見が認められた．すべての投薬群で，便の異常（便減少／無便，粘液便，軟便及び水様便 など），脱毛，被毛粗剛，被毛の汚染などの所見が認められた．1000 mg/kg 以上の群では体 重が低値であった． 腹腔内投与では，250 mg/kg 群の雄 1 例が Day 11 に，500 mg/kg 群の雄 3 例が Day 3～5 に 死亡した．死亡例では，皮温低下，腹部膨満，削痩，円背位，眼瞼及び鼻周囲の汚染，眼瞼
2.6.6 毒性試験の概要文 12 の群で，眼瞼周囲の汚染，脱毛，腹膜の癒着が，250 mg/kg 以上の群で活動性低下，便減少 ／無便，軟便，被毛の便又は尿による汚染，被毛粗剛，及び体重の低値が，500 mg/kg 群で は粘液便及び水様便が認められた．なお，腹腔内投与で認められた腹膜の癒着は，本薬の直 接的な刺激作用によるものと考えられた． 以上の結果より，概略の致死量は，経口投与では雄で2000 mg/kg 超，雌で 2000 mg/kg，腹 腔内投与では雄で250 mg/kg，雌で 500 mg/kg 超と結論した． 2.6.6.2.3 非げっ歯類を用いた急性毒性評価 カナグリフロジン水和物の非げっ歯類を用いた単回投与毒性試験は実施せず，イヌを用い た5 日間反復経口投与試験［2.6.6.3.3.1］で急性毒性を評価した結果，初回投与後にはすべて の投薬群で嘔吐及び便の異常がみられた．また，800 mg/kg（無水物として 784 mg/kg）まで 死亡例／瀕死例はみられなかった． 以上の結果より，イヌに単回経口投与した場合の主な毒性変化は消化器症状であり，概略 の致死量は800 mg/kg を超えるものと推定された． 2.6.6.3 反復投与毒性試験 カナグリフロジン水和物の反復投与毒性試験として，マウス，ラット及びイヌを用いて表 2.6.6.1－1に示した試験を実施した．なお，無毒性量を推定する上で，薬理作用に起因する血 清中グルコース値の低値及び尿中グルコース排泄量の高値，並びに薬理作用の二次的変化と 考えられる可逆的な変化は毒性とは判断しなかった［2.6.6.9］． 2.6.6.3.1 マウスを用いた反復経口投与毒性試験 2.6.6.3.1.1 マウスを用いた 2 週間反復経口投与用量設定試験 ［資料番号：4.2.3.2-1（参考資料），試験番号：TOX7963］ 本試験はカナグリフロジン水和物のマウスへの2 週間反復経口投与により発現する毒性を 明らかにし，13 週間反復経口投与毒性試験の投与量を設定することを目的として実施した． ICR マウスの雌雄各 10 例に，カナグリフロジン水和物の 50，250，500 及び 1000 mg/kg/ 日（無水物として49.0，245，490 及び 980 mg/kg/日）を 2 週間反復経口投与した．対照群に は0.5％ HPMC を投与した．なお，1000 mg/kg/日群は Day 3 に死亡例が認められ，生存例に ついても一般状態が顕著に悪化したため，投与及び観察を終了した．検査項目は，一般状態， 体重，血液学的検査，血液生化学的検査，剖検及び病理組織学的検査とした．更にトキシコ キネティクス（以下，TK）測定群を設けて，初回投与日（Day 0）及び Day 13 に TK 測定を 実施した［2.6.7.6A］．
500 mg/kg/日以上の群で死亡例がみられた．250 及び 500 mg/kg/日群の雌で体重及び体重増 加量が高値であった．一般状態観察では，500 mg/kg/日以上の群の雄で被毛の粗剛化が認め られた．250 mg/kg/日以上の群の雌及び 500 mg/kg/日以上の群の雄では軟便が生じ，便の量が 少なかった．500 mg/kg/日群では泌尿生殖器周囲の湿潤及び汚染，腹部膨満及び紅斑が認め られた．泌尿生殖器の汚染は1000 mg/kg/日群でも認められた．血液学的検査では，50 mg/kg/ 日以上の群の雄及び500 mg/kg/日群の雌で赤血球数，ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット 値が低値であり，500 mg/kg/日群の雄では血小板数，白血球数及び分葉核好中球数が高値で あった．血液生化学的検査では，250 mg/kg/日以上の群で AST，ALT 及び尿素窒素の高値が， 250 mg/kg/日以上の群の雄及び 500 mg/kg/日群の雌でトリグリセリドが高値であった．500 mg/kg/日群ではグルコースが低値であり，また 500 mg/kg/日群の雌ではリンの低値及びコレ ステロールの高値もみられた．剖検時には500 mg/kg/日群において盲腸の拡張及び胸腺の小 型化が観察され，病理組織学的検査では雄の1 例で胸腺のリンパ球減少が認められた． TK 測定の結果，雌雄ともに 500 mg/kg/日までカナグリフロジンの全身曝露量（Cmax及び AUC）は用量に応じて増加した．1000 mg/kg/日群では 500 mg/kg/日群とほぼ同等の曝露量で あった．また，Day 0 と Day 13 の曝露量比較では，雌の 500 mg/kg/日群の Cmaxを除きほぼ同
等であり，反復投与による明確な曝露量の変動はなかった．また，雌雄間で曝露量の明らか な差は認められなかった． 以上の結果に基づき，マウスを用いた13 週間反復経口投与毒性試験の投与量は 30，100， 及び300 mg/kg/日に設定した． 2.6.6.3.1.2 マウスを用いた 13 週間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-2，試験番号：TOX8262］ ICR マウスの雌雄各 10 例に，カナグリフロジン水和物の 30，100 及び 300 mg/kg/日（無水 物として29.4，98.0 及び 294 mg/kg/日）を 13 週間反復経口投与した．投与量はマウスを用い た2 週間反復経口投与毒性試験［2.6.6.3.1.1］の結果を基に設定した．対照群には0.5％ HPMC を投与した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，血液学的検査，血液生化 学的検査，器官重量，剖検及び病理組織学的検査とした．更にTK 測定群を設けて，初回投 与日（Day 0）及び Day 90 に TK 測定を実施した［2.6.7.7A］．
300 mg/kg/日群の雄 1 例で，低体温，活動性低下，呼吸速度の不整，鼠径生殖器周囲の化 膿性皮膚炎，泌尿生殖器周囲の湿潤，軟便，便の減少，直腸脱及び腹部膨満などの所見が認 められ，Day23 に瀕死期解剖を行った．なお，対照群の雌 1 例，100 mg/kg/日群の雄 1 例及び 300 mg/kg/日群の雄 1 例が誤投与により死亡した．また，対照群の雄 1 例については後肢の 麻痺が生じたため安楽殺を行った．300 mg/kg/日群の死亡例以外の個体では，軟便，便の減 少及び腹部膨満が認められたほか，300 mg/kg/日群の雄 1 例で泌尿生殖器領域の湿潤が認め られた．30 mg/kg/日以上の群で摂餌量が高値であり，雌では体重増加量が高値であった．300
2.6.6 毒性試験の概要文 14 は投薬に起因した変化はみられなかった． 血液学的検査では，100 mg/kg/日以上の群の雄で，赤血球数，ヘモグロビン濃度及びヘマ トクリット値が対照群よりも低値であった．血液生化学的検査では，100 mg/kg/日以上の群 の雄でトリグリセリドが高値であった．300 mg/kg/日群では尿素窒素が高値，総たん白及び アルブミンが低値であった．同群の雌では前述に加えてALT が高値であった．これらのうち， 100 mg/kg/日群の雄でみられた赤血球数，ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット値の変動は いずれも軽微であり毒性学的に意義はないと判断した． 器官重量では，100 mg/kg/日以上の群の雄及び 300 mg/kg/日群の雌で肝重量が，300 mg/kg/ 日群の雌で腎重量が高値であった．剖検では瀕死例を含む300 mg/kg/日群で盲腸の拡張が認 められた．病理組織学的検査では300 mg/kg/日群で肝細胞のグリコーゲン増加が認められた が，薬理作用に関連した変化と考えられることから毒性とは判断しなかった．同変化は，100 mg/kg/日以上の群でみられた肝重量の高値や脂質パラメータの変動とも関連していると考え られる． TK 測定の結果，雌雄ともに全身曝露量（Cmax及びAUC）は用量に応じて増加した．Day 0 とDay 90 の曝露量比較では，300 mg/kg/日群の AUC が軽度に低下した以外は，反復投与に よる明確な曝露量の変動はなかった．また，雌雄間で曝露量の明確な差は認められなかった． 以上の結果より，本試験における無毒性量は100 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.2 ラットを用いた反復経口投与毒性試験 2.6.6.3.2.1 ラットを用いた 2 週間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-3，試験番号：TOX7633］ SD ラットの雌雄各 10 例に，カナグリフロジン水和物の 3，20 及び 150 mg/kg/日（無水物 として2.94，19.6 及び 147 mg/kg/日）を 2 週間反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，血液学的検査，血液凝固 検査，血液生化学的検査，尿検査，尿生化学的検査，器官重量，剖検及び病理組織学的検査 とした［2.6.7.7B］． いずれの投薬群にも死亡例はなかった．150 mg/kg/日群では，軟便がみられ被毛が便で汚 染された個体があった．また，150 mg/kg/日群の雄 1 例で便の減少が，雌 1 例では被毛の粗 剛化，並びに水様便が認められた．20 mg/kg/日以上の群では摂餌量が高値であった．一方， 150 mg/kg/日群の雄では体重及び体重増加量が対照群と比較して低値であった．眼科的検査 では投薬に起因した変化は認められなかった． 血液学的検査では，150 mg/kg/日群で血小板数が低値，150 mg/kg/日群の雌で網状赤血球数 が高値であった．血液生化学的検査では，3 mg/kg/日以上の群の雌及び 20 mg/kg/日以上の群 の雄でALT が，20 mg/kg/日以上の群で AST が高値であった．また，20 mg/kg/日以上の群で 尿素窒素が高値であり，150 mg/kg/日群で総たん白及びアルブミンが，150 mg/kg/日群の雌で グロブリンが低値であった．20 mg/kg/日以上の群の雌及び 150 mg/kg/日群の雄でカルシウム
が，20 mg/kg/日以上の群でグルコースが低値であった．150 mg/kg/日群の雄でコレステロー ルが，150 mg/kg/日群でトリグリセリドが高値であった． 尿検査及び尿生化学的検査では，すべての投薬群でグルコース排泄量及び尿比重が高値で あった．150 mg/kg/日群では尿量及びカルシウム排泄量が高値であり，ケトン体が検出され， 尿pH も低値であった．薬理作用に起因して尿中グルコース排泄が顕著に増加し，血清中グ ルコースの低値や代償的な体脂肪の分解によってケトン体が生じたものと考えられた．尿中 カルシウム排泄量の高値や血清中カルシウムの低値に関しては後述の過骨症との関連性が考 えられるが，それらについては機序検討試験の項［2.6.6.8.2］で総合的に考察する．投薬群の 多くの個体でみられたAST，ALT 及び尿素窒素の高値については，それらの変動の程度は軽 度であり，ALP，GGT，総ビリルビン，クレアチニンなどの肝臓及び腎機能に関連するパラ メータの変動を伴わないこと，関連する組織学的所見が認められないことから毒性学的意義 のない変化と判断した． 器官重量では，すべての投薬群の雄及び20 mg/kg/日以上の群の雌で腎重量（相対）が高値， 150 mg/kg/日群では胸腺重量（相対）が低値であった．腎重量の変化については，変化の程 度が軽微であること，関連する組織学的所見が認められないことから毒性学的意義の低い変 化と判断した． 剖検では，3 mg/kg/日以上の群の雌及び 20 mg/kg/日以上の群の雄で胃の変色・赤色巣／領 域が，150 mg/kg/日群の雄で盲腸の拡張及び体脂肪の減少が認められた．病理組織学的検査 では，150 mg/kg/日群で骨（膝関節）の過骨症が認められた．また，3 mg/kg/日以上の群の雌 及び20 mg/kg/日以上の群の雄で対照群と比較して胃のびらんの発現頻度が高かった．20 mg/kg/日以上の群では膵臓のチモーゲン顆粒の減少が認められた．胃のびらんについては， 剖検前絶食との関連性を疑い機序検討試験を実施したところ，投薬に起因した血糖値の低下 と剖検前の絶食が組み合わさることによりびらんの発現頻度が増加することが明らかとなっ たため［2.6.6.8.2.1］，毒性とは判断しなかった．膵臓のチモーゲン顆粒の減少に関しては， 詳細は不明であるが摂餌量の変動と関連する可能性が考えられる． 以上の結果より，本試験における無毒性量は20 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.2.2 ラットを用いた 13 週間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-4，試験番号：TOX8150］ SD ラットの雌雄各 10 例に，カナグリフロジン水和物の 4，20 及び 100 mg/kg/日（無水物 として3.92，19.6 及び 98.0 mg/kg/日）を 13 週間反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．対照群及び100 mg/kg/日群については更に雌雄各 5 例を用いて 8 週間の回復性 試験を実施した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，血液学的検査（血液 凝固検査含む），血液生化学的検査，尿検査，尿生化学的検査，骨代謝関連マーカー測定，器 官重量，剖検及び病理組織学的検査（骨形態計測含む）とした［2.6.7.7C］．
2.6.6 毒性試験の概要文 16 た．20 mg/kg/日以上の群の雌では体重及び体重増加量が低値であった．すべての投薬群で摂 餌量が高値であった．摂餌量の増加は薬理作用に基づく尿中へのグルコース排泄増加に依存 した変化と考えられ，毒性学的意義は低いと判断した．眼科的検査では投薬に起因した変化 は認められなかった． 血液学的検査では，100 mg/kg/日群で赤血球数が，100 mg/kg/日群の雌でヘマトクリット値 及びヘモグロビン濃度が低値であった．また，100 mg/kg/日群の雄では網状赤血球数が高値 であった．血液生化学的検査では，4 mg/kg/日以上の群の雄及び 20 mg/kg/日以上の群の雌で ALT，AST 及び尿素窒素が高値であり，グルコースが低値であった．また，100 mg/kg/日群 でトリグリセリド及びリンが高値であった．100 mg/kg/日群の雌ではカルシウムが低値であ った．なお，対照群の雄1 例（動物番号 1003）において ALT 及び AST が極端に高値であり （それぞれ664 IU/L 及び 938 IU/L），投薬群での ALT 及び AST の変動の判断は本個体を除外 して行ったものである．いずれの投薬群においてもALT 及び AST の高値の程度は軽度であ り，関連する組織学的所見を伴っていなかったことから，毒性学的意義が低い変化と判断し た．尿素窒素の高値については，クレアチニンの高値を伴っていないことから，腎機能低下 を反映したものではなく，尿中へのグルコース排泄が過多な状況において，絶食されること によりたん白異化が亢進した結果と推察される．関連する組織学的変化を伴っていないこと も考え合わせて毒性学的意義の低い変化と判断した． 尿検査及び尿生化学的検査では，すべての投薬群で尿量，尿比重，グルコース排泄量，GGT 排泄量及びカルシウム排泄量が高値であった（尿比重については100 mg/kg/日群の雄を除く）． 20 mg/kg/日以上の群ではリン排泄量が高値であった．20 mg/kg/日以上の群の雄及び 100 mg/kg/日群の雌では，マグネシウム及び NAG 排泄量が高値であった．また，20 mg/kg/日以 上の群の雌及び100 mg/kg/日群の雄ではたん白排泄量が，100 mg/kg/日群の雄ではナトリウム 排泄量が高値であった．すべての投薬群の雄及び100 mg/kg/日群の雌ではケトン体が検出さ れ，20 mg/kg/日以上の群では pH が低値であった．投薬群でみられた尿中グルコース排泄量， 尿比重及び尿量の高値は，薬理作用である腎臓におけるグルコースの再吸収阻害に関連する 変化であり，毒性変化ではないと判断した．また，多くのパラメータで尿中排泄量の高値が 認められたが，これらのパラメータのうちGGT 及びカルシウムを除き，尿中濃度は対照群 よりも低値，又は対照群と同等の値を示したことから，尿中排泄量の高値は尿量の増加に伴 う二次的な変化であると考えられる．尿のpH の低値及びケトン体の検出については，尿中 へのグルコース排泄が過多な状況での絶食により脂肪の異化が生じたものと推察される． 骨代謝に関連するマーカー測定では，20 mg/kg/日以上の群の雄及び 100 mg/kg/日群の雌で 1,25-ジヒドロキシビタミン D（以下，1,25(OH)2D）が，100 mg/kg/日群で 25-ヒドロキシビタ ミンD（以下，25(OH)D）及び副甲状腺ホルモン（以下，PTH）が，20 mg/kg/日以上の群で オステオカルシンが低値であった．また，100 mg/kg/日群で尿中デオキシピリジノリンのク レアチニン比（以下，尿中DPD/Cre）が低値であった． 器官重量では，すべての投薬群で腎重量が，20 mg/kg/日以上の群の雌及び 100 mg/kg/日群 の雄で副腎重量が，20 mg/kg/日以上の群の雌では肝重量が高値であった．剖検では，すべて
の投薬群で腺胃の変色巣／領域が観察された．病理組織学的検査では，すべての投薬群で腺 胃のびらん及び腎臓の鉱質沈着が認められ，すべての投薬群の雌及び20 mg/kg/日以上の群の 雄で膝関節，20 mg/kg/日以上の雄及び 100 mg/kg/日の雌で胸骨の過骨症が認められた．また， 大腿骨・脛骨骨髄では，20 mg/kg/日以上の群の雄及び 100 mg/kg/日群の雌で極軽度から軽度 の造血細胞の増加が認められた．骨の形態計測では100 mg/kg/日群で海綿骨量が高値であり， 100 mg/kg/日群の雄で類骨面が低値であった．過骨症の発現頻度及び程度は用量に依存して おり，発現頻度及び程度の増加が明らかなのは20 mg/kg/日以上の群の雄及び 100 mg/kg/日群 の雌であった．これらの変化のうち，副腎及び肝重量の高値は，いずれもその程度は軽度で あり，組織学的変化を伴っていなかった．腎重量の高値は，薬理作用に起因する尿量の増加 に関連した変化と考えられる．胃のびらんについては，機序検討試験を実施し，投薬と剖検 前絶食が組み合わさることによりびらんの発現頻度が増加することが明らかとなっており ［2.6.6.8.2.1］，毒性とは判断しなかった．なお，本試験における胃のびらんは，粘膜の局所 的肥厚，慢性炎症，腺の消失，線維化及びヘモジデリン貪食マクロファージの集簇などの所 見を伴っていないことから，投与期間中持続的に生じていたものではなく剖検直前に生じた と考えられる． 体重減少，大腿骨・脛骨骨髄での造血細胞増加，腎臓間質の鉱質沈着以外の変化は8 週間 の休薬により回復した． 以上の結果より，無毒性量は雄で4 mg/kg/日，雌で 20 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.2.3 ラットを用いた 6 ヶ月間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-5，試験番号：TOX8574］ SD ラットの雌雄各 20 例に，カナグリフロジン水和物の 4，20 及び 100 mg/kg/日（無水物 換算）を6 ヶ月間反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．検査項目は，一 般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，血液学的検査（血液凝固検査含む），血液生化学的検査， 尿検査，尿生化学的検査，骨代謝関連マーカー測定，器官重量，剖検及び病理組織学的検査 （骨形態計測含む），並びに骨密度測定及び骨強度測定とした．更にTK 測定群を設けて，初 回投与日（Day 0），Day 90 及び Day 179 に TK 測定を実施した［2.6.7.7D］．
いずれの投薬群においても死亡例はなかった．すべての投薬群で摂餌量が高値であり，飲 水行動も頻繁であった（この行動を多飲とする）．すべての投薬群で体重及び体重増加量は低 値であった．これらの変化は薬理作用に起因する尿中グルコース排泄の増加に関連した変化 と考えられ，毒性学的意義はないと判断した．100 mg/kg/日群では軟便が認められた．眼科 的検査では投薬に起因した変化は認められなかった． 血液学的検査では，20 mg/kg/日以上の群の雌及び 100 mg/kg/日群の雄で赤血球数が，100 mg/kg/日群の雌でヘマトクリット値が低値であった．赤血球恒数としては 100 mg/kg/日群で 平均赤血球容積（MCV）及び平均赤血球色素量（MCH）が高値であった．20 mg/kg/日以上
2.6.6 毒性試験の概要文 18 以上の群の雄では単球数が，20 mg/kg/日以上の群で好酸球数が低値であった．血液凝固検査 では，100 mg/kg/日群で APTT の短縮が認められたが，軽度な変化であったことから毒性学 的意義はないと判断した． 血液生化学的検査では，すべての投薬群でグルコースが低値であった．また，100 mg/kg/ 日群の雄ではナトリウムが，20 mg/kg/日以上の群の雄ではクロールが，すべての投薬群の雌 及び20 mg/kg/日以上の群の雄ではカルシウムが低値であった．すべての投薬群の雌で総たん 白及びアルブミンが低値であったが，100 mg/kg/日群の雄ではアルブミンが高値であった． 100 mg/kg/日群の雄ではコレステロールが，20 mg/kg/日以上の群の雌及び 100 mg/kg/日群の雄 ではトリグリセリドが高値であった．すべての投薬群で尿素窒素が高値であった．一方，ク レアチニンは20 mg/kg/日以上の群の雌で対照群と比較して低値であった．すべての投薬群の 雄でAST，ALT 及び ALP が高値であった．すべての投薬群の雌で ALP が高値であった．一 方，すべての投薬群の雄及び20 mg/kg/日以上の群の雌で総ビリルビンは低値であった．20 mg/kg/日以上の群の雌で GGT はわずかに高値であった．これらの変化のほとんどは，13 週 間投与試験でもみられた変化であった．いずれも軽度であり関連する組織学的所見がないこ とから毒性学的意義が低い変化と判断した． 尿検査及び尿生化学的検査では，すべての投薬群で尿量，尿比重，グルコース排泄量（ク レアチニン補正，以下同様），カルシウム排泄量及びリン排泄量が高値であった．なお，クレ アチニン排泄量は100 mg/kg/日群では対照群よりも低値であった．また，20 mg/kg/日以上の 群の雄及び100 mg/kg/日群の雌ではケトン体が検出され，すべての投薬群の雄で pH が低か った．また，尿沈渣では，すべての投薬群の雄で三重リン酸結晶が少なく，100 mg/kg/日群 では不定形物が多かった．投薬群でみられたグルコース排泄量，尿比重及び尿量の増加につ いては薬理作用に起因した変化，各パラメータの排泄量の増加については尿量の増加に伴う 変化であると考えられる．尿のpH の低値及びケトン体の検出については，尿グルコース排 泄が過多な状況での絶食により脂肪の異化が生じた結果生じたものと推察される．更に，投 与24/25 週に pH 及び尿沈渣について対照群と 100 mg/kg/日群を用いて絶食と非絶食での比較 を行った．その結果，尿のpH，三重リン酸結晶及び不定形物について 100 mg/kg/日群では非 絶食群の方が高値であった． 器官重量ではすべての投薬群で腎重量が，100 mg/kg/日群で副腎重量が，100 mg/kg/日群の 雌では肝重量が高値であった．100 mg/kg/日群では胸腺重量が低値であった．剖検では，100 mg/kg/日群で副腎の腫大及び胸腺の小型化が観察された．100 mg/kg/日群の雄及び 20 mg/kg/ 日以上の群の雌では腎の退色が，20 mg/kg/日以上の群の雄及び 100 mg/kg/日群の雌では腎臓 の腫大と腎盂拡張が，100 mg/kg/日群の雌では腎盂結石が観察された．20 mg/kg/日以上の群 の雄では膀胱が，100 mg/kg/日群では尿管が拡張していた．病理組織学的検査では，すべて の投薬群で腺胃のびらんが認められた．胃のびらんについては，剖検前絶食との関連性が疑 われ，機序検討試験を実施したところ，投薬と剖検前の絶食が組み合わさることによりびら んが生じることが明らかとなったため［2.6.6.8.2.1］，毒性とは判断しなかった．すべての投 薬群の腎臓では尿細管の拡張が，100 mg/kg/日群では移行上皮の過形成が認められた．対照
群及び100 mg/kg/日群の尿管を観察したところ，100 mg/kg/日群では尿管が拡張した個体が認 められた．また，100 mg/kg/日群で胸腺の萎縮した個体が認められた．4 mg/kg/日群では膝関 節の極軽度の過骨症が散見され，20 mg/kg/日以上の群では膝関節及び胸骨の過骨症が認めら れた．これらの発現頻度は，膝関節では20 mg/kg/日以上の群で，胸骨については 100 mg/kg/ 日群で対照群よりも有意に多かった．骨の形態計測では100 mg/kg/日群の雄で骨梁量及び骨 梁数が多く，骨梁は薄く，骨梁間距離は低値であった．100 mg/kg/日群の雌では総皮質骨面 積が多く，総皮質骨も厚かった． 骨代謝に関連するマーカーを測定したところ，1,25(OH)2D，25(OH)D，カルシトニン，PTH， オステオカルシン，Ⅰ型コラーゲン架橋C-テロペプチド（以下，CTX）及び尿中 DPD/Cre がそれぞれ発現用量は異なるものの，投薬群で低値であった．骨密度測定では，100 mg/kg/ 日群を中心に大腿骨の骨面積及び骨塩量が低値であった．一方，骨密度に明らかな影響はな かったことから，これらの変化は，体重の増加抑制に伴う骨の成長抑制を示唆する変化と考 えられた．腰椎では4 mg/kg/日群及び 20 mg/kg/日群の雌では骨面積値が大きく，100 mg/kg/ 日群の雄では骨面積値が，雌では腰椎の骨塩量が低値であった．大腿骨の骨強度試験では， 100 mg/kg/日群で最大荷重及びエネルギーが対照群と比較して小さかった．骨強度に関して も体重の増加抑制に伴う骨の成長抑制を示唆する変化と考えられた．腰椎の圧縮試験ではエ ネルギーは投薬群で小さい傾向にあったが，終局強度（単位面積あたりの強度）は20 mg/kg/ 日以上の群の雄で強い傾向にあった． TK 測定の結果，雌雄ともに全身曝露量（Cmax及びAUC）は用量に応じて増加した．初回
投与（Day 0）と Day 90 及び Day 179 の曝露量比較では，雌の 4 mg/kg/日群の Cmaxのみでわ
ずかに高値であり，100 mg/kg/日の AUC が Day 90 及び D 179 では雌雄ともに低値であった． また，反復投与後では，雌の方が雄よりわずかに高い曝露が認められた．なお，反復投与後 のDay 179 時点のみ，2 種代謝物（M5 及び M7）についても曝露量を確認した．M5 及び M7 ともにカナグリフロジン水和物の投与量の増加に伴った曝露量の増加がみられた． 以上の結果より，無毒性量は雌雄とも4 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.3 イヌを用いた反復経口投与毒性試験 2.6.6.3.3.1 イヌを用いた 5 日間反復経口投与用量設定試験 ［資料番号：4.2.3.2-6（参考資料），試験番号：TOX7211］ 本試験はカナグリフロジンのイヌへの5 日間反復経口投与により発現する毒性を明らかに し，2 週間反復経口投与毒性試験の投与量を設定することを目的として実施した． ビーグル犬の雌雄各1 例に，カナグリフロジン水和物の 25，100，400 及び 800 mg/kg/日（無 水物として24.5，98.0，392 及び 784 mg/kg/日）を 5 日間反復経口投与した．対照群には 0.5% HPMC を投与した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，血液学的検査，血液生化学的検 査，尿検査，尿生化学的検査，剖検及び病理組織学的検査とした［2.6.7.6B］．
2.6.6 毒性試験の概要文 20 低血糖）したため瀕死期解剖を行った．投薬に起因した明らかな体重及び摂餌量の変化はみ られなかった．一般状態観察では，すべての投与例で嘔吐が，25 mg/kg/日の雌を除くすべて の投与例で便の異常（軟便，水様便，粘液便及び無便）が認められ，800 mg/kg/日投与の雌 では，活動性低下及び衰弱が認められた． 血液学的検査では，400 mg/kg/日投与の雌では白血球数及び分葉核好中球数が高値であり， 800 mg/kg/日投与の雌では赤血球系パラメータ，白血球数及び分葉核好中球数が高値であっ た．血液生化学的検査では，400 mg/kg/日以上の投与例ではグルコースが低値であり，400 mg/kg/日以上の雄及び 800 mg/kg/日投与の雌では，尿素窒素及びリンが高値であった．800 mg/kg/日投与の雌では総たん白，アルブミン，グロブリンの高値とクロールの低値も認めら れた．800 mg/kg/日投与の雌でみられた赤血球系パラメータ，総たん白，アルブミン及びグ ロブリンの高値は脱水状態によるものと推察された． 尿検査及び尿生化学的検査では，すべての投与例において薬理作用に起因したグルコース 排泄量及び尿量の高値に関連すると考えられる電解質，NAG，総たん白などの排泄量の高値 及びpH の低値が認められた．また，400 mg/kg/日以上の投与例では潜血反応が認められ，800 mg/kg/日投与の雌ではケトン体が検出された． 剖検では，投与例で肝臓の退色及び肥大が散見され，病理組織学的検査では肝細胞の空胞 化が認められる個体があった．また，400 mg/kg/日投与の雌では腎盂炎が認められた． 以上の結果に基づき，イヌを用いた 2 週間反復投与毒性試験の投与量は 4，40 及び 400 mg/kg/日に設定した． 2.6.6.3.3.2 イヌを用いた 2 週間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-7，試験番号：TOX7634］ ビーグル犬の雌雄各3 例に，カナグリフロジン水和物の 4，40 及び 400 mg/kg/日（無水物 として3.92，39.2 及び 392 mg/kg/日）を 2 週間反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，心電図検査，血液学的検 査（血液凝固検査含む），血液生化学的検査，尿検査，尿生化学的検査，器官重量，剖検及び 病理組織学的検査とした［2.6.7.7E］． いずれの投薬群においても死亡例は認められなかった．4 mg/kg/日以上の群の雌及び 400 mg/kg/日群の雄において，反復投与後の体重が低値であった．一般状態観察では，40 mg/kg/ 日以上の群において，嘔吐及び便の異常（軟便，水様便，粘液便，無便及び変色した便）が 認められた． 眼科的検査，心電図検査及び血液学的検査では，投薬に起因した変化は認められなかった． 血液生化学的検査ではすべての投薬群の雌でグルコースが低値であった． 尿生化学的検査では，すべての投薬群で尿量及びグルコース排泄量が高値であった．40 mg/kg/日以上の群の雄及び 400 mg/kg/日群の雌ではカルシウム排泄量が高値であった． 剖検では，400 mg/kg/日群の雌 1 例で体脂肪の減少が認められた．器官重量及び病理組織
学的検査では明らかな変化は認められなかった． 以上の結果より，投薬群で認められた変化はいずれも薬理作用に起因した変化又は組織学 的所見を伴わない軽微な変化であり，無毒性量は雌雄とも400 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.3.3 イヌを用いた 13 週間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-8，試験番号：TOX8214］ ビーグル犬の雌雄各3 例に，カナグリフロジン水和物の 4，30 及び 200/100 mg/kg/日（無 水物として3.92，29.4 及び 196/98.0 mg/kg/日）を 13 週間反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．なお，高用量群については，200 mg/kg/日の投与量で投与を開始したが， 一般状態の悪化が認められたため，雄についてはDay 9 に，雌については Day 8 に投与量を 100 mg/kg/日に変更した，対照群及び 200/100 mg/kg/日群については更に雌雄各 2 例を用いて， 4 週間の回復性試験を実施した．検査項目は，一般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，心電 図検査，血液学的検査（血液凝固検査含む），血液生化学的検査，尿検査，尿生化学的検査， 器官重量，剖検及び病理組織学的検査とした［2.6.7.7F］． いずれの投薬群においても死亡例はなかった．投与終了時の体重は対照群の雌では投与開 始時よりも高値であったが，200/100 mg/kg/日の雌では低値であった．200/100 mg/kg/日群の 雄では，200 mg/kg/日投与時には摂餌量が対照群よりも低値であったが，投与量を 100 mg/kg/ 日に減じて以降は対照群と同等の摂餌量となった． 一般状態観察では，30 mg/kg/日以上の群において粘液便，嘔吐，流涎などの症状の頻度及 び程度が増加した．また，200/100 mg/kg/日群では，200 mg/kg/日投与時にはこれらの症状に 加えて活動性低下，脱水，血便，紅斑などの症状が認められたが，投与量を100 mg/kg/日に 減じて以降これらの症状はほぼ認められなくなった． 眼科的検査及び心電図検査では，投薬に起因した変化は認められなかった． 血液学的検査では，30 mg/kg/日以上の群の雌で白血球数，好中球数及びフィブリノゲンが 高値であった．血液生化学的検査では，200/100 mg/kg/日群の雌で AST 及び尿素窒素が高値 を示し，30 mg/kg/日以上の群の雄及びすべての投薬群の雌でグルコースが低値であった． 尿検査及び尿生化学的検査では，すべての投薬群で尿量，並びにグルコース，カルシウム 及びGGT の排泄量（総量及びクレアチニン補正値），NAG 排泄量（総量）及びナトリウム排 泄量（総量）が高値であった．これらに加えて，30 mg/kg/日以上の群ではクロール排泄量（総 量）及びリン排泄量（総量）の高値，200/100 mg/kg/日群ではたん白排泄量（総量及びクレア チニン補正値），ナトリウム排泄量（クレアチニン補正値）及びクロール排泄量（クレアチニ ン補正値）が高値であった． 200/100 mg/kg/日群については，200 mg/kg/日の最終投与翌日（雄：Day 9，雌：Day 8）に 血液学的検査（血液凝固検査含まず）及び血液生化学的検査を実施した．投与前値と比較し て雌で赤血球数，ヘモグロビン濃度及びヘマトクリット値が低値であり，雌雄で網状赤血球
2.6.6 毒性試験の概要文 22 総ビリルビン及び尿素窒素の高値，並びにグルコースの低値が認められた．雌雄でクレアチ ニンの高値及びカルシウムの低値がみられた． 器官重量では，200/100 mg/kg/日群で腎重量が高値であった．剖検では，いずれの投薬群に おいても明らかな変化はなかった．病理組織学的検査では，腎尿細管の再生／変性像及び尿 細管の拡張が散見されたが，これらの変化が明らかであったのは 200/100 mg/kg/日群であっ た． 4 週間の回復期間中に 200/100 mg/kg/日群の体重は回復を示し，また，投薬終了時に認めら れたいずれの変化も回復期間終了時には認められなかった． 以上の結果より，30 mg/kg/日群で認められた変化はいずれも薬理作用に起因した変化又は 組織学的所見を伴わない軽微な変化であり，無毒性量は雌雄とも30 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.3.3.4 イヌを用いた 12 ヶ月間反復経口投与毒性試験 ［資料番号：4.2.3.2-9，試験番号：TOX8446］ ビーグル犬の雌雄各4 例に，カナグリフロジン水和物の 4，30 及び 100 mg/kg/日（無水物 換算）を12 ヶ月反復経口投与した．対照群には 0.5％ HPMC を投与した．検査項目は，一 般状態，体重，摂餌量，眼科的検査，心電図検査，血液学的検査（血液凝固検査含む），血液 生化学的検査，尿検査（尿生化学的検査含む），骨代謝関連マーカー測定，器官重量，剖検， 病理組織学的検査（骨形態計測含む），骨密度測定及び骨強度測定を行った．また，初回投与 日（Day 0），Week 26 及び Week 52 に TK 測定を実施した［2.6.7.7G］．
いずれの投薬群においても死亡例はなかった．なお，4 mg/kg/日群の雄 1 例（動物番号 2112） について，痙攣などの中枢神経症状を示したため，人道的見地から安楽殺した．本例は病理 学的検査の結果，肉芽腫性髄膜脳脊髄炎と診断され，低用量の1 例のみで認められたことか ら自然発生疾患と判断した．すべての投薬群の雄で体重が対照群と比較して低値であった． すべての投薬群で便の異常（無形便，水様便及び粘液便）が認められ，嘔吐や削痩が認めら れる個体もあった． 眼科的検査，心電図検査及び血液学的検査では，投薬に起因した変化は認められなかった． 血液生化学的検査では，すべての投薬群の雌でグルコースが低値，100 mg/kg/日群でトリ グリセリドが高値及びカリウムが低値，100 mg/kg/日群の雌で ALP が高値であった． 尿検査では，すべての投薬群で尿量及びグルコース総排泄量が高値であった．また，GGT， NAG，カルシウム，クロール，リン，カリウム及びナトリウム総排泄量の高値を示したが， 尿量の増加に伴う変化と考えられた．クレアチニン補正値では，雌の30 mg/kg/日以上の群で ナトリウム，100 mg/kg/日群で GGT が高値であった．なお，Week 26 では雌の 30 mg/kg/日以 上の群でGGT，NAG 及びカルシウムが高値であった． 骨代謝関連マーカーの測定では，30 mg/kg/日以上の群の雄及びすべての投薬群の雌におい て，Week 17 の血清 1,25(OH)2D が低値であり，すべての投薬群の尿中 DPD/Cre も低値であ ったが，これらの変動幅は当該試験実施施設の背景データ範囲内であること，また，投与52
週では，当該項目に統計学的に有意な変動は認められなかったことから，これらの変動は一 過性の変化であると判断した．また，Week 52 では，100 mg/kg/日群の雌で骨型アルカリホス ファターゼ（以下，BAP）が高値であったが，同じく骨形成マーカーであるオステオカルシ ンには変動はみられなかった．大腿骨骨密度の測定では，すべての投薬群の雄で骨密度が低 値であったが，骨強度測定及び骨形態計測では差は認められず，骨密度の変化は用量相関性 に乏しい軽微な変動であることから毒性学的に意義が低い変化と判断した．なお，雌では骨 密度測定，骨強度測定及び骨形態計測に差は認められなかった． 器官重量，剖検及び病理組織学的検査では，投薬に起因する変化は認められなかった． TK 測定の結果，雌雄ともに全身曝露量（Cmax及びAUC）は用量に応じて増加した．初回
投与（Day 0）と Week 52 の曝露量比較では，Cmaxでは総じて反復投与後の値は初回投与時の
値と同等かやや増加する傾向が認められた．AUC では，雌雄の 30 mg/kg/日群と雌の 100 mg/kg/日群でのみ曝露量が低下する傾向が認められた．反復投与後の曝露量に雌雄間で明確 な差は認められなかった．なお，最高用量の100mg/kg/day 群でのみ，2 種代謝物（M5 及び M7）についても曝露量を確認した．M5 及び M7 ともにカナグリフロジン水和物の投与量の 増加に伴った曝露量の増加がみられた． 以上の結果より，本試験で得られた所見はいずれも薬理作用に関連した変化，若しくは毒 性学的意義の低い変化と考えられたことから，無毒性量は100 mg/kg/日と結論した． 2.6.6.4 遺伝毒性試験 2.6.6.4.1 In vitro 遺伝毒性試験 2.6.6.4.1.1 細菌を用いた復帰突然変異試験 ［資料番号：4.2.3.3.1-1，試験番号：TOX7701］ ネズミチフス菌（TA1535，TA1537，TA98，TA100）及び大腸菌（WP2uvrA）を用い，ラッ ト肝 S9 mix の存在下及び非存在下でカナグリフロジン水和物の遺伝子突然変異誘発性を評 価した［試験1 回目及び 2 回目：10～2500 μg/plate（無水物換算）］［2.6.7.8A］． その結果，カナグリフロジンはいずれの条件下においても復帰変異コロニー数を増加させ なかった．したがって，カナグリフロジンは本試験条件下において細菌に対して遺伝子突然 変異を誘発しないと結論した． 2.6.6.4.1.2 マウスリンフォーマアッセイ ［資料番号：4.2.3.3.1-2，試験番号：TOX7703］ マウスリンフォーマL5178Y/tk+/- 細胞にカナグリフロジン水和物をラット肝 S9 mix 存在下
2.6.6 毒性試験の概要文 24 3 時間処理のラット肝 S9 mix 非存在下では 2.0～60 μg/mL（無水物換算），ラット肝 S9 mix 存在下では10～60 μg/mL（1 回目）及び 10～50 μg/mL（2 回目），24 時間処理では 2.0～40 μg/mL （1 回目）及び 1.0～20 μg/mL（2 回目）の濃度範囲で評価した． その結果，ラット肝S9 mix 存在下の 3 時間処理において，濃度依存的な変異コロニーの増 加がみられたが，被験物質が析出する濃度のみの変化であった．ラット肝S9 mix 非存在下の 3 及び 24 時間処理では変異コロニーの増加はみられなかった．したがって，カナグリフロジ ン水和物は本試験において代謝活性化条件下の析出濃度において陽性反応を誘発した． 2.6.6.4.2 In vivo 遺伝毒性試験 2.6.6.4.2.1 ラット骨髄細胞を用いた in vivo 小核試験 ［資料番号：4.2.3.3.2-1，試験番号：TOX7740］ SD ラットの雌雄各 5 例に，カナグリフロジン水和物を 500，1000 及び 2000 mg/kg（無水 物として490，979，1959 mg/kg）単回経口投与し，投与後 24 及び 48 時間後に骨髄塗抹標本 を作製して幼若赤血球における小核の有無を評価した．媒体対照群には0.5％ HPMC を投与 した［2.6.7.9A］． その結果，いずれの投与量においても小核を有する幼若赤血球の数を増加させなかった． したがって，カナグリフロジン水和物は本試験条件下でラット骨髄において小核を誘発しな いと結論した． 2.6.6.4.2.2 ラット肝細胞を用いた in vivo コメットアッセイ ［資料番号：4.2.3.3.2-2，試験番号：TOX7978］ ラットの肝細胞を用いてカナグリフロジン水和物のin vivo における DNA 損傷誘発性を評 価した［2.6.7.9B］． SD 系ラットの雌雄各 5 例に，カナグリフロジン水和物を 500，1000 及び 2000 mg/kg（無 水物として490，979，1959 mg/kg）の投与量で単回経口投与し，投与 3 及び 24 時間後に肝 細胞を採取して，DNA 鎖切断（% Tail intensity）を測定した．媒体対照群には 0.5％ HPMC を投与した［2.6.7.9B］．
その結果，雄ラットにおいては2000 mg/kg 群の投与 3 時間後，雌においては 500 mg/kg 群 の投与24 時間後において統計学的に有意な% Tail intensity の増加がみられたが，いずれも背 景データの範囲内であった．したがって，カナグリフロジン水和物は本試験条件下でラット 肝細胞においてDNA 損傷を誘発しないと結論した．
2.6.6.5 がん原性試験 2.6.6.5.1 長期がん原性試験 2.6.6.5.1.1 マウスを用いた 2 年間反復経口投与がん原性試験 ［資料番号：4.2.3.4.1-1，試験番号：TOX8799］ ICR マウスの雌雄各 64～66 例に，カナグリフロジン水和物の 10，30 及び 100 mg/kg/日（無 水物換算）を2 年間反復経口投与した．対照群には，0.5% HPMC を投与した．投与量は，マ ウスを用いた13 週間反復投与試験［2.6.6.3.1.2］において300 mg/kg/日群で死亡例が認めら れたことから，100 mg/kg/日を高用量に設定した．検査項目は，生存率，一般状態，腫瘤所 見，体重，摂餌量，眼科的検査，血液生化学的検査，器官重量，剖検及び病理組織学的検査 とした．カナグリフロジンについて初回投与日（Day 0）及び Day 181 に，カナグリフロジン のグルクロン酸抱合体であるM5 及び M7 については Day 181 にそれぞれ TK 測定を実施し た［2.6.7.10A］． 生存率，体重，腫瘤所見，眼科的検査，血液生化学的検査及び器官重量については，いず れの投薬群においても変化は認められず，一般状態観察では100 mg/kg/日群の雄で腹部膨満 が認められた．30 及び 100 mg/kg/日群の雄及びすべての投薬群の雌では摂餌量が高値であっ た． 剖検及び病理組織学的検査では，投薬に起因すると考えられる腫瘍の発生及び統計学的に 有意な腫瘍発現頻度の増加は認められなかった． 非腫瘍性変化として，剖検ではすべての投薬群の雄で腎臓の腎盂拡張，並びに尿による尿 管及び膀胱の拡張が認められ，尿道（陰茎骨内）に閉塞が生じ，尿による尿管拡張，膀胱拡 張が生じたことが示唆された．閉塞性の尿路拡張は，マウス特有の自然発生性病変［1］［2］ であり，投薬により発現頻度が増加したものと考えられた．病理組織学的検査では，剖検で みられた尿路拡張に関連して水腎症，尿管及び膀胱の拡張が認められたほか，尿管の拡張が みられた多くの個体では，陰茎及び周辺組織に細菌塊が認められた． TK 測定の結果，雌雄ともにカナグリフロジンの全身曝露量（Cmax及びAUC）は用量に応 じて増加した．また，反復投与後のDay 181 時点のみで測定した 2 種代謝物（M5 及び M7） については，100 mg/kg/日群の雌の M7 の Cmaxを除き，カナグリフロジンの投与量増加に伴 った曝露量の増加を確認した．カナグリフロジンの曝露量をDay 0 と Day 181 で比較した場 合，雌雄の10 mg/kg/日群ではわずかに増加傾向，雄の 100 mg/kg/日群ではわずかに低下傾向 を認めたが，それ以外の群では反復投与による明確な曝露量の変化はなかった．反復投与後 のAUC を雌雄間で比較すると，カナグリフロジン及び 2 種の代謝物は雌の方が雄より高値 であった． 以上の結果より，カナグリフロジン水和物はマウスにおいてがん原性を示さないと結論し た．
